Summary
הדור של מודל עכברים orthotopic של מזותליומה pleural הממארת על ידי השתלה של תאי II-45 מזותליומה לתוך חלל pleural של חולדות המוסמכות חיסוניים מוצג. שיטת cytometric זרימה לנתח שבע תת תא חיסון בבעלי החיים אלה מדגימת דם 25 μl גם מתוארת.
Abstract
התגברות העצומה של עניין בטיפולים מבוסס חיסון לסרטן כגון חיסונים ומעכבי מחסום חיסוניים, והבנה מוגברת של התפקיד של מייקרו-הסביבה של הגידול בתגובה לטיפול, באופן קולקטיבי מצביעה על הצורך במודלים orthotopic חיסון מוסמך לבדיקות פרה-קליניות טיפולים החדשים אלה. מסמך זה מדגים כיצד להקים מודל חולדה חיסון מוסמך orthotopic של מזותליומה pleural הממארת. התקדמות מחלה ניטור בדגמי orthotopic מסכלת את המיקום הפנימי של הגידולים. לlongitudinally לעקוב אחר התקדמות מחלה והשפעתה על מחזור תאים חיסוניים בזה ומודלים של עכברים אחרים של סרטן, צינור יחיד cytometry זרימת assay דורש רק 25 μl כל הדם מתואר. זה מספק כימות מדויק של שבעה פרמטרים חיסוניים: ימפוציטים מוחלט, מונוציטים ונויטרופילים, כמו גם תת-T תאי CD4 ו CD8, B-תאים ותאים קטלניים. צוללות שונותETS של פרמטרים אלה הם שימושיים בנסיבות ובדגמים שונים, עם נויטרופילים יחס הלימפוציטים שיש התועלת הגדולה ביותר לניטור התקדמות מחלה במודל מזותליומה. ניתוח במחזור רמות תא חיסון בשיטת צינור יחיד זה גם יכול לסייע בניטור התגובה לטיפולים מבוסס חיסון והבנת המנגנונים שבבסיס המוביל להצלחה או כישלון של טיפול.
Introduction
מזותליומה ממאירה (MM) היא גידול ממאיר אגרסיווי שנובע מהתאים הפכו בקרום (mesothelium) שקווי הריאות וחללים בטן, לב ואיברי רבייה פנימי, והוא הגידול הראשוני הנפוץ ביותר של חלל הריאות או 1,2 הצדר . חשיפה לסיבי אזבסט מהווה 80% מכל MM, ותוך איסור על שימוש אזבסט הוכנסו לפני עשרות שנים ברוב מדינות מערב, השימוש הנרחב שלה בקהילה השאיר מורשת קטלנית. ארגון הבריאות העולמית מעריך כי 107,000 אנשים ברחבי העולם מת מדי שנה ממחלות הקשורות לאזבסט, עם שיעורי תמותה ממשיכים להגדיל. גל שכיחות שאינה בעיסוק חדש הוא גם מתעורר ויש הבנה קטנה של מתי, ובאיזו רמה זה יהיה שיא 3.
רוב האנשים עם MM מאובחנים מאוחר כאשר כימותרפיה מערכתית מייצגת את אחד מאפשרויות קיימא רק 4. רוב effectiיש כימותרפיה ו'טיפול סטנדרטי 'הנוכחי (pemetrexed יחד עם ציספלטין 5) זוהה לפני מעל 10 שנים. עם זאת כישלון של טיפול זה הוא בלתי נמנע ואין אפשרויות מוכחות שני קו, עוזבים חולים עם פרוגנוזה עגומה וחציון הישרדות של 12 חודשים בלבד 2. לכן, יש צורך מסופק דחוף לטיפולים יעילים יותר. למרות הבדיקה של מספר הטיפולים חדשניים בניסויים קליניים אף אחד מהם הביא לשינויים בפרקטיקה. זה נובע בחלקו (5%) ההעברה הנמוכה של תוצאות פרה-קליניות, מבוצעת בדרך כלל בדגמי עכבר xenograft, להגדרה הקלינית 6-8. מודלים כאלה בנאמנות לא לשחזר את ההיבטים המורכבים של מייקרו-הסביבה של הגידול המתרחש במקומות שאינם פיסיולוגיים, לעתים קרובות בהעדר מערכת חיסונית מתפקדת 9.
דגמי orthotopic syngeneic ליצור סביבת גידול משמעותי יותר מציאותית מגommonly השתמש במודלי xenograft תת עורית כגידולים להתרחש במיקום הפיזיולוגי הנכון עם 10,11 מערכת חיסוני בשלמותה. הגודל הגדול יותר של העכברוש משפר את השימוש בו כמודל מחלה מכרסם, במיוחד במחקרי סמים שבו דם סידורי שואב נדרשים כדי להעריך את התגובה לטיפול ורעילות 12. יתר על כן, בדגמים שבי ניטור התקדמות מחלה קשה בשל המיקום של הגידולים (כגון בחלל פלאורלי), את היכולת לעקוב אחר התקדמות מחלה באמצעות גורמים הנמצאים במחזור הוא מאוד אטרקטיבי. הדור של מודל orthotopic syngeneic של מזותליומה pleural באמצעות חולדות חיסון מוסמכת מתואר. בנוסף, שיטה קלה ויחסית לא פולשנית לניטור התקדמות המחלה pleural על ידי מדידת תאים חיסוניים במחזור מתואר גם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הנהלים הקשורים בעלי חיים בוצעו בהתאם להמלצות בקוד האוסטרלי עיסוק לטיפול והשימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות. הפרוטוקול עבור מחקר זה אושר על ידי הוועדה בבית החולים הטיפול בבעלי חיים ואתיקה המלכותית החוף הצפוני. נקבה פישר 344 חולדות (F344, 150-200 גר ') נשמרו במתקן קירנס, Kolling מכון בתנאים סטנדרטיים (שעות אור 12 / מחזורים כהים וגישה חופשית למזון ומים).
הערה: תרשים זרימה לכל הפרוצדורות מוצג באיור 1.
