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Medicine

分子探针的优化,以确定细胞死亡的光合生物( doi: 10.3791/53036 Published: January 29, 2016

Summary

微生物群含有大量细胞的异质性,它可以决定整体行为。通过流式细胞分子探针分析可以决定细胞的生理状态,然而它的应用物种之间变化。本研究提供了一个协议,以精确地确定一个蓝藻群体内的细胞死亡,而不低估或记录假阳性结果。

Abstract

在野外和实验室研究微生物亚群已经示出,以显示高的异质性的形态和生理参数。确定微生物细胞的实时状态超出活的或死的类型,如微生物可以处于休眠状态,由此细胞的分裂和代谢活性被降低存在。鉴于需要检测和微生物的定量,流式细胞术(FCM)用分子探针提供了一种快速,准确的方法,以帮助确定总体人口生存能力。通过使用SYTOX绿色和橙色SYTOX模型中的蓝藻铜绿微囊藻检测细胞膜的完整性,我们开发了单细胞死亡率迅速指示的转移方法。在该刊物中使用的分子探针将被分别称为绿色或橙色核酸探针(虽然也有其他的产品与具有共同行动的一个可比较的方式类似激发和发射波长N,我们专门请参考前面提到的探针)。利用分子探针协议物种之间有所不同,在浓度和温育时间不同的主要。根据这一协议,载于微囊藻绿色核酸探针孵育30分钟,并在1μM橙色核酸探针10分钟后,经过优化的0.5μM的浓度。在这两个探测器的浓度低于规定的优化导致了在报告细胞的细胞膜破坏。相反地​​,5μM的浓度和较高的两种探针表现出型非特异性染色的,由此“活的”细胞产生的目标的荧光,导致“非活”的细胞数目过表示。阳性对照(热灭活)提供的可检验的死亡生物量,虽然在控制一代的适当性还有待讨论。通过展示步骤的逻辑顺序进行优化绿色和橙色核酸探针,我们去monstrate如何创建,可以用来有效地分析蓝藻生理状态的协议。

Introduction

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细胞是一个复杂的系统,它不断地通过修改的生理参数和改变其功能响应环境。无论是在自然和实验室等基因微生物种群的种群动态是由亚群的发展受到影响,即使在相对 ​​恒定的环境条件发生1 - 3。天然微生物群落的变异性的出现是由于环境条件的高度可变的性质。这些有时随机过程随后产生亚群是非常不同的人群的平均水平。最近的证据表明,这些亚群生理反应不同的环境条件,并且能够产生信号的化合物或抑制剂显着影响,并影响整体人口3,4。

建立以群体内定义的异质性的方法,关键是未derstanding在各种环境中的微生物的生态和建设时滋扰蓝藻知识,如有毒的微囊 ,从而影响严重人类水安全性。物种如鱼腥响应于环境波动显示形态异质性,开发专门细胞如异形是必不可少和akinetes 2。与此相反, 微囊细胞不期间应激反应显示明显的形态的异质性。可行的和非存活细胞之间的区别是生理分化的最重要的方面,并且允许更好地理解微生物种群动态的。然而,细菌存活本身的概念性的问题仍然是困难和特征1,5,6很差。

流式细胞术(FCM)是分析单个细胞的可靠和快速的方法。为了提高单细胞生理的理解通过FCM迟缓,分子探针已被用于区分一个号码代谢和生化过程7。这导致了物种对细胞和群体水平增加的知识和反过来帮助水资源管理8,9。然而,在生物分子探针摄取和排出方面由于孔隙和泵在蜂窝壁和细胞膜,这都导致了许多分子探针设计和协议实现6,10,11不同。可用于商业和研究用途分子探针通常与一个通用的协议,该协议可以是适用于非常不同的细胞类型提供。我们必须在传输的一种细胞类型开发协议, 另外 6非常谨慎,因此它是一个重要的任务,使用前有效地优化分子探针。

