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Medicine

II-45 동계 쥐의 Mesothelioma 모델에서 소성을 주입 및 주변 면역 세포 모니터링

doi: 10.3791/53019 Published: October 2, 2015

Summary

면역 능력이 쥐의 흉강에 II-45 악성 세포의 이식에 의한 흉막 악성 중피종의 소성을 쥐 모델의 생성이 제공됩니다. 유세포 방법도 기재되어 25 ㎕의 혈액 샘플로부터이 동물 일곱 면역 세포 서브 세트를 분석한다.

Abstract

백신 및 면역 검사 점 억제제, 및 치료 반응에 종양 미세 환경의 역할의 증가 이해 등의 암에 대한 면역 기반 치료에 대한 관심의 거대한 급증, 공동으로 전임상 시험에 대한 면역 능력이 동 소성 모델의 필요성을 가리 이 새로운 치료법. 이 논문은 흉막 악성 중피종의 소성을 면역 능력이 쥐 모델을 수립하는 방법을 보여줍니다. 동 소성 모델 모니터링 질병 진행은 종양의 내부 위치에 의해 혼동된다. 길이 방향으로 질병의 진행이 암의 다른 쥐 모델에서 면역 세포를 순환에 미치는 영향을 모니터링하기 위해 하나의 튜브 25 μL 전혈은 설명을 필요로 분석 유동 세포 계측법. 총 림프구, 단핵구 및 호중구뿐만 아니라, T 세포 서브 세트 CD4 및 CD8, B 세포 및 자연 살해 세포 : 이것은 정확한 일곱 면역 매개 변수의 정량화를 제공한다. 다른 서브 우퍼이러한 매개 변수는 중피종 ETS 모델에서 질병의 진행을 모니터링하기위한 큰 유틸리티를 갖는 림프구 비율 호중구와 다른 상황 및 모델에 유용하다. 또한 면역 - 기반 치료법​​에 대한 응답을 모니터링하고 치료의 성공 또는 실패로 이어지는 근본적인 메커니즘을 이해하는데 도움이 될 하나의 관이 방법을 사용하여 면역 세포 수준을 순환 분석.

Introduction

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악성 중피종 (MM)은 멤브레인 (mesothelium)로 형질 전환 된 세포에서 발생 공격적인 악성하다 라인 복강 폐, 심장 및 내부 생식 기관 및 폐 공동 또는 늑막 1,2- 가장 일반적인 차 종양은 . 석면 섬유에 노출되면 모든 MM의 80 %를 차지하고, 석면 사용에 대한 금지는 대부분의 서방 국가에서 수십 년 전에 도입 된 반면, 지역 사회에서의 광범위한 사용은 치명적인 유산을 남겼습니다. 세계 보건기구 (WHO)는 10만7천명은 전 세계적으로 계속 증가 사망률, 석면 관련 질병으로 매년 죽는 것으로 추정하고있다. 새로운 비 직업 입사 파도 대두되고이 3 피크 때, 어떤 수준에서의 작은 이해가있다.

전신 화학 요법이 유일한 실행 가능한 옵션 4 중 하나를 나타냅니다 때 MM를 가진 사람들의 대부분은 늦은 진단. 가장 effecti화학 요법과 (시스플라틴 (5)과 함께와 pemetrexed) 현재의 '주의 기준'을했습니다 10 년 전에 확인되었다. 이 치료의 그러나 실패는 불가피 만 12개월 2의 냉혹 한 예후 및 평균 생존 환자를 떠나 더 검증 된 제 2 라인 옵션은 존재하지 않는다. 따라서, 더 효과적인 치료법이 절실히 아직은 충족되지 않은 필요성이 존재한다. 임상 시험에서 새로운 치료의 다수의 시험에도 불구하고 아무도 실제로 변화를 초래하지 않았다. 이는 임상 6-8를 설정하는, 일반적으로 이종 이식 마우스 모델에서 수행 전임상 결과 낮은 (5 %) 전입에 부분적으로 기인하는 것으로 여겨진다. 이러한 모델은 충실히 자주 작동 면역계 9의 부재 하에서, 비 - 생리적 인 위치에서 발생하는 종양 미세 환경의 복잡한 양상 요점을 되풀이하지 않는다.

동계 동 소성 모델 C보다 훨씬 더 현실적인 종양 환경을 만들종양이 그대로 면역 시스템 10, 11과 올바른 생리 학적 위치에 발생하는 ommonly 피하 이종 이식의 모델을 사용했다. 쥐의 대형화, 특히 직렬 혈액 치료 반응 및 독성 (12)을 평가하기 위해 요구되는 무 약물 연구에서, 설치류 질병 모델로서 사용을 향상시킨다. 또한, 모델되는 질병 진행 모니터링 순환 인자에서 발견 매우 매력적이다를 사용 질병의 진행을 모니터 할 수있는 능력으로 인해 (예컨대 흉강 에서처럼) 종양의 위치가 어렵다. 면역 능력 쥐를 사용 흉막 중피종의 동계 동 소성 모델의 생성을 설명한다. 또한, 순환하는 면역 세포를 측정하여 흉막 질환 진행을 모니터링하기위한 간단하고 비교적 비 침습적 방법도 설명한다.

