Orthotopic Implantação e Acompanhamento Peripheral Imune celular no Modelo II-45 Rat Singênico mesotelioma

Summary

A geração de um modelo de rato ortotópico de mesotelioma pleural maligno por implantação de II-45 células de mesotelioma na cavidade pleural de ratos imuno-competentes é apresentado. Um método de citometria de fluxo para analisar sete subconjuntos de células imunitárias em animais a partir destes uma amostra de sangue de 25 uL é também descrito.

Abstract

O enorme aumento do interesse em tratamentos de base imunológica para o cancro, tais como vacinas e inibidores de checkpoint imunes, e o aumento da compreensão do papel do microambiente do tumor, em resposta ao tratamento, apontar em conjunto para a necessidade de modelos ortotópicos imuno-competentes para testes pré-clínicos destas novas terapias. Este artigo demonstra como criar um modelo de rato imuno-competente orthotopic de mesotelioma maligno pleural. Monitorizar a progressão da doença em modelos ortotópicos é confundida com a localização interna dos tumores. Para monitorar a progressão da doença longitudinalmente e seu efeito sobre as células imunitárias, neste e noutros modelos de rato de cancro circulantes, fluir um único tubo de ensaio de citometria requerendo apenas 25 ul de sangue total é descrita. Isto proporciona a quantificação precisa de sete parâmetros imunológicos: linfócitos totais, neutrófilos e monócitos, bem como os subconjuntos de células T CD4 e CD8, as células B e as células assassinas naturais. Diferentes subsETS destes parâmetros são úteis em diferentes circunstâncias e modelos, com a proporção de linfócitos para neutrófilos com a maior utilidade para a monitorização progressão da doença no modelo de mesotelioma. Analisando os níveis de células imunológicas que usam este método único tubo pode também auxiliar no acompanhamento da resposta aos tratamentos de base imunológica e compreender os mecanismos subjacentes que levam ao sucesso ou fracasso do tratamento em circulação.

Introduction

Mesotelioma maligno (MM) é um tumor maligno agressivo que surge a partir de células transformadas, em que a membrana (mesotélio) que reveste o pulmão e cavidades abdominais, coração e órgãos reprodutivos internos, e é o tumor primário mais comum do pulmão ou cavidade pleura ^1,2 . A exposição a fibras de amianto é responsável por 80% de todo o MM, e enquanto a proibição de utilização de amianto foram introduzidos há décadas na maioria dos países ocidentais, a sua utilização generalizada na comunidade deixou um legado mortal. A Organização Mundial de Saúde estima que 107.000 pessoas no mundo morrem anualmente de doenças relacionadas ao amianto, com taxas de mortalidade continuam a aumentar. Uma nova onda de incidência não-ocupacional também está surgindo e há pouca compreensão de quando, e em que nível este atingirá o pico ^3.

A maioria das pessoas com MM são diagnosticados tardiamente, quando a quimioterapia sistêmica representa uma das únicas opções viáveis ^​​4. Maioria effective quimioterapia e "padrão de cuidado" atual (pemetrexed em combinação com cisplatina ⁵⁾ foi identificado mais de 10 anos atrás. No entanto falha deste tratamento é inevitável e não há opções de segunda linha comprovadas, deixando os pacientes com um prognóstico sombrio e sobrevida média de apenas 12 ^meses 2. Portanto, existe uma necessidade não satisfeita urgente de tratamentos mais eficazes. Apesar do exame de uma série de novas terapias em ensaios clínicos nenhum resultou em mudanças na prática. Isto é devido, em parte, à baixa (5%) transferência dos resultados pré-clínicos, geralmente realizados em modelos de xenoenxerto de ratinho, para definir o clínico ^6-8. Tais modelos não recapitular fielmente os aspectos complexos do microambiente do tumor que ocorre em locais não-fisiológicos, frequentemente, na ausência de um sistema imune funcional ^9.