绿色和橙色核酸探针结合于两个双和单链核酸与最小化的基本选择ivity和用于评估细胞质膜完整性。绿色核酸探针具有显着改善的细胞标记的荧光信号相对于其它分子探针,如碘化丙啶-基化合物12,它也可以作为细胞活力的指标。术语“细胞活力”这里假定DNA降解的细胞膜完整性的丧失后出现。所述核酸探针是不对称花青染料具有三个正电荷和不能进入细胞胎膜完整特征的浓度下,在这两种真核11,1314,15原核生物有机体。的核酸探针与核酸的结合可导致多达从内源性信号荧光发射中的细胞,具有其膜完整性破坏一个> 500倍增加。虽然分子探针如绿色核酸探针可以是单细胞生理学的良好指标,有必要吨Ø优化每个探头的预定目标生物体,如孵化时间从7分钟变化-在微囊藻实验中0.5微米单独15 - - 30分钟,浓度为0.1μM19。

在这里,我们提出了一个协议,以优化绿色的流式细胞检测和比较新的橙核酸探针(其至今尚未测试的蓝藻种类微囊藻 )。下面发达方法然后可以转移到其他物种和用作其它分子探针优化协议,从而增加微生物的理解及其生态行为的平台。

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Protocol

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1.准备分子探针和流式细胞仪

  1. 稀释储备溶液的核酸探针,它们被提供在二甲基亚砜(DMSO)5mM溶液至所需浓度的等分试样的超纯过滤 H 2 O.
  2. 存储核酸探针在-5℃,与黑暗的条件- 25°C,直到使用。
  3. 打开流式细胞仪和负载软件包(见表材料/设备的FCM规格)。
  4. 放置在进样探针(SIP)的空溶血管(12×75毫米),点击疏通,然后再冲水启动FCM清洗过程。
    :为SIP一些样品台可容纳多种类型的管子,包括离心管中。在FCM装置中使用的分子探针稀释剂和鞘流体是从分析级“1型”0.22μm滤膜过滤源。
  5. 地点15分钟和流体速度快(或> 66微升/分钟的流速) -一个新鲜溶血管与2ml超纯过滤H 2 O的的SIP上,为10设定时间限制。
  6. 选择一个新的数据单元,把相关阈值,荧光和光散射渠道,降低背景噪音,然后单击“运行”。
  7. 如果每秒的总事件不是低于制造商的建议,然后运行2ml样品的去污溶液对快2分钟,然后重复步骤1.4&1.5。
    :请检查制造商对FCM建议启动清洁的协议,因为他们可以型号而有所不同。测试对于特定阈值也需要在与FCM模型线作为一些设备允许用户申请的电压增益,以光电倍增管(PMT)增强或减少从光检测器记录的电信号。在这个experi使用的FCM模型换货有固定电压光电倍增管和使用80,000前向光散射(FSC-H)的阈值以排除颗粒小于2.0微米和电子噪音。