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Protocol

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동물과 관련된 모든 절차는 과학적인 목적을위한 동물의 관리 및 사용을위한 연습의 호주 코드의 권장 사항에 따라 수행되었다. 본 연구의 프로토콜은 로얄 노스 쇼어 병원 동물 관리 및 윤리위원회에 의해 승인되었다. 여성 피셔 344 쥐 (F344, 1백50-2백그램)가 컨즈 시설 유지하고, 표준 조건 (12 시간 빛 / 어둠 사이클과 음식과 물을 무료로 이용할 수)에서 Kolling 연구소.

참고 : 모든 실험 절차에 대한 흐름도는 그림 1에 제시되어있다.

이식 용 세포의 1. 준비

  1. (또한 IL-45로 알려진; 청석면 석면 복막 도입에 의해 유래) 배양 래트 중피종 II-45 세포주에 RPMI 1640는 (RPMI) 매체 (37 °를 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 보충 된 표준 조건에서 성장 5 % CO 2)와 C 가습 인큐베이터. 터 유지 보수75cm 2 플라스크에 계대 두 번 하위 배양 약 1시 50분 주일로한다.
  2. 37 ° C에서 세포 배양과 따뜻한 분취 시약을 준비합니다. 필요한 시약은 10 % FBS, 인산염 완충 식염수 (PBS)와 0.5 % 트립신 EDTA와 혈청 무료 RPMI 미디어 (SFM), RPMI을 포함한다.
  3. 약 70-80% 합류에 주입 문화 세포. 이것은 그들이 선형 증식기에 보장한다.
  4. 미디어를 폐기 멸균 PBS의 5 ㎖로 한 번 세척 한 후 3 ㎖ 0.5 %의 트립신 EDTA를 추가하여 수확 세포.
  5. 모든 세포는 비 부착 될 때까지 약 5 분 동안 인큐베이터에 플라스크를 돌려줍니다.
  6. 세포를 비 - 부착되면, 트립신을 불 활성화하고, 10 % FBS RPMI에 3 ㎖를 추가한다. 수집하고 원심 분리기 세포 3 분 300 XG에.
  7. 3 분 동안 300 XG에 다시 SFM 원심 분리기 10ml에 세포 펠렛을 씻으십시오.
  8. 10 SFM ㎖의 원심 분리기 위와 같이 다시 세척 세포 펠렛.
  9. SFM 10ml에 세포를 재현 탁 및 혈구 또는 유사한 장비를 이용하여 세포 수를 수행한다.
  10. 100 μL를 주입 할 수있는 세포의 양을 함유하도록 세포를 희석.
    주 : 종양 성장 100 100 μL 셀이지만 표준 투여 량은 100 μL 500,000 세포만큼 낮은 용량으로 입증되었다.
  11. 쥐의 수 (즉, 100 μL / 쥐)를 이식하는 미디어에 충분한 세포를 준비 플러스 프라이밍과 바늘의 죽은 볼륨에서 손실을 보상하기 위해 적어도 0.5 ml를 추가.
  12. 준비 (전지 제외) 충분한 SFM은 대조군 (즉, 100 μL / 쥐)에 이식 할, 플러스 적어도 0.5 ml를 추가.
    세포 및 SFM은 이제 주입 준비 :합니다. 그들은 37 O C로 유지하고 생존을 유지하기 위해 수확의 2 시간 내에 이식해야합니다.

세포의 2. 생체 주입

  1. 유도 챔버로 F344 래트 (> 13 세 주) 놓고 1.4 % 이소 플루 란 흡입 (또는 설비에 사용 방법)을 사용하여 마취. 쥐 (흐르는 1.4 %의 이소 플루 란) 코 콘에 실에서 잠 움직임을 것으로 나타나면, (복부보기)을 위로 향하게 가슴의 뒷면에 배치합니다. 이 내부 장기 멀리 흉강에서 해결 할 수 있습니다. 쥐를 보장하기 위해 기관 프로토콜에 따라 반사 신경을 확인하는 것은 완전히 마취됩니다.
  2. 모피를 제거 할 권리 레지오의 costalis (가슴) 영역을 면도.
  3. 80 % v / V를 에탄올로 면도 영역을 청소합니다.
  4. 주사 부위를 확인 : 오른쪽에, 2 선이 두개 시작 찾을 수 있습니다. 주사 부위는 흉곽의 꼬리 끝에서 3 번째와 4 번째 늑골 사이에있는이 0.5 cm 근위입니다. (도 2A).
  5. 부드럽게 재현 탁하는 II-45 세포를 섞는다. 천천히 1 ml의에 세포 현탁액 (또는 대조군에 대한 SFM)을 그릴 &# 160; 부착 된 바늘없는 주사기. 바늘 세포의 드로잉 처리를 위해 연결되어 있다면, 세포가 바늘 주입 라인을 따라 증가 할 가능성이있다. 23G X 1¼ 바늘을 연결합니다. 프라임 바늘과 모든 공기 방울을 제거한다.
  6. 주사기 및 바늘 프라이밍되면, 바늘 축 위에 20mm 길고 직경 5mm 스페이서 배치. 이것은 주입하는 동안 흉강으로 너무 깊게 침투하는 바늘을 방지하기 위해 사용된다. 노출 바늘 약 5mm-12mm 어떤 장기를 손상시키지 않고 리브를 통해 관통하기에 충분하다.
  7. 천천히, 갈비뼈 사이에 바늘을 삽입 혈관 (더 혈액이 주사기에 표시되지 않아야합니다)을 100 ㎕의 세포 또는 SFM을 주입 구멍되지 않은 보장하기 위해 주사기에 다시 그립니다. (그림 2B).
  8. 바늘을 제거하고 부드럽게 흉강에서 셀을 확산 좌우로 쥐를 굴립니다.
  9. 케이지에 쥐를 넣고 복구를 확인합니다. 목전자의 쥐가 1 분 이내에 깨어 주위를 이동하기 시작해야한다.
  10. 새 바늘을 사용하여 각 쥐에 대해 반복합니다. 동일한 바늘을 재사용 바늘의 주사 라인을 따라 세포 성장을 초래할 것이다.
  11. 매일 동물의 복지를 모니터링합니다.
  12. 기관 동물 윤리위원회에 의해 지배으로 윤리적으로 정의 된 엔드 포인트에서 동물을 안락사. 이 실험에서 쥐에 대한 윤리적 끝점은 ​​10 % 이상 또는 호흡 곤란의 체중 감소 하였다.