1. הכנת תאים להשתלה
- קו תרבות מזותליומה העכברוש השני-45 תאים (הידוע גם בIL-45; שהופק על ידי הקדמת הצפק של אזבסט crocidolite) בRPMI 1640 תקשורת (RPMI) בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS) ולגדול בתנאים סטנדרטיים (37 ° חממת humidified C עם 5% CO 2). Maintaבידי passaging ותת-culturing בכ 01:50 פעמיים בשבוע בבקבוק 2 75 סנטימטר.
- הכן ריאגנטים לתרבית תאים וaliquots החם על 37 מעלות צלזיוס. ריאגנטים נדרשים כוללים תקשורת בסרום חופשית RPMI (SFM), RPMI עם 10% FBS, בופר פוספט (PBS) ושל 0.5% טריפסין- EDTA.
- תרבות תאים להשתלה למפגש כ 70-80%. זה מבטיח שהם נמצאים בשלב הצמיחה ליניארית.
- קציר תאים על ידי השלכת התקשורת, שטיפת פעם אחת עם 5 מיליליטר של PBS סטרילי ולאחר מכן הוספת 3 מיליליטר של 0.5% טריפסין-EDTA.
- חזור צלוחיות לחממה לכ 5 דקות עד שכל התאים הפכו לא חסיד.
- ברגע שהתאים שאינם חסיד, להוסיף 3 מיליליטר של RPMI עם 10% FBS כדי להשבית טריפסין. לאסוף ותאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 3 דקות.
- שטוף את התא גלולה ב 10 מיליליטר של SFM ו צנטריפוגות שוב ב XG 300 במשך 3 דקות.
- תא גלולה לשטוף שוב עם 10 מיליליטר של SFM ו צנטריפוגות כאמור לעיל.
- Resuspend תאי 10 מיליליטר של SFM ולבצע ספירת תאים באמצעות hemocytometer או מכשור דומה.
- לדלל תאים כך ש100 μl מכיל את כמות התאים להיות מושתל.
הערה: גידול הודגם במינון נמוך כמו ב100 μl 100 תאים אך מינון סטנדרטי הוא 500,000 תאים ב100 μl. - הכן מספיק תאים בתקשורת למספר החולדות להיות מושתל (כלומר, 100 μl / חולדה), בתוספת לפחות 0.5 מיליליטר נוסף כדי לפצות על הפסדים מיחולו והנפח המת של המחט.
- הכן SFM מספיק (ללא תאים) שמושתל לתוך חולדות שליטה (כלומר, 100 μl / חולדה), בתוספת לפחות 0.5 מיליליטר נוסף.
הערה: התאים וSFM מוכנים כעת להשתלה. הם צריכים להיות כל הזמן על 37 מעלות צלזיוס ומושתלים בתוך 2 שעות של קציר כדי לשמור על יכולת קיום.
2. השרשה בvivo של תאים
- מניחים את החולדה F344 (> 13 שבועות של גיל) לתוך תא האינדוקציה ולהרדים באמצעות 1.4% שאיפת isoflurane (או השיטה בשימוש במתקן). ברגע שהעכברוש נראה מהלכו ישן מהתא לחרטום (עם isoflurane 1.4% זורם), מניח אותו על הגב שלה עם חזה פונה כלפי מעלה (תצוגת הגחון). הדבר זה מאפשר לאיברים הפנימיים להתיישב הרחק מחלל החזה. בדקו את הרפלקסים על פי פרוטוקולים מוסדיים כדי להבטיח את העכברוש הוא בהרדמה מלאה.
- לגלח את האזור הנכון costalis Regio (חזה) כדי להסיר את הפרווה.
- נקה את האזור המגולח עם 80% אתנול V / V.
- זהה את אתר ההזרקה: בצד ימין, למצוא את הבלוטה 2 החל גולגולת. אתר ההזרקה הוא 0.5 סנטימטר הפרוקסימלי לזה, בין ה -3 והצלעות 4 מקצה הזנב של כלוב הצלעות. (איור 2 א).
- לערבב בעדינות II-45 תאים לresuspend. לאט לאט למשוך את ההשעיה התא (או SFM לחולדות שליטה) ל1 מיליליטר ו# 160; מזרק ללא מחט מחוברת. אם מחט מחוברת לציור של תאים יש פוטנציאל לתאים לגדול לאורך קו הזרקת מחט. צרף 23G x 1¼ מחט. ראש המחט ולהסיר את כל בועות אוויר.
- ברגע שהמזרק והמחט דרוכים, מקום 20 מ"מ ארוך וspacer קוטר 5 מ"מ מעל פיר המחט. זה משמש כדי למנוע את המחט לחדור עמוק מדי לתוך חלל פלאורלי במהלך ההזרקה. כ 5 מ"מ 12 מ"מ של מחט חשופה מספיק לחדירה דרך הצלעות מבלי לפגוע בכל איברים.
- לאט לאט להכניס את המחט בין הצלעות, לצייר את הבוכנה כדי להבטיח כלי דם לא ניקבו (לא דם אמור להופיע במזרק) אז להזריק 100 תאי μl או SFM. (איור 2).
- הסר את המחט בעדינות לגלגל את העכברוש מצד לצד כדי להפיץ תאים בחלל החזה.
- מניחים את החולדה לכלוב ולבדוק להתאוששות. העכברוש דואר צריך להיות ער בתוך דקות 1 ומתחיל לנוע.
- חזור על פעולה עבור כל חולדה באמצעות מחט חדשה. שימוש חוזר באותו המחט יגרום צמיחת תאים לאורך קו ההזרקה של המחט.
- צג רווחתם של בעלי החיים מדי יום.
- להרדים בעלי חיים בנקודתי קצה מוגדרים מבחינה אתית כנשלט על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים המוסדית. נקודות הקצה האתיות לחולדות בניסויים אלה היו ירידה במשקל של יותר מ -10% או נשימה מאומצת.