2.准备工作文化与初始细胞计数

  1. 高压釜98毫升超纯过滤 H 2 O和2 ml的藻媒体(50倍 ​​浓度)在250ml烧杯中20分钟的在120℃。
  2. 微囊藻 (PCC 7806)的在一个高稳定状态密度地点2毫升样品的初始单一到SIP下的管。分解任何集落形成涡旋或超声处理20并通过光学显微镜确认均匀分散细胞。
    :过度暴露于超声波可导致细胞裂解,应谨慎使用。因为超声波可以折叠气囊产出,如侧向光散射(如物种,如微囊藻中)(SSC-H)的强度可以变得更SEnsitive。
  3. 内将FCM软件,选择直方图来记录从正向光散射(FSC-H)数据,并通过点击“登录”,以查看在轴线对数标尺配置情节规格。
  4. 在一个单独的输出,选择另一个直方图(登录轴)来记录自然荧光,如附件光合色素藻蓝蛋白(FL4-H,675±12.5纳米),在微囊藻找到。
  5. 使用能够激发藻蓝蛋白和一个检测器,它可以从所得荧光过滤排放的光源。
    :光合色素如叶绿素可以兴奋与常用的488纳米的蓝色激光,而藻蓝蛋白是奋达600纳米,只会有一个红色的光源21进行检测。检查与流式细胞仪的制造商为激励光源和发射检测器的光谱,这里既一个488纳米,640纳米的激光被连同用于一个675±12.5 nm的光学滤波器。
  6. 用于记录的最接近目标生物体(10微米)和相对慢的流速(14微升/分钟)的芯尺寸的最高分辨率选择设置。
    注:最佳分辨率样品应按照制造商每秒事件的建议下运行。
  7. 采集数据前使用门槛,门出光散射和/或荧光信号是由电子背景噪音或细胞样品碎片造成的。
  8. 选择一个新的数据单元,创建具有FSC-H和SSC-H参数对数标度的密度的情节,然后点击运行。
  9. 如果样品密度导致了过度的事件发生率,可以采取稀释步骤来增加准确度和精度。
  10. 在密度图应用软件门从以前的直方图排除低电平散射信号,通过背景噪声或碎屑(FSC <320000)生产的。反之门更高的相对荧光从细胞中藻蓝蛋白的信号,只包括这些事件(FL4,56000 - 1,950,000)。
  11. 使用记录在门控区的细胞的数量和通过样品的总体积是通过将FCM已通过将其划分,制定出每毫升多少细胞。
    :这里使用的FCM模式有一个微处理器控制的蠕动泵系统,允许被确定样本量。其他FCM设备可能需要校准珠暂停或计算的H 2 O的重量/体积的不同来验证总样本量。
  12. 细胞的需要的体积添加到新鲜制备的介质,以便开始微囊藻的一个批次生长周期(250,000细胞/ ml)。
    :种将不同生长率取决于它们的原位环境参数和养分有效性,所以一个批量周期应预先记录,以确定生命周期阶段。

3.的Optim的分子探针细胞摄取化

  1. 微囊藻培养收获一半的指数相准备在步骤2中作为一个“活”的控制使用。
    :样品由高密度培养稀释直奔指数期可以通过死细胞的营业额影响优化的结果,相比于文化从最初的滞后/诱导阶段接种的。
  2. 制备的另一半通过使用方法如70%的乙醇,加热的样品 60℃1小时,多聚甲醛或4%甲醛30分钟6,11,22一个“死”的控制。检查中的变化样品微环境如,pH值)。
    :正,热灭活,'死'在微囊藻的控制是通过其在藻蓝蛋白的信号下降一“活”样本区分。通过其它方法诱导的死亡率可能不会导致相同的输出和将VARŸ物种。
  3. 设置为使用不同比例的混合样品“活”和“死”的样本例如,0%,25%,50%,100%)。
  4. 分列集落形成涡旋或超声检查pH值。
  5. 选择488nm的激光沿着探测器可从绿色记录荧光(FL1,530±15纳米),橙色(FL2,585±20毫微米)的核酸探针和640纳米的激光通过其相应的检测器来记录藻蓝蛋白的信号。
    注意:当与DNA结合,绿色核酸探针具有504 nm,发射523纳米的最大值近似的荧光激发波长,而橙色核酸探针具有547 nm和排放为570nm极大值的激发波长。甲的488nm氩离子的固态激光器可被用于激发两个分子探针,然而,一个绿色激光(高达547纳米)将产生一个较高的橙色荧光。
  6. 作为一个起点,介绍分子探针与厂家推荐使用浓度为50%的“活”,50%“死”的文化和孵化在黑暗中。
  7. 选择一个新的数据单元,将与阈值和触发器,这将降低背景噪音(FSC-H 80000)的SIP下的样本。
  8. 创建具有FSC-H和SSC-H的参数和三个直方图密度的情节。一个直方图使用各自的分子探针光检测通道(FL1或2),一个用于检测排放藻蓝蛋白(FL4-H)和其它的FSC-H,所有对数尺度。
  9. 孵育微囊藻与在黑暗的核酸探针的样品达60分钟,记录在单独的数据单元,在多个时间点(1,5,10,15,30和60分钟)。
    :当调整参数,如pH检查与生产的某些化学品的潜在反应(用于测试核酸探针的缓冲不能含有磷酸盐或高单价或女主角的价阳离子,作为与DNA结合将减少)。
  10. 应用软件门仅包括FSC-H直方图(320,000 - 1500000)为靶标生物细胞的大小,进入各自的荧光探针通道直方图。
    注意:在这个协议中所用的浓度分别为0.05,0.1,0.5,1,5,10,50和100微米,这可以通过增加或减少微囊藻样品或核酸探针的初始储备液的体积可以改变。
  11. 在荧光探针信道时,使用另一包容软件门到直方图中的最高峰(​​绿色FL1-H,240000 - 1650000,橙FL2-H,30000 - 165000),并随后栅极阳性探针荧光入密度图。
  12. 运行步骤3.1 - 3.11 100%“活”,100%“死”和所有的混合培养样品,调整分子探针浓度(例如:X为0.1〜×10)和/或温度和pH水平如果必要的。
  13. <利>比较的阳性分子探针的荧光信号的数量为“死”细胞的原始细胞密度(从半总FSC-H或100%的“死”培养采取)找到细胞染色核酸的总百分比探头。
  14. 每个浓度范围内做到这一点的每个时间段找到细胞核酸探针的吸收比例最高的最优协议不产生非特异性染色(使用方法在单因素方差分析和方差的秩和检验单因素分析,如果数据是非参数)。