3. 꼬리 정맥 혈액 채취

  1. 혈액을 사후 즉시 세포 주입 수집 할 경우, 마취 랫트를 유지한다. 또 다른 시점에서 혈액을 채취하는 경우, 1.4 %의 이소 플루 란을 흡입하여 쥐를 마취. 쥐를 보장하기 위해 기관 프로토콜에 따라 반사 신경을 확인하는 것은 완전히 마취됩니다.
  2. 옆에 쥐를 놓고 측면 꼬리 정맥을 찾습니다.
  3. 80 % 에탄올로 소독하고 꼬리를 0.5 ml의 EDTA의 C 레이블ollection 관.
  4. 혈액을 수집하려면, 항상 (따라 방법의 약 삼분의) 꼬리의 꼬리 끝에서 시작합니다. 이는 첫 번째 시도가 실패한 경우의 꼬리 끝 뇌 더 가깝게 시도 허용한다. 이 혈전을 일으킬 수있는 꼬리 쪽 재 샘플링하지 마십시오.
  5. 측면 정맥에 23G X 1 ¼ 바늘 평행하게 배치하고 약 10mm (그림 3A)을 관통하도록 얕은 각도로 정맥에 밀어 넣습니다.
  6. 참고 : 정맥이 성공적으로 구멍이 된 경우 혈액이 바늘 (그림 3B)의 부착 결국 볼 수 있습니다.
  7. 혈액의 방울은 바늘 구멍의 꼬리 부위에 형성 할 것이다. 레이블 0.5 ㎖ (이하) EDTA 수집 튜브에 피펫 및 전송을 사용하여이 피를 수집합니다. 면역 세포 분석 25 μL 충분하다. 출혈이 멈출 때까지 사이트를 천공하도록 압력 거즈를 적용합니다.
  8. 홍보하기 위해 혈액과 EDTA를 혼합 혈액 튜브를 쓸어 넘기이벤트 응고. 혈액 수집 및 응고를 방지하기 위해 가능한 한 짧은 EDTA와 혼합 사이의 시간을 유지한다.
  9. 분석 할 때까지 실온에서 랙에 여러 쥐 저장소 EDTA 혈액 샘플에서 혈액을 수집합니다. 컬렉션의 2 시간 내에 프로세스 혈액.

비드 기반 방법을 사용하여 면역 세포 프로파일 4. 샘플 준비

참고 :이 단일 플랫폼 방법은 각 샘플에 대한 구슬 알려진 번호가 상업적으로 이용 가능한 절대 계수 튜브를 사용하여 사용합니다. 이 튜브는 구슬을 해제 샘플 준비 중에 용해 동결 건조 된 펠릿을 포함하고있다. 비드 형광 표지되고 모집단 비드에 의해 게이팅 절대 카운트가 계산 될 수있다.

  1. EDTA 전체 혈액 샘플이 몇 분 동안 느린 회전 믹서를 배치하여 잘 혼합해야합니다. 각 샘플에 대해 하나의 절대 계수 튜브 레이블. 구슬을 포함하는 펠렛 T 아래에 표시되어야합니다상기 튜브의 하단에 그 금속 비드 홀더.
  2. 레이블이 절대 계수 튜브에 EDTA 전체 혈액의 25 μl를 전송합니다. 비드 펠렛은 혈액의 추가에 용해됩니다.
  3. 각각의 튜브에 방지 쥐 T / B / 자연 킬러 (NK) 세포 칵테일 20 μL, 안티 쥐 CD8a PE 10 μL, 안티 - 쥐 CD4 (도메인 1) FITC의 10 μL 및 안티 쥐의 10 μl를 추가 CD45 PE / Cy7 (그림 4A). 형광 표 1에 정의되어 있습니다.
  4. 항체 및 세포가 튜브의 바닥에있는 관의 측면에 붙어 가지 않도록 간단히 튜브 (300 XG)를 원심 분리기. 소용돌이는 혼합하고 실온에서 15 분 동안 품어합니다.
  5. 적혈구가 10 mM 트리스의 400 μl를 추가 용균하려면 0.15 M 염화 암모늄 완충액 (pH 7.5) 및 와류 믹스합니다. 샘플은 반투명과 흐린하지 (도 4B 및 C)를 나타날 때 용해가 완료됩니다. 시료가 완전히 증가로 이어질 것입니다 용균 실패개발 배경 및 유동 세포 계측법에 의해 분석 할 때 거짓으로 수를 증가.

샘플 5. 유세포 처리

참고 : 흐름 cytometer 4 색에 수행합니다.