3. זנב וריד דם אוסף
- אם הדם הוא שייגבה מייד השתלת הודעה תא, לשמור על העכברוש הרדים. אם דגימת דם בנקודת זמן אחרת, להרדים את העכברוש באמצעות 1.4% שאיפת isoflurane. בדקו את הרפלקסים על פי פרוטוקולים מוסדיים כדי להבטיח את החולדה מורדמת באופן מלא.
- מניחים את החולדה על הצד שלה ולאתר וריד זנב לרוחב.
- לעקר את הזנב עם 80% אתנול ולתייג ג 0.5 מיליליטר EDTAצינור ollection.
- לאסוף דם, תמיד להתחיל בסוף הזנב של הזנב (כשליש מהדרך לאורך). זה מאפשר ניסיונות נוספים קרוב יותר לסוף הגולגולת של הזנב במקרה הניסיון הראשון נכשל. לא לדגום מחדש caudally כמו זה יכול לגרום קריש דם.
- מקם מקביל 23G x 1¼ מחט לווריד לרוחב והחלק אותו לווריד בזווית רדודה כל כך שהיא חודרת כ 10 מ"מ (איור 3 א).
- הערה: אם הווריד כבר ניקב בהצלחה הדם יהיה גלוי בסוף הקובץ המצורף של המחט (איור 3).
- טיפת דם תהווה על הזנב באתר של ניקור המחט. לאסוף את הדם הזה בעזרת פיפטה והעברה ל0.5 מיליליטר שכותרתו (או קטן יותר) צינור איסוף EDTA. לμl 25 assay תא החיסון מספיק. החל גזה עם לחץ לנקב אתר עד שדימום ייפסק.
- קפיצי צינור הדם לערבב הדם וEDTA ל- PRקרישת אירוע. שמור את הזמן בין איסוף דם וערבוב עם EDTA הקצר ככל האפשר כדי למנוע קרישה.
- בעת איסוף דם מדגימות EDTA-דם חנות חולדות מרובות במעמד ב RT עד ניתוח. דם תהליך בתוך 2 שעות של אוסף.
לדוגמא הכנה 4. לפרופיל תא חיסון בשיטה מבוססת ביד
הערה: שיטת פלטפורמה אחת זה מסתמכת על שימוש בצינורות ספירה מוחלטים זמינים מסחרי שיש להם מספר ידוע של חרוזים לכל דגימה. צינורות אלה מכילים כדורי lyophilized שלפזר במהלך הכנת מדגם, משחררים את החרוזים. חרוזים שכותרתו fluorescently ועל ידי gating על אוכלוסיית חרוז, ניתן לחשב ספירה מוחלטת.
- ודא המדגם כולו דם EDTA הוא גם מעורב על ידי הצבתו במיקסר סיבובי איטי במשך כמה דקות. תווית צינור ספירה מוחלטת אחד לכל דגימה. גלולה המכילה את החרוזים צריכה להיות גלויה מתחת tהוא בעל חרוז מתכת בחלק התחתון של הצינור.
- העבר את 25 μl של כל דם EDTA לתוך צינור ספירה מוחלט שכותרת. גלולה חרוז תתמוסס על תוספת של הדם.
- לכל צינור להוסיף 20 μl של קוקטייל T / B / Killer תא טבעי (NK) אנטי-חולדה, 10 μl של אנטי-עכברוש CD8a PE, 10 μl של אנטי-עכברוש CD4 (תחום 1) FITC ו -10 μl של אנטי-עכברוש CD45 PE / Cy7 (איור 4 א). Fluorophores מוגדרת בטבלה 1.
- צנטריפוגה בקצרה הצינור (300 XG) על מנת להבטיח את הנוגדנים ותאים נמצאים בחלק התחתון של הצינור ולא נדבקו לצד של הצינור. מערבולת לערבב דגירה במשך 15 דקות ב RT.
- לlyse תאי דם אדומים להוסיף 400 μl של 10 מ"מ טריס, 0.15 מ 'חיץ אמוניום כלוריד (pH 7.5) ומערבולת לערבב. תמוגה הושלמה כאשר המדגם מופיע (4B דמויות ו- C) שקופים ולא מעונן. אי lyse המדגם לחלוטין יוביל להגדלהרקע ד ושקר מורם ספירה בעת ניתוח על ידי cytometry זרימה.
5. זרימה Cytometric עיבוד של דוגמאות
הערה: בצע בצבע 4 cytometer זרימה.
- פתח את התוכנה במצב רכישה ותבנית חדשה עם 8 מגרשים כמתואר באיור 5.
- התאם את הגדרות מכשיר לאלה המופיעים בטבלה 1 ולהגדיר את השער R1 (FITC [FL-1] לעומת APC [FL-4]), איור 5Ai) לספור את חרוזי הניאון. השערים האחרים אינם חשובים כמו בשלב רכישה זו, אך יידרשו לניתוח. חרוזים הספירה מוחלטים שימוש בפרוטוקול זה מכילים צבעי ניאון וניתן לאתר בכל ערוץ אף הם החלשים ביותר בערוץ הכחול.
- באמצעות דגימת דם שליטה מוכנה, מערבולת ולאחר מכן לטעון על cytometer ולהפעיל במהירות נמוכה (μl 12 / min) על התקנת מצב כל כך יכולים להיות מותאמים שערי רכישת נתונים.
- הגדר את הרכישה ללאסוף 10,000 אירועים בשער חרוז R1.
- הגדרת תיקייה להקליט נתונים ולהגדיר מספר קובץ וקובץ מדגם תווית בתפריט רכישה.
- טען את המדגם כדי להיות מנותח על cytometer ולהגדיר את קצב הזרימה עד בינוני (35 μl / min). הפעל כל מדגם באותו קצב הזרימה. קצב הזרימה ייתכן שיצטרך להיות מגוון לנמוך (μl 12 / min) או גבוה (60 μl / min), אבל בינוני הוא בדרך כלל מתאים. בקצב הזה זה לוקח בערך 90 עד 120 שניות לרכוש 10,000 אירועי חרוז לכל דגימה.
