Orthotopic Implantation och perifera immunceller Övervakning av II-45 syngena Rat mesoteliom Modell
Summary
Genereringen av en ortotopisk råttmodell av pleura malignt mesoteliom genom implantering av II-45 mesoteliom celler i den pleurala håligheten hos immunkompetenta råttor presenteras. En flödescytometrisk metod för att analysera sju immuncellundergrupper i dessa djur från ett prov 25 | al blod beskrivs också.
Abstract
Den enorma våg av intresse för immunbaserade behandlingar för cancer såsom vacciner och immun checkpoint-hämmare, och ökad förståelse för den roll av tumören mikromiljö i behandlingssvar, tillsammans peka på behovet av immunkompetenta orthotopic modeller för preklinisk testning av dessa nya terapier. Denna uppsats visar hur man kan upprätta en orthotopic immunkompetenta modell av pleural malignt mesoteliom råtta. Övervakning sjukdomsprogression i orthotopic modeller förvirrad av den inre placeringen av tumörer. Till längdled övervaka sjukdomsutveckling och dess effekt på cirkulerande immunceller i denna och andra råttmodeller av cancer, ett enda rör flödescytometri analys kräver endast 25 pl helblod beskrivs. Detta ger noggrann kvantifiering av sju immunparametrar: total lymfocyter, monocyter och neutrofiler, samt T-cellunderuppsättningar CD4- och CD8, B-celler och naturliga mördarceller. Olika subsets av dessa parametrar är användbara i olika situationer och modeller, med neutrofila till lymfocyter förhållande med den största nyttan för att övervaka sjukdomsprogression i mesoteliom modellen. Analysera cirkulerande immunceller nivåer med hjälp av denna enda rör Metoden kan även hjälpa till att övervaka svaret på immunbaserade behandlingar och förstå de bakomliggande mekanismer som leder till framgång eller misslyckande i behandlingen.
Introduction
Malignt mesoteliom (MM) är en aggressiv malignitet som härrör från transformerade celler i membranet (mesothelium) som linjer lungan och bukhålan, hjärta och inre könsorgan, och är den vanligaste primära tumör i lungan hålrum eller pleura 1,2 . Exponering för asbestfibrer står för 80% av all MM, och medan förbud mot användning av asbest infördes för flera årtionden sedan i de flesta västländer, har dess utbredda användning i samhället lämnat ett dödligt arv. Världshälsoorganisationen har uppskattat att 107.000 människor i världen dör varje år av asbestrelaterade sjukdomar, med dödstal fortsätter att öka. En ny icke-yrkes incidens vågen också fram och det finns liten förståelse för när och på vilken nivå detta kommer topp tre.
De flesta människor med MM diagnostiseras sent när systemisk kemoterapi utgör en av de enda livskraftiga alternativ 4. De flesta effective kemoterapi och nuvarande "standardbehandling" (pemetrexed i kombination med cisplatin 5) identifierades över 10 år sedan. Men misslyckas med denna behandling är oundviklig och det finns inga beprövade andra alternativ linje, lämnar patienter med en bister prognos och medianöverlevnad på endast 12 månader 2. Därför finns det ett akut ej uppfyllt behov av mer effektiva behandlingar. Trots undersökning av ett antal nya behandlingar i kliniska prövningar ingen har medfört förändringar i praktiken. Detta beror delvis på den låga (5%) överföring av prekliniska resultat, i allmänhet i modeller xenograft mus, till den kliniska inställning 6-8. Sådana modeller inte troget rekapitulera de komplexa aspekterna av tumörens mikromiljö som förekommer i icke-fysiologiska platser, ofta i frånvaro av ett fungerande immunsystem 9.
Syngena orthotopic modeller skapar en betydligt mer realistisk tumörmiljön än commonly används subkutana xenograft-modeller som tumörerna uppträder i den korrekta fysiologiska läge med ett intakt immunsystem 10,11. Den större storleken på råttan ökar dess användning som en gnagare sjukdomsmodell, särskilt i läkemedelsstudier där serie blod drar krävs för att bedöma behandlingssvar och toxicitet 12. Vidare där övervakning sjukdomsförloppet är i modeller svår på grund av placeringen av tumörer (t.ex. i pleurahålan), möjlighet att övervaka sjukdomsförlopp med användning av faktorer funna i cirkulationen är mycket attraktiv. Alstringen av en syngen ortotopisk modell av pleuramesoteliom användning immunkompetenta råttor beskrivs. Dessutom är ett enkelt och relativt icke-invasiv metod för att övervaka pleura sjukdomsprogression genom att mäta cirkulerande immunceller beskrivs också.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna uppsats detaljer en metod för generering av en rått syngen ortotopisk modell av pleuramesoteliom och en enkel metod för att övervaka sjukdomsförloppet genom längsgående blodprovtagning.
II-45-modellen har utvecklats genom att exponera Fischer 344 råttor för asbestfibrer 13. Även om denna exponering representerar de verkliga dynamiken i värdasbestimmunsystemet interaktioner för mesoteliom patogenes, den har en lång fördröjning (ta år att generera) och kan vara…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The syngeneic rat mesothelioma II-45 cell line was a kind gift from A/Prof. Emanuela Felley-Bosco, Zurich University.