  1. 그림 5에 도시 된 바와 같이 획득 모드, 8 플롯와 새 템플릿에서 소프트웨어를 엽니 다.
  2. 표 1 및 게이트 (R1)을 설정에게 장비 설정을 조정합니다 (FITC [FL-1] APC는 [FL-4] 대), 그림 5Ai)는 형광 구슬을 계산합니다. 다른 문이 취득 단계에서 중요하지 않지만 분석을 위해 필요합니다. 이 프로토콜에서 사용되는 절대 카운팅 구슬 형광 염료를 함유하고 청색 채널에 약한 비록 모든 채널을 검출 할 수있다.
  3. 제어 준비된 혈액 샘플, 소용돌이를 사용하고 세포 계측기에로드하고 데이터 수집 게이트들이 조절 될 수 있도록 설정 모드에 저속 (12 μL / 분)에서 실행.
  4. 인수에 설정R1 비드 게이트 10,000 이벤트를 수집합니다.
  5. 데이터를 기록 및 수집 메뉴에서 파일 번호와 레이블 샘플 파일을 설정하는 폴더를 설정합니다.
  6. 샘플 사이토 상 분석 될로드 및 매체 (35 μL / 분)로 유량을 설정한다. 같은 유량으로 각 샘플을 실행합니다. 유속은 (12 μL / 분) 또는 로우 (60 μL / 분) 하이로 변화 될 필요가있을 수 있지만, 일반적으로는 적절한 매체이다. 이 속도는 각 샘플에 대한 10,000 비드 이벤트를 취득하는 데 약 90-120 초 걸립니다.
  7. 샘플 확인 이벤트가 R1 비드 게이트에 나타나는되어 있는지 확인하기 위해 산포도를 볼로드되면. 초기 산포도에서 드리프트를 일으키는 샘플 압력 약간 불안정이있을 수있다. 이 안정 될 때까지 기다립니다.
  8. 안정화되면, 획득을 클릭하고 샘플을 실행할 수 있습니다. 사이토는 R1 10,000 비드 이벤트를 취득 완료되면 사이토는 취득을 중지하고 모든 데이터를 저장합니다.
  9. 샘플을 제거하고 TU 흐름 폐기수. 사이토는 이제 다음 샘플에 대한 준비가되어 있습니다. 모든 샘플을 실행 한 후 분석 모드로 진행합니다.

6. 면역 세포 분석

참고 : 게이팅 전략과 부울 대수는 각각의 세포 인구를 정​​의하는 데 사용됩니다. 부울 대수는 하나의 정의에서 여러 작업을 위해 할 수있는 논리 기반의 분석 방법이다. (예를 들어, BD CELLQuest) 유동 세포 계수기의 분석 소프트웨어 부울 대수의 사용을 허용한다. 방정식 구체적으로 각각의 세포 집단을 식별하는 셀을 정의하는데 도움을 위해 상당한 부정적인 반응을 적극적으로 설명하기 위해 사용된다. '지역'은 '게이트'를 정의하는 데 사용됩니다. (-, 표 2에 정의 +, *)가 게이트 대수 연산자로 연결된 다수의 영역들로 구성 될 수있는 반면, 영역은 2 차원 공간을 정의한다.

  1. 분석 모드로 소프트웨어를 전환합니다. 분석 템플릿에 맞게 생성되어야
  2. 개별적으로 각각의 파일 (즉, 각각의 시료를) 분석 할 수 있습니다. 표 2에 정의 된 설정 게이트 R1 내지 R9로하고 (또한,도 5에 도시) 각각의 세포 유형에 대한 알고리즘을 설정.
  3. 게이트들과 알고리즘 (표 2 및도 5)에 의해 정의 된 각각의 세포 집단을 계산하는 셀의 통계 카운터를 사용한다. 알고리즘은 셀 통계 카운터에 자동으로 세포 수를 조정합니다.
  4. 다음 식을 사용하여 세포 서브 세트를 계산한다 :
    식 (1)
    주 : 카운트 셀 이벤트 수 (예를 들면, CD4 T 세포의 이벤트) 피 μL 당 세포 수를주고 상기 식을 이용하여 열거된다. 예를 그림 5에 표시됩니다.

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Representative Results

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II-45 세포를 이용한 흉막 중피종의 소성을, 모델 생성을 위해이 문서에서 사용하는 방법은 쥐 주입법에 의한 사망하지으로, 재현성 및 빠른 시간 내에 중피종에 굴복 동물 결과. 이식 된 세포의 수의 적정 1X 10 3 세포는 완전히 침투 모델 (100 % 생착)에 필요한 최소 수 있다고 판단했다. 쥐에 이식 세포의 수는 다른 질환의 중증도에 영향을 미치는 것으로 나타나없이 질병의 시간 코스를 변경. × 103 (1)을받은 동물, 하루 40, 30, 각각 20 일 (그림 6)에 의해 윤리적으로 정의 된 엔드 포인트에 도달 × 10 4 1, 5 × 10 5 세포.

혈액은 컬렉션에 관련된 관찰 합병증으로 약 두 배 매주 쥐에서 수집되었다. 이는 총 혈액량의 더 10 % 이상을 주목하는 것이 중요하다 (또는약 2 mL)를 2 주 기간에 수집한다. 게이팅 전략을 결합 부울 대수는 림프구, 단핵구와 호중구와 림프구의 부분 집합 T, CD4 T, CD8 T, B와 NK 세포를 식별하기 위해 설립 된 유세포 분석. 각 세포 유형에 대한 평균 및 범위는 대조군 (N = 5)과 끝점에서 II-45 주입 된 쥐의 평균 및 범위와 비교 하였다 (표 3)를 사용하여 설정 하였다. 엔드 포인트 값은 첫 번째 차이는 건강하고 병에 걸린 동물 사이의 면역 세포 수의 존재 여부를 확인하기 위해 비교 하​​였다. 림프구 비율 (NLR)에 단핵구, 호중구 및 호중구가 증가하는 반면 건강한 대조군에 비해, 총 림프구, CD4 T 세포, B 림프구 및 NK 세포는 엔드 포인트에서 II-45 주입 된 래트에서 감소되었다.