- לאחר המדגם נטען לצפות מגרשי הפיזור לעשות אירועים בטוחים מופיעים בשער חרוז R1. בתחילה יכולה להיות כמה חוסר יציבות בלחץ מדגם גרימת להיסחף במגרשי הפיזור. חכה לזה כדי לייצב.
- ברגע שהתייצב, לחץ על לרכוש ולאפשר מדגם לרוץ. ברגע שcytometer סיים רכישת 10,000 אירועי חרוז בR1 cytometer יפסיק לרכוש ולשמור את כל הנתונים.
- הסר את המדגם וזורקים לזרום ט"ולהיות. Cytometer מוכן למדגם הבא עכשיו. להפעיל את כל הדגימות ולאחר מכן להמשיך למצב ניתוח.
6. ניתוח תא חיסון
הערה: אסטרטגיות gating והאלגברה בוליאנית משמשות להגדיר כל אוכלוסיית תא. אלגברה בוליאנית היא שיטת ניתוח היגיון מבוססת המאפשרת לפעולות מרובות בהגדרה אחת. תוכנת ניתוח cytometer הזרימה (למשל, BD CellQuest) מאפשרת לשימוש באלגברה בוליאנית. המשוואות משמשות לחשבון פעיל לתגובתיות השלילית המשמעותית המסייעת בהגדרת התא לזהות כל אוכלוסיית תאים ספציפי יותר. "האזורים" משמשים להגדרה "שער". אזורים להגדיר ממדי מרחב 2 ואילו יכולים להיות מורכבים שערים של אזורים רבים המחוברים על ידי מפעילים אלגברית (+, *, -, מוגדר בטבלה 2).
- לעבור את התוכנה למצב ניתוח. תבנית ניתוח צריך להיות שנוצרה כדי להתאים
- לנתח כל קובץ בודד (כלומר, כל דגימה בודדת) בנפרד. שערי הגדר R1 עד R9 ולאחר מכן הקימו את האלגוריתמים לכל סוג תא כהגדרתו בטבלה 2 (גם מוצגים באיור 5).
- השתמש בדלפק סטטיסטיקת התא לחשב אוכלוסיות תאים בודדות שהוגדרו על ידי שערים ואלגוריתמים (לוח 2 ואיור 5). האלגוריתמים יתאימו מספרים סלולריים באופן אוטומטי בדלפק סטטיסטיקת תא.
- לחשב תת תא באמצעות המשוואה הבאה:
הערה: מספר אירועי תא נספרו (למשל, אירועי תאי CD4 T) הוא מנויים באמצעות המשוואה לעיל כדי לתת תא מספר לμl דם. דוגמאות לכך הן שמוצגים באיור 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השיטה הנהוגה במאמר זה לדור של מודל orthotopic של מזותליומה pleural באמצעות השני-45 תאים הביאה חיות נכנעו למזותליומה בזמן שחזור והמהיר, ללא חולדות מתות בשל שיטת ההשתלה. כותרות של מספר התאים המושתלים קבעו כי 1x 10 3 תאים היו המספר המינימאלי הנדרש למודל penetrant מלא (engraftment 100%). המספר שונה של תאים מושתלים בחולדות שינה את מהלך המחלה הזמן מבלי להיראות להשפיע על חומרת המחלה. בעלי חיים שקיבלו 1 x 10 3, 1 x 10 4 ו 5 x 10 5 תאים הגיעו נקודות קצה מוגדרות מבחינה אתית ביום 40, 30 ויום 20 בהתאמה (איור 6).
דם נאסף מחולדות כ פעמיים בשבוע ללא סיבוכים שנצפו קשור לאוסף. חשוב לציין כי לא יותר מ -10% מכלל נפח הדם (אוכ 2 מיליליטר) יש לאסוף בתקופה 2 בשבוע. Assay תזרים cytometric ששילב אסטרטגיות gating והאלגברה בוליאנית הוקמה כדי לזהות לימפוציטים, מונוציטים ונויטרופילים ותת הלימפוציטים T, T מסוג CD4, CD8 T, תאי B וNK. הממוצע והטווח לכל סוג תא הוקם באמצעות חולדות ביקורת (n = 5) והושווה לממוצע והטווח של II-45 חולדות מושתלות בנקודתי קצה (טבלה 3). ערכי Endpoint הושוו ראשון כדי לקבוע אם הבדלים קיימים בספירת תאים חיסונית בין בעלי חיים הבריאים וחולים. בהשוואה לחולדות שליטה בריאה, לימפוציטים מוחלט, תאי CD4 T, לימפוציטים מסוג B ותאי NK הירידה בII-45 חולדות מושתלות בנקודת הסיום ואילו מונוציטים, נויטרופילים ונויטרופילים יחס הלימפוציטים (NLR) עלו.
כדי לקבוע אם פרמטרים אלה תא חיסוניים השתנו גם עם התקדמות מחלה, ולכן יכולים לשמש כסמנים פונדקאיות F או ניטור מחלה, דגימות אורך היו גם בהשוואה (איור 7). פרמטר האורך אינפורמטיבי ביותר היה NLR עם עליות זוהו עד 7 ימים לפני נקודות קצה אתיות (איור 7 א). לחולדות עם תאי מינון גבוהים, NLRs הגבוה התגלו בין יום 7 ויום 12 לאחר השתלה, ואילו לחולדות עם תאים במינון נמוכים, NLR החל להגדיל בין היום 18 ו22. ספירת הלימפוציטים סה"כ ירד עם התקדמות מחלה בחולדות עם מודל כבר זמן מחלה כמובן (במינון נמוך של תאים: 1 x10 4, איור 7). ירידה זו לא הייתה ברורה בחולדות עם כמובן זמן מהיר (מינון גבוה תא: 5 x10 5). מונוציטים נשארו ברמות נורמליות עד אוסף המסוף כאשר מוגברת גס ספירה היו נצפו לעתים קרובות (איור 7 ג). ספירת התאים אחרת של מערכת החיסון (נויטרופילים, NK, תאי B ותאי CD4 ו CD8 T) היו משתנה יותר ולכן פחות אינפורמטיבי.