4.分子探针荧光歧视

  1. 对于荧光干扰/重叠从固有的或不特定的细胞染色测试选择50%“现场”和50%的“死”混合培养数据和起飞所有闸门。
  2. 应用软件门仅包括FSC-H直方图(320,000 - 1500000)为靶标生物细胞的大小,成藻蓝蛋白通道直方图。
  3. 门最高的藻蓝蛋白峰和标签为“现场”,增加标记为'死'的最低峰。
  4. 使用一次,在'活',然后'死'藻蓝蛋白(FL4)信号,记录两者的平均波长执行另外的门一步进入各自的分子探针荧光直方图通道。
    :该模式用于在这个实验中引起的死亡率是通过热处理,此协议下,显然降低了藻蓝蛋白信号完成。 '死'细胞产生群体的其它方法可能会产生不同的输出中获得的运行。
  5. 比正分子探针荧光(“死”)和本征/非特异性信号(“现场”)的平均波长,以确定协议灵敏度。
    :为提高“活”与“死”波波尔荧光歧视ations,增加碳源以活性防污摄取营养物耗尽的电池或乙二胺四乙酸(EDTA),以提高细胞壁的渗透性和产生的荧光信号6。在一些FCM模型光谱重叠有限的补偿可通过用户操纵成对校正期间样品采集(PMT电压的变化)或从分析后专门的软件来执行。
  6. 选择优化的协议,其中已被染色的最高量的“死”细胞不发生非特异性染色。如果一个数测试的有类似的结果接受协议与最低浓度和温育时间,以及良好的荧光信号鉴别。按照制造商的流式细胞仪关机程序的指令。

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Representative Results

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正向光散射(FSC)和侧向光散射(SSC)的输出从指数生长期的微囊藻分批培养提供了分别对细胞尺寸(直径)和内部粒度信息图1A)。 FSC可以区分细胞太大和/或小到可以微囊藻 。这个判别或选通可以由FSC输出图1C)的某些点之间精制数据来完成。藻蓝蛋白, 微囊藻光合装置的主要结构产生强信号时由红色光源询问(例如:640; EM:675±12.5纳米),其可以被用来进一步栅极种群,类似于在FSC做选通但与荧光图1D)。从FSC和荧光信号,数据可以从原始输出 (图1A),以特定的数据被选通上微囊藻对于fINAL细胞计数( 图1B)。

在蓝藻种群每个细胞的自体荧光的不同生理状态的功能。在这里,细胞从指数期文化显示出相对较高的远红外荧光的'活'控制人口和'死'控制暴露在60℃加热1小时收获。当'活'高色素和'死'低色素性控制混合的下降转变自发荧光明显( 图2A和B)。该“死”细胞荧光和FSC参数可用于鉴别已占用的分子探针的总细胞。在膜破坏或“死”细胞中的核酸探针要么上产生一个附加的信号; FL1通道(530±15纳米)为橙色核酸交流绿色核酸探针或FL2通道(585±20纳米)ID探头( 图3A&B),相比原生'活'的荧光信号。在细胞损伤的膜既核酸探针确认可以通过荧光显微镜可以看到( 图4A&D)。