이와 같은 질병의 진행과 함께 변화하고 이들 면역 세포가 매개 변수 F 대리 마커로 사용 될 수 있는지 여부를 결정하는또는 질병 모니터링, 종 샘플은 (그림 7)를 비교 하였다. 가장 유익한 길이 매개 변수는 윤리적 인 엔드 포인트 (그림 7A) 7 일 전으로 감지 증가로 NLR했다. 저용량 세포와 쥐를 들어, NLR 하루 18, 22 총 림프구 수가 사이에 증가하기 시작하는 반면 고용량 세포와 쥐를 들어, 높은 NLRs는, 7 일 및 12 일 후 주입 사이에 검출되었다과 쥐에서 질병의 진행 감소 더 이상 질병 시간 코스 모델 (낮은 세포 투여 량 : 1 X10 4, 그림 7B). 이 감소는 빠른 시간에 코스를 쥐에 분명 아니었다 (높은 셀 용량 : 5 X10 5). 크게 증가 카운트가 자주 (그림 7C)이 관찰되었다 때 단핵구 터미널 수집 할 때까지 정상 수준에 남아 있었다. 다른 면역 세포의 수는 (호중구, 북한, B 세포와 CD4와 CD8 T 세포는) 더 많은 변수 때문에 적은 정보했다.


그림 1. 실험 절차의 흐름도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 위치 및 이식의 사이트. 쥐가 먼저 뒷면에 배치하고 오른쪽 레지오의 costalis (가슴) 영역이 모피를 제거하는 면도, 마취됩니다. 오른쪽에, 위로부터 2 번째 니플 식별 및 주사 부위는 흉곽 (A)의 아래로부터 3 번째 및 4 번째의 리브 사이에,이 0.5 cm 근위 위치한다. 스페이서는 다음 흉막으로 너무 깊게 침투하는 것을 방지하기 위해 바늘을 바늘 및 주사기 준비된 위에 배치 공동 및 세포 또는 SFM 100 ㎕ (b)에 주입된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. 꼬리에서 혈액을 수집하기위한 샘플링 기법. 측면 정맥 (A)에 23G X 1 ¼ 바늘 평행하게 배치합니다. , 얕은 각도로 약 10mm 깊은 정맥에 바늘을 밀어 피가 볼 (B)가 될 때까지 바늘을 제거 몇 초 동안이십시오. 피펫 (C)를 ​​사용하여 혈액을 수집합니다. 필요한 경우 부드럽게 스트로크 꼬리 정맥은 혈액의 흐름을 계속 확인합니다. 당신이 응고를 방지하기 위해 이동으로 0.5 ml의 EDTA 수집 관 (D)에 피펫 피가 혼합. arge.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
도 4 유세포 분석을위한 절대 카운팅 튜브에서 혈액 샘플의 라벨. 혈액 (25 μL) 및 항체 절대 카운팅 튜브 (A)에 추가된다. 튜브를 볼 텍싱하고, 실온에서 15 분 동안 인큐베이션한다. 염화 암모늄 완충액의 첨가는 적혈구를 용해시키기 위해 먼저 샘플을 혼탁 또는 불투명 (B)를 보인다. 용해되면, 샘플이 반투명 표시 및 분석 (C) 유동 세포 계측법에 대한 준비가되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 유동 세포 계측법 분석 5. 게이팅 전략. 6 차원 데이터 세트는 림프구, 단핵구와 호중구와 림프구의 부분 집합 T, CD4 T, CD8 T, B와 NK 세포를 식별 할 수 있습니다. 정의 게이팅 전략 및 알고리즘은 특정의 식별을 가능하게 각각의 세포 유형을 정의하는 두 음성 및 양성 반응성을 통합한다. (각 튜브 파우치에 있음), 각 계수의 절대 튜브에 비드의 개수는 각 샘플에 대해 기록되고, 도시 된 바와 같이 각각의 서브 세트에 대한 혈액 μL 당 세포의 수를 계산하기 위해 필요하다. 각 셀의 부분 집합에 대한 완전한 게이팅 알고리즘 분석 플롯의 오른쪽에 표시됩니다. (AI) 비즈 (R1)은 처음 APC FITC (FL-1) ~ (FL-4)에 의해 계산됩니다. 인수는 약 10,000 이벤트 (이 예를 들어, 9960)로 설정되어 있습니다. (AII) 파편 (R2) 이후의 모든 G에서 SSC FSC에 의해 식별 및 제거ating. (BI) 파편에 따라 제거는 SSC (R2) FSC는 림프구 (R3), 단핵구 (R4) 및 호중구 (R5)에 백혈구 인구를 구별합니다. (BII) (BI)에서 확인 된 세포 집단을 사용하여 확정 SSC PE / Cy7 (FL-3)에 공통의 백혈구 항원 CD45 게이팅. (Biii) 림프구 인구 (R3)는 더 SSC APC (FL-4)에 CD3 게이팅을 사용하여 T 세포 (R6)로 분화된다. ( (BIV) CD8 T 세포는 (). B 셀 C1 내지도 CD8a (R9 표현) 및 SSC PE (FL-2)에 게이팅되는 T 세포 (R6)로 분화 림프구 (R3)이며 NK 세포는 림프구로서 정의된다 CD3는 음 R3). 그들은 CD45RA 표현 및 FITC (FL-1). (CII) CD4 T 세포 림프구 (R3)로 정의되는 APC (FL-4)에 의해 그 공동 익스프레스 CD3 게이트 된대로 B 세포 (R7)는 NK 세포로 분화 (T 세포, R6) 및CD4 (R8)하지만 사용되는 다른 마커 중 하나를 표명하지 아니합니다. 그들은 PE FITC (FL-1) (FL-2) 게이팅을 사용하여 구분됩니다. NK 세포는 CD161a가. 표현 이미 정의되어 있지 않은 나머지 림프구로 정의되는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
II-45 중피종 세포의 다양한 투여 량으로 주입 된 쥐에 대한도 6 생존 곡선. 쥐의 그룹은 pleurally 주입 된 5 × 5 (N = 6), 1 × 104 (N = 2), 1 × 103 ( N = 2) 또는 1 × 2 (N = 4) II-45 악성 세포 100 μL 볼륨에서 다음 그들이 안락사시켰다 윤리적 인 엔드 포인트까지 모니터링. 생존 로그 랭크 (벽난로 - 콕스) Gehan-Breslow - 윌 콕슨 방법을 사용하여 그래프로했다. P>

