Orthotopisk Implantation og perifert immuncelle Overvågning i II-45 Syngene Rat mesotheliom Model
Summary
Dannelsen af en ortotopisk rottemodel for pleural malignt mesotheliom efter implantation af II-45 mesotheliom celler i pleurahulen af immunkompetente rotter præsenteres. En flowcytometrisk metode til at analysere syv immuncelleundergrupper i disse dyr fra en 25 pi blodprøve er også beskrevet.
Abstract
Den enorme stigning i interesse i immun-baserede behandlinger for cancer, såsom vacciner og immune checkpoint inhibitorer og øget forståelse af den rolle, tumormikromiljøet i behandlingsrespons, tilsammen peger på behovet for immun-kompetente ortotopisk modeller for præklinisk afprøvning af disse nye behandlinger. Dette papir viser, hvordan at etablere en orthotopisk immun-kompetent rotte model af pleura malignt mesotheliom. Overvågning sygdomsprogression i ortotopisk modeller er forvirret af den interne placering af tumorer. Til længderetningen overvåge sygdommen og dens virkning på cirkulerende immunceller i denne og andre rottemodeller af cancer, et enkelt rør flowcytometriassayet kræver kun 25 pi helblod beskrives. Dette giver nøjagtig kvantificering af syv immunparametre: Samlet lymfocytter, monocytter og neutrofiler, samt T-celle-undergrupper CD4 og CD8, B-celler og naturlige dræberceller. Forskellige subsets af disse parametre er nyttige i forskellige forhold og modeller, med neutrofil til lymfocyt-forhold har den største anvendelighed til overvågning sygdomsprogression i mesotheliom model. Analyse cirkulerende immun celle niveauer ved hjælp af denne enkelt rør metode kan også hjælpe med at overvåge responsen på immun-baserede behandlinger og forstå de underliggende mekanismer, der fører til succes eller fiasko af behandlingen.
Introduction
Malignt mesotheliom (MM) er en aggressiv malignitet, der opstår fra transformerede celler i membranen (mesothelium) at linjer lungerne og bughule, hjerte og indre kønsorganer, og er den mest almindelige primære tumor i lungerne hulrum eller lungehinden 1,2 . Udsættelse for asbestfibre udgør 80% af al MM, og mens forbud mod brug af asbest blev indført årtier siden i de fleste vestlige lande, har den udbredte anvendelse i samfundet efterladt en dødelig arv. WHO har anslået, at 107.000 mennesker verden over dør hvert år af asbestrelaterede sygdomme, med dødelighed fortsætter med at stige. En ny ikke-erhvervsmæssig forekomst bølge også at opstå, og der er lidt forståelse af, hvornår og på hvilket niveau det vil toppe 3.
De fleste mennesker med MM er diagnosticeret sent, når systemisk kemoterapi udgør en af de eneste levedygtige muligheder 4. De fleste effective kemoterapi og nuværende "standard for pleje« (pemetrexed sammen med cisplatin 5) blev identificeret over 10 år siden. Men svigt af denne behandling er uundgåelig, og der er ingen dokumenterede anden linje muligheder, der forlader patienter med en grum prognose og median overlevelse på kun 12 måneder 2. Derfor er der et presserende uopfyldt behov for mere effektive behandlinger. På trods af den undersøgelse af en række nye behandlinger i kliniske forsøg ingen har medført ændringer i praksis. Dette skyldes til dels lav (5%) overførsel af prækliniske resultater, udføres generelt i xenograft musemodeller, til den kliniske indstilling 6-8. Sådanne modeller ikke trofast rekapitulere de komplekse aspekter af tumormikromiljøet forekommer i ikke-fysiologiske steder, ofte i fravær af et fungerende immunsystem 9.
Syngene ortotopisk modeller skaber et betydeligt mere realistisk tumor miljøet end commonly anvendes subkutane xenograftmodeller som forekommer tumorer i den korrekte fysiologiske placering med et intakt immunsystem 10,11. Den større størrelse af rotte forbedrer dets anvendelse som en gnaver sygdomsmodel, især i narkotika undersøgelser, hvor serielle blodprøver skal vurdere behandlingsrespons og toksicitet 12. Endvidere i modeller, hvor overvågning sygdomsprogression er vanskelig på grund af placeringen af tumorer (såsom i pleurahulen), muligheden for at overvåge sygdomsprogression ved hjælp af faktorer findes i cirkulationen, er yderst attraktiv. Frembringelsen af en syngen ortotopisk model af pleural mesotheliom hjælp immun-kompetente rotter er beskrevet. Desuden er en let og relativt ikke-invasiv metode til overvågning af pleural sygdomsprogression ved at måle cirkulerende immunceller også beskrevet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette papir beskriver en fremgangsmåde til generering af en rotte syngen model af ortotopisk pleural mesotheliom og en simpel metode til overvågning af sygdomsprogression ved langsgående blodprøvetagning.
Den II-45 modellen blev udviklet ved at udsætte Fischer 344 rotter for asbestfibre 13. Selv om denne eksponering repræsenterer den sande dynamik host-asbest-immunsystem interaktioner for lungehindekræft patogenese, det har en lang forsinkelse tid (under år at generere), o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The syngeneic rat mesothelioma II-45 cell line was a kind gift from A/Prof. Emanuela Felley-Bosco, Zurich University.