together.within עמודים = "תמיד"> 
איור 1. תרשים זרימה של הליך ניסיוני. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
מיקום 2. איור ואתר של השתלה. העכברוש הוא הרדים ראשון, מונחים על הגב שלה וcostalis Regio תקין אזור (חזה) מגולח כדי להסיר פרווה. בצד ימין, פטמת 2 nd מלמעלה מזוהה ואתר ההזרקה ממוקם 0.5 סנטימטר הפרוקסימלי לזה, בין צלעות -3 ו -4 ה מהחלק התחתון של כלוב צלעות (). Spacer ממוקם אז על המחט והמזרק מוכנים למנוע את המחט החודרת עמוק מדי לתוך פלאורלי חלל ושל תאים או SFM 100 μl מוזרק (B). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. טכניקת דגימה לאיסוף דם מזנב. מקם מקביל 23G x 1¼ מחט לווריד לרוחב (). חלק את המחט לווריד בזווית רדודה, כ 10 מ"מ עמוק, ומחזיק שם כמה שניות עד שהדם גלוי (ב ') ולאחר מכן להסיר את מחט. איסוף דם בעזרת פיפטה (ג). אם יש צורך בעדינות שבץ וריד זנב כדי להבטיח דם ממשיך לזרום. דם טפטפת לתוך צינור 0.5 מיליליטר EDTA אוסף (ד '), ערבוב כמו שאתה הולך כדי למנוע קרישה. "Target =" _ arge.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תוויות איור 4. של דגימת דם בצינור ספירה מוחלטת לניתוח התזרים cytometric. דם (25 μL) ונוגדנים מתווספים צינור מוחלט ספירה (). הצינור אז vortexed וטופחו במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר. לפני התוספת של חיץ אמוניום כלוריד לlyse תאי דם האדומים, המדגם מופיע עכור או אטום (B). ברגע שlysed, המדגם מופיע שקוף ומוכן לניתוח cytometry זרימה (C). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
es / ftp_upload / 53,019 / 53019fig5.jpg "/>
איור 5. אסטרטגית gating לניתוח cytometry זרימה. מערך 6-ממדי יכול לזהות לימפוציטים, מונוציטים ונויטרופילים ותת הלימפוציטים T, T מסוג CD4, CD8 T, תאי B וNK. אסטרטגיות gating המוגדרות והאלגוריתמים לשלב את שניהם תגובתיות השלילית וחיובית שמגדירות כל סוג תא המאפשר זיהוי ספציפי. מספר חרוזים בצינור אחד מוחלט ספירה (שנמצא בכיס לכל צינור) נרשם עבור כל דגימה ונדרש לחישוב מספר התאים לכל μl דם לכל תת-קבוצה, כפי שמוצג. חרוזים אלגוריתם gating המלא לכל תת-קבוצה של תאים מופיע בצד הימין של חלקות הניתוח. (AI) (R1) לראשונה נספרו על ידי FITC (FL-1) לעומת APC (FL-4). רכישה מוגדרת כ -10,000 אירועים (9960 לדוגמא זו). ("איי) רסיסים (R2) מזוהה על ידי FSC לעומת SSC והוסר מכל גרם שלאחר מכןating. ההסרה בעקבות פסולת (BI) (R2) FSC לעומת SSC מבדיל אוכלוסיית תאי דם לבנים לימפוציטים (R3), מונוציטים (R4) ונויטרופילים (R5). (Bii) אוכלוסיות התאים שזוהו ב( BI) אשרו שימוש gating לויקוציטים הנפוץ אנטיגן CD45 על PE / Cy7 (FL-3) לעומת SSC. (Biii) אוכלוסיית הלימפוציטים (R3) הוא מובחן יותר לתוך תאי T (R6) באמצעות gating CD3 על APC (FL-4) לעומת SSC. ( תאי הביב) CD8 T הם לימפוציטים (R3) המובחנים לתא T (R6) שגם להביע CD8a (R9) והם מגודרת על PE (FL-2) מול SSC. (CI) תאי B ותאי NK מוגדרים כימפוציטים ( R3) אשר CD3 שלילי. תאי B (R7) נבדלים מתאי NK כפי שהם מביעים CD45RA והם מגודרת על ידי APC (FL-4) לעומת FITC (FL-1). תאים (כת"ש) CD4 T מוגדרים כימפוציטים (R3) שCD3 שיתוף מפורש (תאי T, R6) וCD4 (R8) אבל לא להביע כל הסמנים האחרים המשמשים. הם נבדלים באמצעות FITC (FL-1) לעומת PE (FL-2) gating. תאי NK מוגדרים ככל שנותרו הלימפוציטים שעדיין לא הוגדרו שמבטאים גם CD161a. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6. עקומת הישרדות לחולדות מושתלות עם מינונים שונים של II-45 תאים מזותליומה. קבוצות של חולדות מושתלות pleurally עם 5 x 10 5 (n = 6), 1 x 10 4 (n = 2), 1 x 10 3 ( n = 2) או 1 x 10 2 (n = 4) II-45 תאי מזותליומה ב100 μL נפח ולאחר מכן במעקב עד נקודת סיום אתית כשהם היו מורדמים. הישרדות בגרף באמצעות יומן הדרגה (מנטל-קוקס) שיטת Gehan-Breslow-Wilcoxon. p>
איור 7. אורך מחזור ספירת תאים חיסוני מחולדות עם מזותליומה ביחס לממוצע והטווח לחולדות שליטה בריאה. השליטה בריאה אומר לכל סוג תא מוצג כקו שחור רצוף אופקי (ערך מוצג על ציר Y זכות כל גרף) והמגוון מתואר על ידי האזור המוצל האפור. ציר Y מציג את הספירה לμl דם לסוג המוצהר תא, או הערך עבור NLR. ציר ה- X הוא כמובן הזמן להתקדמות מחלה, שבו היום 0 היא היום של השתלה. תוצאות אורך עבור 2 חולדות מושתלות עם 1 x 10 4 תאים (A, B) ו- 2 חולדות מושתלים עם 5 x 10 5 תאים (C, D) מוצגים. NLR (), (ב) סך ספירת הלימפוציטים, (ג) ספירת מונוציטים."Target =" _ ge.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| גלאי | Fluorophore | פרטים | מתח | מצב |
| FSC | --- | --- | E00 | לינארי |
| SSC | --- | --- | 450 | לינארי |
| FL-1 | FITC | 533/30 ננומטר | 670 | התחבר |
| FL-2 | PE | 585/40 ננומטר | 675 | התחבר |
| FL-3 | PE / Cy7 | 670nm (מסירה ארוכה) | 600 | התחבר |
| FL-4 | APC | 675/25 ננומטר | 735 | התחבר |
הגדרות גלאי מתח לזרימה ציטומגלווירוס: טבלה 1רכישת נתונים מטרי באמצעות 4 צבעים cytometer זרימה. רווח משרעת מוגדרת ליום 1 לכל הגלאים. FSC: פיזור קדימה, SSC: פיזור בצד, FITC: isothyocyanante העמסה, PE: Phycoerythrin, APC: Allophycocyanine.