从混合样品,这是被获得的细胞已被染色的由绿色的核酸探针的总百分比预选通到仅包括微囊藻细胞大小从FSC-H直方图(320,000 - 1500000)。以50:50“活:死'样品,绿色荧光的细胞从一个FL1(530±15毫微米)直方图中的最高峰门控进行比较,在”死“细胞群原密度(通过总FSC-减半H或运行在仅100%“死”细胞样品一分离的细胞计数)。高于100%将指示非特异性染色发生。细胞的已占用的绿色nucle的平均百分比IC核酸探针介于; 15±0.3%,0.05微米10 1分钟后,以100μM的177.1±5.1%时分钟温育的( 表1)。浓度超过1微米(不包括)显示非特异性染色( ,“活”细胞开始采取了分子探针)。甲双向ANOVA未表现出非特异性染色浓度之间(0.05 - 1μM)并且显示在绿色核酸探针和在微囊藻温育时间的浓度之间的相互作用的总显著差异(12 ,40)= 6.48,P <0.001。有横跨使用F(3,40)绿色核酸探针= 836.92,P <0.001和孵育时间F(4,40)= 347.98,P <0.001的浓度变化的主要作用。一事后基测试表明所有浓度之间的显著的差异,除了0.5和1微米(P <0.001)和60分钟(P <0.001)1 -所有孵育时间之间显著差异。然而,事后Tukey检验从一个单向ANOVA揭示绿色核酸探针的平均摄取30分钟和60分钟之间没有差别为0.05微米(P> 0.05)和1μM的(P> 0.05)(图5A)。在FL1'活'和“死”的相对荧光信号种群歧视(通过FL4测量)的平均值比60分钟的714±14.8(RFU)的后不等从最高的绿色核酸探针在0.1微米最低为0.8±0.0(RFU)在100μM为30分钟表2)之后。在'活'和'死'FL1强度歧视比较相对荧光单位(RFU)的比率预示着双向方差分析报告的整体显著差异浓度和孵育时间˚F之间的相互作用23.9,P <0.001绿色核酸探针。还有在所有浓度的F(7,80)= 475.41,P <0.001和孵育时间F(4,80)= 78.28,P <0.001在主效果的显著差异。荧光信号的'活'和热之间杀'死'细胞的鉴别率随时间增加的0.05μM和1μM的浓度之间,但5和100μm( 图5B)之间下降。

细胞的哪个进行染色橙色核酸探针的百分比看见的4±0.3%的平均比例较低,为0.05μM的浓度1分钟后,温育10分钟表之后上升到166±3.5%,100微米3)。再次浓度超过1μM的还提出活细胞的非特异性染色。双向方差分析betwEEN这表明没有非特异性染色的浓度(0.05 - 1μM)报道的橙核酸探针的所有浓度和温育时间之间的相互作用的总显著差异在微囊藻,F(12,40)= 133.55, P <0.001。有跨越浓度F(3,40)= 6919.67,P <0.001和孵育时间F(3,40)= 1161.45,P <0.001有统计学显著主效应。然而通过单因素方差分析的只是1微米事后基测试表明,保温时间10,30和60分钟之间有橙色核酸探针( P> 0.05)( 图6A)的摄取无统计学差异。在50微米和30米60分钟后,在橙色核酸探针在FL2'活'和'死'染色种群之间的荧光信号识别范围从最低的0.3±0.0(足协)在100微米到最高的158.3±0.4(RFU)后,在0.1微米表4)的浓度60分钟。双向ANOVA报道的浓度和温育时间 F(28,80)= 28.12,P <0.001之间的相互作用的总统计意义。还发现的浓度F(7,80)= 607.9,P <0.001和孵育时间F(4,80)= 31.24,P <0.001的主要影响是所有显著不同。从'活'和加热杀死“死”细胞FL2信号之间荧光歧视随时间增加为0.05μM和0.5μM的浓度之间,但为1μM和100μM的图6B)之间下降。因此,对于绿色核酸探针的最佳浓度为0.5μM的为30分钟的温育时间和橙色核酸探针的最佳浓度为1μMINCU屏息10分钟。