Modelos ortotópicos sing�icos criar um ambiente de tumor significativamente mais realista do que o commonly usado modelos de xenotransplante subcutâneos como os tumores ocorrem no local fisiológica correta com um ^10,11 sistema imunológico intacto. Quanto maior o tamanho do rato aumenta a sua utilização como um modelo de doença de roedores, especialmente em estudos de drogas onde o sangue de série empates são necessários para avaliar a resposta ao tratamento e toxicidade ^12. Além disso, em modelos nos quais monitorar a progressão da doença é difícil, devido à localização dos tumores (tal como na cavidade pleural), a capacidade de monitorizar a progressão da doença utilizando factores encontrados na circulação é extremamente atraente. A geração de um modelo ortotópico singeneicos de mesotelioma pleural utilizando ratos imuno-competentes é descrito. Além disso, um método fácil e relativamente não invasivo para monitorizar a progressão da doença pleural medindo circulantes células do sistema imunológico, também é descrito.

Protocol

Todos os procedimentos que envolvem animais foram realizados em conformidade com as recomendações contidas no Código de Prática australiano para o Cuidado e Utilização de animais para fins científicos. O protocolo deste estudo foi aprovado pelo Comitê Animal Care e Hospital de Ética da Royal North Shore. Feminino ratos Fischer 344 (F344, 150-200 g) foram mantidos no Centro de Kearns, Instituto Kolling em condições padrão (12 horas de luz / ciclos escuros e livre acesso a comida e água). <p class="jove_c…

Representative Results

O método utilizado neste trabalho para a geração de um modelo ortotópico de mesotelioma pleural utilizando células II-45 resultou em animais sucumbindo ao mesotelioma em um prazo reprodutível e rápida, sem ratos morrendo devido ao método de implantação. A titulação do número de células implantadas determinado que 1x 10 3 células foi o número mínimo requerido para um modelo totalmente penetrante (100% enxerto). O número diferente de células implantadas nos ratos alterou o curso de tempo da d…

Discussion

Este artigo apresenta um método para a geração de um modelo de rato singeneico ortotópico de mesotelioma pleural e um método simples para monitorizar a progressão da doença através de amostragem de sangue longitudinal.

O modelo II-45 foi desenvolvido expondo 344 ratos Fischer às fibras de amianto ^13. Embora esta exposição representa a verdadeira dinâmica de interações do sistema-host-imune amianto para mesotelioma patogênese, tem um tempo de latência longo (levando…

Materials

EDTA Collection tube (0.5ml)	Greiner Bio One GmbH	450480
Rat T/B/NK Cell cocktail	BD Pharmingen	558509	anti-Rat CD3  APC (IgM clone 1F4), anti-Rat CD45RA Fitc (IgG1 clone OX-33), anti-Rat CD161a PE (IgG1 Clone 10/78)
anti-RAT CD8a PE	Biolegend	200608	(IgG1vClone G28)
anti-Rat CD4 FITC (Domain 1)	Biolegend	203406	(IgG1 Clone OX-38)
anti-Rat CD45 PE/Cy7	Biolegend	202214	(IgG1 Clone OX-1)
TruCount™ Tubes	Becton Dickinson	340334	Box of 50 absolute counting tubes
RPMI 1640 media	Life Technologies	11875-119
foetal bovine serum (FBS)	Scientifix	FBS500-S (lot# 010101-1)
trypsin-EDTA	Life Technologies	15400-054
PBS tablets	Medicago AB	09-9400-100
23Gx1¼ Needle	Becton Dickinson	302008
1mL Syringe	Becton Dickinson	302 100
Fischer 344 Rat	Animal Resources Centre, Perth Australia	F344
I.S.O (Isoflurane USP)	Veterinary Companys Australia (VCA)	B7058
II-45 Rat Mesothelioma line	Zurich University		Note: The cell line was given as a gift and is not commercially available at the ATCC
FACSCalibur™ 4 colour	Becton Dickinson	342975
TRIS-HCL	SIGMA	T3253
Ammonium Chloride	SIGMA	9718
Anaesthetic Machine (The stinger)	Advanced Anaesthesia specialists	#00449