| משנה תא | סמני תא | Gating אלגוריתם |
| חרוזים | R1 | |
| פסולת | R2 | |
| תאים (פאן-לויקוציטים) | CD45 + | -R2 |
| לימפוציטים | CD45 + FSC לעומת SSC | R3 * -R2 |
| מונוציטים | CD45 + FSC לעומת SSC | R4 * -R2 |
| נויטרופילים | CD45 + FSC לעומת SSC | R5 * -R2 |
| תאי T (סך הכל) | CD45 + / CD3 + | R6 * R3 * -R2 |
| ce T החיובי CD8LLS | CD45 + / CD3 + / CD8a + | R9 * R6 * R3 * -R2 |
| תאי B | CD45 + / CD3- / CD45RA + | R7 * R3 * -R2 |
| תאי T מסוג CD4 החיובי | CD45 + / CD3 + / CD4 + | R8 * R6 * R3 * - (R7 * R3 * -R2) |
| תאי רוצח טבעי | CD45 + / CD3- / CD161a + | R3 * - [(R2 + R6) + (R7 * R3 * -R2)] |
טבלה 2: סמנים סלולריים ואלגוריתמי gating לאפיין כל קבוצת משנה תא חיסון לאלגוריתם gating, הסמל '+' פירושו 'או' ומאפשר לשתי אוכלוסיות נפרדות שתתווסף יחד גם אם התגובות שלהם אינן חופפות.. '-' סמל פירושו 'לא' ויכול להפחית אוכלוסייה אחת מתוך אחר אוכלוסייה מוגדרת או ההפוך של אוכלוסייה שתוארה קודם לכן. סמל '*' פירושו 'ו' ומגדיר חלל שקיים רק כאשר שתי תגובות חפיפה.
טבלת 3:. הממוצעת והטווח של תאים חיסוניים בעכברי שליטה בריאים (n = 5) ו- II-45 חולדות מושתלות בנקודתי קצה (n = 4) תוצאות לμl דם מוצגות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מפרט שיטה לייצור מודל syngeneic עכברוש orthotopic של מזותליומה pleural ושיטה פשוטה לניטור התקדמות מחלה באמצעות דגימת דם אורך.
המודל השני-45 פותח על ידי חשיפת פישר 344 חולדות לסיבי אזבסט 13. למרות חשיפה זו מייצגת את הדינמיקה האמיתית של אינטראקציות מערכת מארחת אזבסט-חיסון לפתוגנזה מזותליומה, יש לו זמן השהיה ארוך (לוקח שנים כדי ליצור) ויכול להיות מסוכן לחוקרים בשל החשיפה האפשרית לסיבי אזבסט. השתלת orthotopic של II-45 תאים לתוך חלל pleural של בעלי חיים מספקת מודל בטוח ומהיר של התקדמות הסרטן שמחקה את המחלה האנושית במארח חיסון מוסמך 11. עם זאת השיטות ועקרונות המדויקים לדבוק במהלך הפרוצדורות אלה אינן מוגדרים היטב. ההליך מתואר בתוצאות מודל לשחזור מאוד כי הוא רלהעצמאי בקנייה של הניסיון של המפעיל. השלבים הקריטיים הם 1, קציר השני-45 תאים בשלב הצמיחה המעריכית וספירה מדויקת של תאי קיימא; 2, מיצוב הנכון של אתר ההשתלה ולהבטיח את המחט לא לחדור עמוק מדי ולנקב את הריאות או נזק ללב, ו- 3, שמירה וניטור רווחתם של בעלי החיים.
שורת התאים השניה-45 היא גדלה מהר ודורשת passaging כל 3 עד 4 ימים בתרבות, ולכן בעת הכנה להשתלה, תאים צריכים להיות תת-תרבותיים וצמיחה במעקב יומית. יש שנקטפו תאים ונספרו כאשר בשלב הצמיחה המעריכית, כלומר, בכ 70% מפגש. Resuspension של תאים בתקשורת חופשית בסרום ולא PBS מפחית את הלחץ על התאים תוך ספירה והכנה להשתלה. ספירת תאים מדויקת הן קריטיות לשחזור, במיוחד כאשר מינון עם מספרים נמוכים של תאים (לדוגמא, 100 עד 1,000). Susפנסיה צריכה להיות הומוגנית ומורכבת של תאים בודדים (ללא גושים). נפח השתלה של 100 μl מאפשר מינון מדויק מבלי לפגוע הרחבת ריאות באמצעות נוזל מוגזם בחלל פלאורלי. השלבים העיקריים בהשתלה נכונה מיצוב ולהגביל את חדירת המחט לעומק של לא יותר מ -12 מ"מ. מיקום נכון של המחט באתר ההזרקה הוא מאוד חשוב כדי להבטיח שהתאים מושתלים לתוך חלל פלאורלי ולא לתוך חלל הצפק. באופן שגוי השתלת תאים נמוך מדי יכול לגרום לגידולי מזותליומה צומחים דרך הסרעפת, לתוך הכבד וחלל הצפק. הגבלת עומק החדירה של המחט היא גם מאוד חשובה כדי למנוע תמותה כתוצאה מניזק לאיברים פנימיים. הגבלה זו יכולה להיות מושגת באמצעות השימוש בspacer על מחט ארוכה (כפי שמוצג) או השימוש במחט קצרה יותר באורך מוט של 5 מ"מ עד 12 מ"מ. בידיים שלנו, אין תופעות לוואי התרחשובמהלך השתלת תאים. כמו כן הוא חיוני כדי להחליף את המחט לאחר כל השתלה. הימנעות מלעשות זאת עלולה לגרום לגידולים צומחים מתוך חלל החזה לאורך קו ההזרקה. צמיחה כזו מחוץ לחלל פלאורלי נובעת תאים שיורית על מוט המחט ועלולה לגרום להישרדות מורחבת.