Materials
| EDTA Collection tube (0.5ml) | Greiner Bio One GmbH | 450480 | |
| Rat T/B/NK Cell cocktail | BD Pharmingen | 558509 | anti-Rat CD3 APC (IgM clone 1F4), anti-Rat CD45RA Fitc (IgG1 clone OX-33), anti-Rat CD161a PE (IgG1 Clone 10/78) |
| anti-RAT CD8a PE | Biolegend | 200608 | (IgG1vClone G28) |
| anti-Rat CD4 FITC (Domain 1) | Biolegend | 203406 | (IgG1 Clone OX-38) |
| anti-Rat CD45 PE/Cy7 | Biolegend | 202214 | (IgG1 Clone OX-1) |
| TruCount™ Tubes | Becton Dickinson | 340334 | Box of 50 absolute counting tubes |
| RPMI 1640 media | Life Technologies | 11875-119 | |
| foetal bovine serum (FBS) | Scientifix | FBS500-S (lot# 010101-1) | |
| trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| PBS tablets | Medicago AB | 09-9400-100 | |
| 23Gx1¼ Needle | Becton Dickinson | 302008 | |
| 1mL Syringe | Becton Dickinson | 302 100 | |
| Fischer 344 Rat | Animal Resources Centre, Perth Australia | F344 | |
| I.S.O (Isoflurane USP) | Veterinary Companys Australia (VCA) | B7058 | |
| II-45 Rat Mesothelioma line | Zurich University | Note: The cell line was given as a gift and is not commercially available at the ATCC | |
| FACSCalibur™ 4 colour | Becton Dickinson | 342975 | |
| TRIS-HCL | SIGMA | T3253 | |
| Ammonium Chloride | SIGMA | 9718 | |
| Anaesthetic Machine (The stinger) | Advanced Anaesthesia specialists | #00449 |
References
- Kao, S. C., et al. Malignant mesothelioma. Intern Med J. 40 (11), 742-7450 (2010).
- Zucali, P. A., et al. Advances in the biology of malignant pleural mesothelioma. Cancer Treat Rev. 37 (7), 543-558 (2011).
- Olsen, N. J., et al. Increasing incidence of malignant mesothelioma after exposure to asbestos during home maintenance and renovation. Med J Aust. 195 (5), 271-274 (2011).
- Zucali, P. A., et al. Thymidylate synthase and excision repair cross-complementing group-1 as predictors of responsiveness in mesothelioma patients treated with pemetrexed/carboplatin. Clin Cancer Res. 17 (8), 2581-2590 (2011).
- Vogelzang, N. J., et al. Phase III study of pemetrexed in combination with cisplatin versus cisplatin alone in patients with malignant pleural mesothelioma. J Clin Oncol. 21 (14), 2636-2644 (2003).
- Lowenstein, P. R., Castro, M. G. Uncertainty in the translation of preclinical experiments to clinical trials. Why do most phase III clinical trials fail?. Curr Gene Ther. 9 (5), 368-374 (2009).
- Kamb, A. What’s wrong with our cancer models. Nat Rev Drug Discov. 4 (2), 161-165 (2005).
- Yakisich, J. S. An Algorithm for the Preclinical Screening of Anticancer Drugs Effective against Brain Tumors. ISRN Pharmacol. 2012, 513580 (2012).
- Basu, D., Herlyn, M. Defining microenvironments within mouse models that enhance tumor aggressiveness. Cancer Biol Ther. 8 (4), 380-381 (2009).
- Abolhassani, M., et al. Screening of well-established drugs targeting cancer metabolism: reproducibility of the efficacy of a highly effective drug combination in mice. Invest New Drugs. 4 (4), 1331-1342 (2011).
- Hudson, A. L., et al. Establishing a panel of chemo-resistant mesothelioma models for investigating chemo-resistance and identifying new treatments for mesothelioma. Sci Rep. 4, 6152 (2014).
- Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats!. Dis Model Mech. 2 (5-6), 206-210 (2009).
- Craighead, J. E., et al. Characteristics of tumors and tumor cells cultured from experimental asbestos-induced mesotheliomas in rats. Am J Pathol. 129 (3), 448-462 (1987).
- Hunter, S. D., et al. Lymphocyte subset analysis by Boolean algebra: a phenotypic approach using a cocktail of 5 antibodies and 3 color immunofluorescence. Cytometry. 15 (3), 258-266 (1994).
- Brando, B., et al. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry. 42 (6), 327-346 (2000).
- Schnizlein-Bick, C. T., et al. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).
- Gajkowska, A., et al. Flow cytometric enumeration of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells in leukapheresis product and bone marrow for clinical transplantation: a comparison of three methods. Folia Histochem Cytobiol. 44 (1), 53-60 (2006).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Kao, S. C., et al. High blood neutrophil-to-lymphocyte ratio is an indicator of poor prognosis in malignant mesothelioma patients undergoing systemic therapy. Clin Cancer Res. 16 (23), 5805-5813 (2010).
- Kao, S. C., et al. Validation of prognostic factors in malignant pleural mesothelioma: a retrospective analysis of data from patients seeking compensation from the New South Wales dust diseases board. Clin Lung Cancer. 14 (1), 70-77 (2013).
- Burt, B. M., et al. Circulating and tumor-infiltrating myeloid cells predict survival in human pleural mesothelioma. Cancer. 117 (22), 5234-5244 (2011).
- Weir, C., et al. Streptavidin: a novel immunostimulant for the selection and delivery of autologous and syngeneic tumor vaccines. Cancer Immunol Res. 2 (5), 469-479 (2014).