Materials
| EDTA Collection tube (0.5ml) | Greiner Bio One GmbH | 450480 | |
| Rat T/B/NK Cell cocktail | BD Pharmingen | 558509 | anti-Rat CD3 APC (IgM clone 1F4), anti-Rat CD45RA Fitc (IgG1 clone OX-33), anti-Rat CD161a PE (IgG1 Clone 10/78) |
| anti-RAT CD8a PE | Biolegend | 200608 | (IgG1vClone G28) |
| anti-Rat CD4 FITC (Domain 1) | Biolegend | 203406 | (IgG1 Clone OX-38) |
| anti-Rat CD45 PE/Cy7 | Biolegend | 202214 | (IgG1 Clone OX-1) |
| TruCount™ Tubes | Becton Dickinson | 340334 | Box of 50 absolute counting tubes |
| RPMI 1640 media | Life Technologies | 11875-119 | |
| foetal bovine serum (FBS) | Scientifix | FBS500-S (lot# 010101-1) | |
| trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| PBS tablets | Medicago AB | 09-9400-100 | |
| 23Gx1¼ Needle | Becton Dickinson | 302008 | |
| 1mL Syringe | Becton Dickinson | 302 100 | |
| Fischer 344 Rat | Animal Resources Centre, Perth Australia | F344 | |
| I.S.O (Isoflurane USP) | Veterinary Companys Australia (VCA) | B7058 | |
| II-45 Rat Mesothelioma line | Zurich University | Note: The cell line was given as a gift and is not commercially available at the ATCC | |
| FACSCalibur™ 4 colour | Becton Dickinson | 342975 | |
| TRIS-HCL | SIGMA | T3253 | |
| Ammonium Chloride | SIGMA | 9718 | |
| Anaesthetic Machine (The stinger) | Advanced Anaesthesia specialists | #00449 |
References
- Kao, S. C., et al. Malignant mesothelioma. Intern Med J. 40 (11), 742-7450 (2010).
- Zucali, P. A., et al. Advances in the biology of malignant pleural mesothelioma. Cancer Treat Rev. 37 (7), 543-558 (2011).
- Olsen, N. J., et al. Increasing incidence of malignant mesothelioma after exposure to asbestos during home maintenance and renovation. Med J Aust. 195 (5), 271-274 (2011).
- Zucali, P. A., et al. Thymidylate synthase and excision repair cross-complementing group-1 as predictors of responsiveness in mesothelioma patients treated with pemetrexed/carboplatin. Clin Cancer Res. 17 (8), 2581-2590 (2011).
- Vogelzang, N. J., et al. Phase III study of pemetrexed in combination with cisplatin versus cisplatin alone in patients with malignant pleural mesothelioma. J Clin Oncol. 21 (14), 2636-2644 (2003).
- Lowenstein, P. R., Castro, M. G. Uncertainty in the translation of preclinical experiments to clinical trials. Why do most phase III clinical trials fail?. Curr Gene Ther. 9 (5), 368-374 (2009).
- Kamb, A. What’s wrong with our cancer models. Nat Rev Drug Discov. 4 (2), 161-165 (2005).
- Yakisich, J. S. An Algorithm for the Preclinical Screening of Anticancer Drugs Effective against Brain Tumors. ISRN Pharmacol. 2012, 513580 (2012).
- Basu, D., Herlyn, M. Defining microenvironments within mouse models that enhance tumor aggressiveness. Cancer Biol Ther. 8 (4), 380-381 (2009).
- Abolhassani, M., et al. Screening of well-established drugs targeting cancer metabolism: reproducibility of the efficacy of a highly effective drug combination in mice. Invest New Drugs. 4 (4), 1331-1342 (2011).
- Hudson, A. L., et al. Establishing a panel of chemo-resistant mesothelioma models for investigating chemo-resistance and identifying new treatments for mesothelioma. Sci Rep. 4, 6152 (2014).
- Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats!. Dis Model Mech. 2 (5-6), 206-210 (2009).
- Craighead, J. E., et al. Characteristics of tumors and tumor cells cultured from experimental asbestos-induced mesotheliomas in rats. Am J Pathol. 129 (3), 448-462 (1987).
- Hunter, S. D., et al. Lymphocyte subset analysis by Boolean algebra: a phenotypic approach using a cocktail of 5 antibodies and 3 color immunofluorescence. Cytometry. 15 (3), 258-266 (1994).
- Brando, B., et al. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry. 42 (6), 327-346 (2000).
- Schnizlein-Bick, C. T., et al. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).
- Gajkowska, A., et al. Flow cytometric enumeration of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells in leukapheresis product and bone marrow for clinical transplantation: a comparison of three methods. Folia Histochem Cytobiol. 44 (1), 53-60 (2006).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Kao, S. C., et al. High blood neutrophil-to-lymphocyte ratio is an indicator of poor prognosis in malignant mesothelioma patients undergoing systemic therapy. Clin Cancer Res. 16 (23), 5805-5813 (2010).
- Kao, S. C., et al. Validation of prognostic factors in malignant pleural mesothelioma: a retrospective analysis of data from patients seeking compensation from the New South Wales dust diseases board. Clin Lung Cancer. 14 (1), 70-77 (2013).
- Burt, B. M., et al. Circulating and tumor-infiltrating myeloid cells predict survival in human pleural mesothelioma. Cancer. 117 (22), 5234-5244 (2011).
- Weir, C., et al. Streptavidin: a novel immunostimulant for the selection and delivery of autologous and syngeneic tumor vaccines. Cancer Immunol Res. 2 (5), 469-479 (2014).