בידיים שלנו מודל זה יש שיעור engraftment גידול של 100% בעת ניהול x ≥ 1 10 3 תאים. התקדמות מחלה במודל מזותליומה השנייה-45 היא די מהירה, להיות פחות מ -40 ימים שבם 1 x 10 4 תאים מושתלים ופחות מ -20 ימים למינון של 5 x 10 5 תאים. הדבר עלול להגביל את התועלת של מודל זה לבדיקה טרום-קלינית של כמה טיפולים. השניה-45 תאים, יכולים להיות שמקורו בזמן שאינו זמינים באופן מסחרי באישור היוצר 13. עם זאת, באותה טכניקת השתלה ועקרונות יכולים להיות מיושמים גם לקווים אחרים מזותליומה עכברוש תא זמינים מRepos שורת התאיםitories כאשר התאמה עם זני עכברוש syngeneic הרלוונטיים. המינון האופטימלי של התאים עשוי להשתנות עם קו תא והיה צריך להיות שנקבע לכל קו.
ניטור התקדמות מחלה ואת רווחתם של בעלי החיים הוא קשה כמו הגידולים הם פנימיים ולא יכולים להיות במעקב על ידי גודל. לכן אנו מבקשים לפתח שיטה של ניטור בעלי החיים שיכולים לחזות הידרדרות מצבם כגון עלייה בNLR או שינוי אחר בסמני תא חיסון לפני סימפטומים פיזיים הפכו גלויים. מסך הדם פיתח משתמש רק 25 μl של דם היקפי, כך שדגימה קבועה יכולה להתבצע עם מצוקה מינימאלית לבעלי החיים. טכניקת הדגימה המתוארת דורשת תרגול כדי לקבל את המומחיות הנדרשת. עם זאת, שולט פעם זה הוא מהיר ופולשנית.
שלב קריטי בניתוח הדם הוא למנוע קרישה של דגימת הדם על ידי העברה מהירה לצינור EDTA. דגימות קרושצריך להיות מושלך כמו הספירה תהיה לא מדויקת. עוד צעד קריטי הוא תמוגה התא האדומה לפני ניתוח תא. אם התאים האדומים לא lysed באופן מלא, הרקע המוגבר באופן כוזב להעלות את הספירה. בעוד ההגדרה הראשונית של חלקות נקודה וgating היא לצרוך זמן, פעם אחת את ההגדרות והתבנית נשמרות, assay דורש התאמה קטנה. אסטרטגית gating המועסק משתמשת בגישה אלגברית רב פרמטר בוליאנית לdeconvolute נתונים. על ידי שימוש בצירופים ידועים של בלעדי ומשותף אנטיגנים אלגוריתמים לכל שורה של אסטרטגית השער להגדיר את סוג התא הנפרד במטריצת נתוני שישה-ממדית זו 14. זה יש בשילוב עם דיוק הוקם בטכנולוגיה מבוססת חרוז ratiometric 15-17 היתרון לאפשר לספירה של כל סוג תא מוגדר כשני חלקם של תאים וספירה מוחלטת לμl.
זה הופך להיות מוכר יותר ויותר כי p המערכת החיסוניתמניח תפקיד חשוב בפתוגנזה של סרטן 18. שני הכישלון של המערכת החיסונית לזהות ולהשמיד תאים ממאירים והדיכוי של תאי מערכת חיסון על ידי גידולים יכול להוביל לגידול בלתי מבוקר. כך, ההכללה של מייקרו-סביבה של גידול חיסון המוסמך הוא שיקול קריטי כאשר דוגמנות סרטן והוא יתרון עיקרי של דגמי סרטן syngeneic. דגמי חיסון מוסמך אלה ליצור סביבה מציאותית ורלוונטית מבחינה קלינית לצמיחת גידול ואינטראקציה חיסונית, שהוא חסר בדגמי xenogeneic.