그림 7
세로 건강한 대조군의 평균과 범위 중피종 상대와 쥐에서 면역 세포의 수를 순환이. 건강한 컨트롤은 각 세포 유형에 대한 의미 그림 7. 값의 오른쪽 Y 축에 표시됩니다 (수평 끊어지지 않은 검은 색 선으로 표시됩니다 각 그래프) 및 ​​범위는 회색 음영 영역에 의해 도시된다. Y 축이 정해진 세포 유형 또는 NLR에 대한 값에 대한 혈액의 μL 당 개수를 나타낸다. X 축은 0 일 주입 날 질환 진행에 대한 시간 경과이다. 5 × 105 세포 (C, D) 나타낸다 주입 1 × 104 세포 (A, B) 및 2 래트 주입 2 래트에 대한 길이의 결과. (A) NLR (B) 총 림프구의 수, (C) 단핵구 계산합니다.ge.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

탐지기 형광 세부 전압 모드
FSC --- --- E00 선형
SSC --- --- (450) 선형
FL-1 FITC 30분의 533 nm의 (670) 로그인
FL-2 PE 40분의 585 nm의 (675) 로그인
FL-3 PE / Cy7 670nm (긴 패스) (600) 로그인
FL-4 APC 25분의 675 nm의 (735) 로그인

표 1 : 플로우 사이토위한 전압 검출기 설정4 색의 유동 세포 계측기에 메트릭 데이터를 수집. 진폭 이득은 모든 탐지기에 대해 1로 설정된다. FSC : 앞으로 분산, SSC : 사이드 분산, FITC : 형광 isothyocyanante, PE : 피코 에리 트린, APC : Allophycocyanine.

셀 집합 세포 마커 게이팅 알고리즘
염주 (R1)
부스러기 (R2)
세포 (범 백혈구) CD45 + -R2
림프구 SSC 대 CD45 + FSC R3 * -R2
단핵구 SSC 대 CD45 + FSC R4 * -R2
호중구 SSC 대 CD45 + FSC R5 * -R2
T 세포 (전체) CD45 + / CD3 + R6 * R3 * -R2
CD8 양성 T 가전LLS CD45 + / CD3 + / CD8a + R9 * R6 * R3 * -R2
B 세포 CD45 + / CD3- / CD45RA + R7 * R3 * -R2
CD4 양성 T 세포 CD45 + / CD3 + / CD4 + R8 * R6 * R3 * - (R7 * R3 * -R2)
자연 살해 세포 CD45 + / CD3- / CD161a + R3 * - [(R2 + R6) + (R7 * R3 * -R2)]

표 2 : 세포 마커 및 게이팅 알고리즘은 각 면역 세포 서브셋을 특성화 게이팅 알고리즘 들어 '+'기호는 수단 "또는"두 개의 별개 집단들의 반응이 겹치지 않는 경우에도 함께 첨가 될 수있다.. '-'기호는 '하지'의미와 다른 정의 인구 또는 이전에 설명한 인구의 역 내에서 하나의 집단을 뺄 수 있습니다. '*'기호는 의미 '와'두 개의 반응이 겹치는 경우에만 존재하는 공간을 정의합니다. 면역 세포 서브셋 대조군 (N = 5) 엔드 포인트 II-45 이식 래트 (N = 4) 평균 범위 평균 범위 총 림프구 165.7 111.5-207.0 97.9 54.4-137.0 CD4 T 림프구 72.9 45.4-111.4 38.4 25.6-50.0 CD8 T 림프구 36.6 26.0-48.3 32.1 16.1-46 B 림프구 56.6 36.0-83.9 24.7 11.2-36.0 NK 세포 9.3 3.1-15.7 4.0 1.34-7.7 단핵구 27.1 12.7-39.0 373.3 42.4-575.8 호중구 51.4 24.3-87.0 159.2 51.1-366.0 NLR 0.3 0.18-0.42 1.8 0.94-2.66

표 3 :. 혈액 μL 당 건강한 대조군의 평균 및 면역 세포의 범위 (N = 5), II-45 주입 된 래트에서 종점 (N = 4) 결과를 나타낸다.