图1
图1. 微囊藻的通过FSC,SSC和远红荧光(675±12.5纳米)。(A)FSC和SSC 微囊藻 PCC 7806(B)图1A与门FSC同样的输出和FCM输出远红荧光(例如:640; EM:675±12.5纳米)。 (C)的FSC表示的小区的大小。红色线箭头表示该被选通,以减少背景噪声或其它大小的颗粒的面积。 ( 四)铜绿微囊藻在红指数期分批培养生产高藻蓝蛋白信号箭头的门控领域。 请点击此处查看该图的放大版本。


图2.藻蓝蛋白信号偏移的微囊藻当热处理。变化微囊藻自发荧光的用于验证核酸探针摄取“活”与“死”的细胞。 ( 一)远红外信号从一个更高的色素'活'的人口(绿色)转移到一个较低的色素'死'的人口(红色)。 ( 二)FSC和远红色荧光结合近两个数量级的移位输出。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3.橙色荧光移动的微囊藻从'活'Unstained可'死'染色的细胞微囊藻 '活'和'死'混合的1.0微米30分钟浓度孵育橙色核酸探针控制。 (A)FL2(585±20 nm)的信道报告从'活'不染人口(绿色),通过两个数量级的增加转变为一个'死'染色人口(橙色)。(B)A'死'染人群(橙色)已下降远红外信号,但是从一个'活'的人口(绿色)增加FL2信号。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4. 微囊藻的荧光显微镜与分子探针,麦克风roscope从铜绿微囊藻 50:50现场图片:死亡人口培养的核酸探针,所有图像x1,000放大。 (A)中的绿色的核酸探针通过“死”细胞摄取的落射荧光图像。 “活”细胞呈红色,由于叶绿素的自发荧光。 (B) 图4A的光镜图,表示“活”绿色色素细胞和色素较少的“死”的细胞,与细胞膜损伤。 ( 三)住:死50:50混合微囊藻种群。 ( 四) 4C橙核酸探针保温,与“死”细胞暴露通过荧光显微镜橙色。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5 图5.百分比细胞标记的绿色核酸探针和'活'到'死'FL1信号强度之比,平均 微囊藻细胞染色,在不同的浓度和孵育时间的绿色核酸探针的百分比。 (A)中为0.1μM不染色足够的细胞,5微米显示非特异性染色和0.5μM的浓度和1μM的染色近100%的人口,表示30分钟后的最佳温育时间(一)。 (B)'活:死'FL1信号从指数生长期和热处理的样本比例。 0.5μM和1μM浓度显示FL1信号与培养时间增加(RFU比两个数量级),良好的歧视。 10微米及以上(不图来表示)浓度显示的“活”的穷荧光信号的歧视和重叠D'死'的人群。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6
图6.百分比细胞标记的与Orange核酸探针和'活'到'死'信号强度之比。结果从浓度和孵化时间的变化微囊藻种群细胞的记录了一个(A)的平均百分比在FL2橙色荧光信号与浓度; 0.1μM和0.5μM的10分钟后未染色足够的细胞,5μM的染色活细胞(非特异性染色),以及1μM的最佳浓度(a)中。 二)橙色核酸探针“活:死'在FL2比率显示出良好的歧视和不超过精研在1微米或更小的浓度差重叠FL2信号(幅度的比值低于一个数量级),其浓度超过1微米的荧光信号。 请点击此处查看该图的放大版本。