הפרמטרים חיסוניים שזוהו במחקר זה שליווה את התקדמות מחלה, כלומר, ספירת הלימפוציטים, ספירת מונוציטים וNLR, יש גם הוכחו כדי לתאם עם פרוגנוזה גרועה במזותליומה האנושית 19-21 מתן עדות לרלוונטי של המודל ובדיקת הדם . בדגמים שהוצגו, התועלת הקלינית של ניטור הפרמטרים חיסוניים מוגברת שנינותh כמובן כבר הזמן (מינון נמוך) וניתן לשפר עוד יותר על ידי דגימה תכופה יותר בשלבים מאוחר יותר של המחלה. בעוד מאמר זה מתמקד במודל של מזותליומה, את היכולת לעקוב אחר התקדמות גידול באמצעות דגימת דם היקפית יכולה להיות מנוצלת לכל דגמי סרטן syngeneic. יתר על כן, assay יכול לשמש גם כדי להעריך את התגובה החיסונית לטיפולים שונים. בעבר השתמשנו assay זה כדי לפקח על התגובה לטיפול חיסון נגד סרטן במודל syngeneic גליומה (9L) 22. במחקר זה, תאי CD4 ו CD8 T היו הסמנים אינפורמטיבי ביותר. יש לנו גם השתמשתי assay זה ומודל מזותליומה השנייה-45 לזהות הבדלים בתגובה החיסונית לגידולים עמידים לchemotherapeutics שונה 11. במחקר זה, כל הפרמטרים מלבד תאי CD8 T הראו הבדלים משמעותיים. הניטור האורך במהלך התקדמות מחלה המתוארת כאן מדגיש את הפוטנציאל של פרמטרים תא חיסון שונים לקורמתייחס עם התקדמות הסרטן ורווחתם של בעלי חיים כאשר התחייבות דוגמנות orthotopic syngeneic של סרטן בחולדות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA Collection tube (0.5 ml) | Greiner Bio One GmbH | 450480 | |
| Rat T/B/NK Cell cocktail | BD Pharmingen | 558509 | anti-Rat CD3 APC (IgM clone 1F4), anti-Rat CD45RA Fitc (IgG1 clone OX-33), anti-Rat CD161a PE (IgG1 Clone 10/78) |
| anti-RAT CD8a PE | Biolegend | 200608 | (IgG1vClone G28) |
| anti-Rat CD4 FITC (Domain 1) | Biolegend | 203406 | (IgG1 Clone OX-38) |
| anti-Rat CD45 PE/Cy7 | Biolegend | 202214 | (IgG1 Clone OX-1) |
| TruCount Tubes | Becton Dickinson | 340334 | Box of 50 absolute counting tubes |
| RPMI 1640 media | Life Technologies | 11875-119 | |
| foetal bovine serum (FBS) | Scientifix | FBS500-S (lot# 010101-1) | |
| trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| PBS tablets | Medicago AB | 09-9400-100 | |
| 23Gx1¼ Needle | Becton Dickinson | 302008 | |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson | 302 100 | |
| Fischer 344 Rat | Animal Resources Centre, Perth Australia | F344 | |
| I.S.O (Isoflurane USP) | Veterinary Companys Australia (VCA) | B7058 | |
| II-45 Rat Mesothelioma line | Zurich University | Note: The cell line was given as a gift and is not commercially available at the ATCC | |
| FACSCalibur 4 color | Becton Dickinson | 342975 | |
| TRIS-HCL | SIGMA | T3253 | |
| Ammonium Chloride | SIGMA | 9718 | |
| Anaesthetic Machine (The stinger) | Advanced Anaesthesia specialists | #00449 |
References
- Kao, S. C., et al. Malignant mesothelioma. Intern Med J. 40 (11), 742-7450 (2010).
- Zucali, P. A., et al. Advances in the biology of malignant pleural mesothelioma. Cancer Treat Rev. 37 (7), 543-558 (2011).
- Olsen, N. J., et al. Increasing incidence of malignant mesothelioma after exposure to asbestos during home maintenance and renovation. Med J Aust. 195 (5), 271-274 (2011).
- Zucali, P. A., et al. Thymidylate synthase and excision repair cross-complementing group-1 as predictors of responsiveness in mesothelioma patients treated with pemetrexed/carboplatin. Clin Cancer Res. 17 (8), 2581-2590 (2011).
- Vogelzang, N. J., et al. Phase III study of pemetrexed in combination with cisplatin versus cisplatin alone in patients with malignant pleural mesothelioma. J Clin Oncol. 21 (14), 2636-2644 (2003).
- Lowenstein, P. R., Castro, M. G. Uncertainty in the translation of preclinical experiments to clinical trials. Why do most phase III clinical trials fail? Curr Gene Ther. 9 (5), 368-374 (2009).
- Kamb, A. What's wrong with our cancer models. Nat Rev Drug Discov. 4 (2), 161-165 (2005).
- Yakisich, J. S. An Algorithm for the Preclinical Screening of Anticancer Drugs Effective against Brain Tumors. ISRN Pharmacol. 2012, 513580 (2012).
- Basu, D., Herlyn, M. Defining microenvironments within mouse models that enhance tumor aggressiveness. Cancer Biol Ther. 8 (4), 380-381 (2009).
- Abolhassani, M., et al. Screening of well-established drugs targeting cancer metabolism: reproducibility of the efficacy of a highly effective drug combination in mice. Invest New Drugs. 4 (4), 1331-1342 (2011).
- Hudson, A. L., et al. Establishing a panel of chemo-resistant mesothelioma models for investigating chemo-resistance and identifying new treatments for mesothelioma. Sci Rep. 4, 6152 (2014).
- Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats! Dis Model Mech. 2 (5-6), 206-210 (2009).
- Craighead, J. E., et al. Characteristics of tumors and tumor cells cultured from experimental asbestos-induced mesotheliomas in rats. Am J Pathol. 129 (3), 448-462 (1987).
- Hunter, S. D., et al. Lymphocyte subset analysis by Boolean algebra: a phenotypic approach using a cocktail of 5 antibodies and 3 color immunofluorescence. Cytometry. 15 (3), 258-266 (1994).
- Brando, B., et al. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry. 42 (6), 327-346 (2000).
- Schnizlein-Bick, C. T., et al. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).
- Gajkowska, A., et al. Flow cytometric enumeration of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells in leukapheresis product and bone marrow for clinical transplantation: a comparison of three methods. Folia Histochem Cytobiol. 44 (1), 53-60 (2006).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Kao, S. C., et al. High blood neutrophil-to-lymphocyte ratio is an indicator of poor prognosis in malignant mesothelioma patients undergoing systemic therapy. Clin Cancer Res. 16 (23), 5805-5813 (2010).
- Kao, S. C., et al. Validation of prognostic factors in malignant pleural mesothelioma: a retrospective analysis of data from patients seeking compensation from the New South Wales dust diseases board. Clin Lung Cancer. 14 (1), 70-77 (2013).
- Burt, B. M., et al. Circulating and tumor-infiltrating myeloid cells predict survival in human pleural mesothelioma. Cancer. 117 (22), 5234-5244 (2011).
- Weir, C., et al. Streptavidin: a novel immunostimulant for the selection and delivery of autologous and syngeneic tumor vaccines. Cancer Immunol Res. 2 (5), 469-479 (2014).