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Discussion

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이 논문은 흉막 중피종의 쥐 동계 동 소성 모델과 종 채혈을 통해 질병의 진행을 모니터링하기위한 간단한 방법의 생성하는 방법을 자세히 설명합니다.

II-45 모델은 석면 섬유 (13)에 피셔 344 래트를 노광에 의해 개발되었다. 이 노출 중피종의 발병 기전에 대한 호스트 석면 면역 체계의 상호 작용의 진정한 역학을 나타내고 있지만, 긴 지연 시간 (생성하는 년을 복용)으로 인한 석면 섬유에 대한 잠재적 인 노출 연구자 위험 할 수 있습니다. 동물의 흉강에 II-45 세포의 동소 이식은 면역 유능한 호스트 (11)에서 인간의 질병을 모방 암 진행의 안전하고 빠른 모델을 제공합니다. 그러나 정확한 방법과 원칙이 실험 절차가 잘 정의되어 있지 않은 동안을 준수합니다. 절차 RELA가 높은 재현성 모델 결과를 기재운영자의 경험을 상대적으로 독립적. 중요한 단계는 1 지수 증식기 및 생존 세포의 정확한 카운트에서 수확 II-45 세포이다; 2, 올바른 주입 사이트의 위치와 유지 및 동물의 복지를 모니터링, 너무 깊이 침투하여 폐에 구멍 또는 심장에 손상을, 3하지 않는 바늘을 보장한다.

II-45 세포주는 빠른 이식을 위해 준비 할 때 따라서, 세포를 계대 배양해야하며, 성장이 매일 모니터링, 성장과 문화의 모든 3-4일를 계대 필요합니다. 세포는 약 70 % 합류점 즉, 수확 할 때의 지수 성장기에서 계산되어야한다. 계산 및 이식을 위해 준비하는 동안 오히려 PBS보다 혈청이없는 배지에서 세포의 재 부유은 세포에 스트레스를 줄일 수 있습니다. 정확한 세포 수는 특히 낮은 세포 수 (예를 들면, 100 내지 1,000)에 투여 될 때, 재현성이 매우 중요하다. SUS연금은 균일하고 단일 세포 (NO 덩어리)로 구성되어야합니다. 100 μL의 주입 부피는 흉강 과도한 유체를 통해 폐의 팽창을 손상시키지 않고, 정확한 투여를 가능하게한다. 주입시 주요 단계는 정확한 위치 및 이하 12mm의 깊이로 바늘 침입을 제한한다. 주사 부위 바늘의 정확한 위치는 셀 흉강으로 아니라 복강 내로 주입되는 것을 보장하기 위해 매우 중요하다. 잘못 간 및 복강에, 격막을 통해 성장 악성 종양이 발생할 수 있습니다 너무 낮은 세포를 이식. 바늘의 침투 깊이를 제한하는 내부 장기 손상으로 인해 사망을 방지하는 것도 매우 중요하다. 이 제한은 (도시 된 바와 같이) 긴 바늘 또는 12mm 내지 5 mm의 축 길이와 짧은 바늘의 사용에 스페이서의 사용을 통해 달성 될 수있다. 우리의 손에 더 이상 반응은 발생하지세포 주입시. 그것은 모든 주입 후 바늘을 교체하는 것도 중요하다. 그렇게하지 ​​않으면 주입 라인을 따라 흉강의 성장 종양이 발생할 수 있습니다. 흉강의 외부 이러한 성장은 바늘 샤프트에 잔류 세포에 의한 확장 된 생존의 원인이 될 수 있습니다.

≥ 1 × 103 세포를 투여하는 경우에 우리의 손이 모델은 100 % 종양 생착 속도를 갖는다. II-45 중피종 모델에서 질병의 진행은 1 × 10 4 세포를 5 × 10 5 세포의 투여 량 미만 이십일 이식 할 때 적은 40 일되는, 매우 빠른입니다. 이것은 몇 가지 치료법의 전임상 시험을위한이 모델의 유용성을 제한 할 수있다. II-45 세포는 동안 상업적으로 사용할 수 없습니다은 발신자 (13)으로부터 허가를 공급 할 수 있습니다. 그러나, 동일한 주입 기술 및 원리는 세포주 REPOS에서 사용할 수있는 다른 쥐 악성 세포주들에 적용될 수있다itories은 관련 동계 쥐 균주와 일치합니다. 최적 투여 량은 세포 세포주에 따라 다양 할 수 있고, 각 라인에 대해 결정해야 할 것이다.

질병 진행 및 동물의 복지를 모니터링 종양 내부이며 크기로 모니터링 할 수 없기 때문에 곤란하다. 신체적 증상은 보이지되기 전에 거기서 그러한 NLR 또는 면역 세포 마커의 다른 변화의 증가로 이들 상태의 열화를 예측할 수 동물을 모니터링하는 방법을 개발하기 위해 노력했다. 일정한 샘플링 동물에게 고통을 최소화하여 수행 될 수 있도록 개발 된 혈액 화면 말초 혈액의 25 μl를 사용한다. 설명 샘플링 기술은 필요한 전문 지식을 얻기 위해 연습이 필요합니다. 그러나, 한 번 빠르고 최소 침습적 인 마스터.

혈액 분석에 중요한 단계 EDTA 튜브 급속 이송하여 혈액 샘플의 응고를 방지하는 것이다. 응고 샘플카운트가 부정확하므로 폐기해야합니다. 다른 중요한 단계는 세포 분석 이전에 적혈구 용해된다. 적혈구가 완전히 용해되지 않은 경우, 증가 된 배경 거짓 카운트 상승된다. 도트 플롯과 게이트의 초기 설정은 시간 소비가 있지만 설정과 템플릿이 저장되면, 분석은 약간의 조정이 필요합니다. 채용 게이팅 전략은 데이터 deconvolute하는 다중 파라미터 부울 대수 접근법을 사용한다. 독점의 공지의 조합을 이용하여 공유하면이 비율 적 비드 기반 기술 15-17의 설정 정확도와 결합 이점을 갖는다.이 여섯 차원 데이터 매트릭스 (14)에서 분리 된 세포 유형을 정의 게이트 전략의 각 라인에 대한 알고리즘을 항원 세포의 비율과 절대 μL 당 카운트로 정의 된 두 세포 유형의 목록을 가능.

그것은 점점 면역 시스템 P 것으로 인식되고있다암 (18)의 발병 기전에 중요한 역할을 낳는다. 모두 악성 세포 및 종양 세포에 의한 면역 억제를 인식하고 파괴하는 면역 시스템의 고장은 제어되지 않은 종양의 성장을 초래할 수있다. 암을 모델링 및 동계 암 모델의 주요 이점 때 따라서, 면역 능력 종양 미세 환경의 포함은 중요한 고려 사항이다. 이 면역 능력이 모델은 이종 모델에서 부족한 종양의 성장과 면역 상호 작용을위한 현실적이고 임상 적 환경을 만들 수 있습니다.

즉, 질병의 진행, 림프구 수, 단핵구 수와 NLR 동반 본 연구에서 확인 된 면역 매개 변수는 또한 불량한 인간 악성 모델의 관련성에 대한 증거를 제공 19-21 예후와 혈액 검사와 상관하는 것으로 나타났다 . 제시된 모델에서 면역 매개 변수를 모니터링의 임상 적 유용성은 재치 증가H 긴 시간 과정 (저용량)과 추가로 질병의 후기 단계에서 더 빈번한 샘플링에 의해 개선 될 수있다. 이 논문은 중피종의 모델에 초점을 맞추고 있지만, 말초 혈액 샘플링을 통해 종양 진행을 모니터링 할 수있는 능력은 모든 암 동계 모델에 이용 될 수있다. 또한, 분석은 또한 다른 치료에 면역 학적 반응을 평가하기 위해 사용될 수있다. 이전에, 우리는 신경 교종 동계 모델 (9L) 22 항암 백신 요법에 대한 응답을 모니터링하기 위해이 시험을 사용 하였다. 이 연구에서는, CD4 및 CD8 T 세포는 가장 유익한 마커이었다. 또한 다른 화학 요법 제에 내성 11 종양에 대한 면역 반응의 차이를 식별하기 위해 분석 및 II-45 중피종 모델을 사용했다. 이 연구에서, CD8 T 세포를 제외한 모든 파라미터가 큰 차이를 보였다. 여기에 기술 된 질환 진행 중에 전후 모니터링 COR 서로 다른 면역 세포 매개의 전위를 강조쥐에서 암의 동계 소성을 모델링에 착수 할 때 암의 진행과 동물의 복지와 관련이있다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
EDTA Collection tube (0.5 ml) Greiner Bio One GmbH 450480
Rat T/B/NK Cell cocktail BD Pharmingen 558509 anti-Rat CD3  APC (IgM clone 1F4), anti-Rat CD45RA Fitc (IgG1 clone OX-33), anti-Rat CD161a PE (IgG1 Clone 10/78)
anti-RAT CD8a PE  Biolegend 200608 (IgG1vClone G28)
anti-Rat CD4 FITC (Domain 1)  Biolegend 203406 (IgG1 Clone OX-38)
anti-Rat CD45 PE/Cy7  Biolegend 202214 (IgG1 Clone OX-1)
TruCount Tubes Becton Dickinson 340334 Box of 50 absolute counting tubes
RPMI 1640 media Life Technologies 11875-119
foetal bovine serum (FBS) Scientifix FBS500-S (lot# 010101-1)
trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
PBS tablets Medicago AB 09-9400-100
23Gx1¼ Needle Becton Dickinson 302008
1 ml Syringe Becton Dickinson 302 100
Fischer 344 Rat Animal Resources Centre, Perth Australia F344
I.S.O (Isoflurane USP) Veterinary Companys Australia (VCA)  B7058
II-45 Rat Mesothelioma line Zurich University Note: The cell line was given as a gift and is not commercially available at the ATCC
FACSCalibur 4 color Becton Dickinson 342975
TRIS-HCL SIGMA T3253
Ammonium Chloride SIGMA 9718
Anaesthetic Machine (The stinger) Advanced Anaesthesia specialists #00449

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References

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II-45 동계 쥐의 Mesothelioma 모델에서 소성을 주입 및 주변 면역 세포 모니터링
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Weir, C. J., Hudson, A. L., Peters, L., Howell, V. M. Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model. J. Vis. Exp. (104), e53019, doi:10.3791/53019 (2015).More

Weir, C. J., Hudson, A. L., Peters, L., Howell, V. M. Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model. J. Vis. Exp. (104), e53019, doi:10.3791/53019 (2015).

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