浓。 孵育时间(分钟)
(μM) 1 10 三十 60
0.05 15.0 0.3 22.1 0.9 28.1 1.9 41.0 1.9 50.2 2.1
0.1 23.5 1.5 44.1 1.8 54.7 1.6 70.5 0.8 78.3 1.0
0.5 49.0 3.4 74.8 4.8 87.6 3.6 97.3 0.8 98.8 0.1
1 58.5 1.6 77.4 0.7 88.4 0.4 98.0 0.1 99.2 0.1
91.4 0.9 98.7 0.5 99.3 0.7 102.2 1.3 106.3 0.8
10 96.1 0.5 97.7 0.1 97.9 0.1 102.0 0.5 113.4 5.1
50 94.6 0.6 99.5 2.3 112.7 3.8 148.7 2.4 153.9 13.0
100 165.8 3.1 174.4 5.7 177.1 5.1 161.5 2.5 159.7 6.6

格林核酸探针在细胞表1百分比吸收的影响。从使用绿色核酸探针和50%的“活”和50%的“死”(经热处理)的人群样本的优化实验表示的数据。细胞的平均百分比已记录绿色核酸探针的荧光(FL1)已经计算针对从FSC-H计得到的“死”细胞总数。高于100%显示非特异性染色的值(SE下划线的)。

浓。 孵育时间(分钟)
(μM) 1 10 三十 60
0.05 92.9 5.4 170.0 10.9 237.2 14.9 385.5 15.0 481.9 17.7
0.1 178.3 18.1 343.0 19。 437.0 20.6 619.1 12.1 714.1 14.8
0.5 202.5 5.9 308.3 13.1 365.8 33.5 426.8 67.2 480.4 73.2
1 205.8 12.1 225.9 13.7 237.3 15.6 241.5 5.8 263.1 8.1
69.9 2.6 53.0 0.6 40.2 1.7 27.1 3.7 21.1 3.4
10 44.3 2.9 28.7 5.6 23.6 4.9 11.6 1.2 7.6 1.4
50 6.9 0.1 3.9 0.1 2.9 0.1 1.2 0.1 1.1 0.1
100 1.7 0.1 1.3 0.1 1.1 0.1 0.8 0.1 0.8 0.1

表2比在'活'和'死'彩色 微囊藻 细胞 绿色荧光信号 细胞沾上绿色核酸探针和非特异性的内在记录之间FL1信号的歧视。样品含有50%的“活”,50%“死”(热处理) 微囊藻测量了所有的浓度和孵育时间相同人口(SE下划线)。

浓。 孵育时间(分钟)
(μM) 1 10 三十 60
0.05 4 0.3 14.9 0.2 23.5 0.8 39.1 2.4 37.6 1.5
0.1 14.6 0.4 42.2 0.5 55.0 1.1 72.8 0.9 80.2 0.1
0.5 54.5 0.4 79.8 1.2 86.4 0.4 91.2 0.1 93.2 0.1
1 92.0 0.8 94.8 0.1 96.9 0.6 98.4 0.6 98.4 0.3
91.4 1.5 93.5 1.8 102.9 5.4 118.9 0.1 124.8 0.1
10 95.9 1.0 102.4 1.8 132.9 6 148.9 4.8 132.8 5.1
50 107.5 3.7 130.6 16.6 145.2 0.2 135.4 16.2 114.6 6.6
100 97.1 0.1 130.7 7.8 166.1 3.5 144.7 6.8 115.1 6.2

橙色核酸探针在细胞表3百分率吸收的影响。表使用优化数据橙色核酸探针和50%的“活”和50%的“死”(经热处理)群体样品。细胞的已记录的橙色核酸探针的荧光(FL2)的平均百分比已经计算针对从FSC-H计“死”细胞的总数(SE下划线的)。

浓。 孵育时间(分钟)
(μM) 1 10 三十 60
0.05 20.4 0.9 41.3 1.3 56.1 2.4 80.4 3.6 83.3 1.8
0.1 31.2 1.4 76.1 2.4 100.9 3.1 146.2 0.6 158.3 0.4
0.5 80.6 0.4 124.9 2.4 137.3 1.1 138.7 </ TD> 2.1 132.8 3.9
1 89.7 16.0 80.9 16.9 69.1 10.7 43.0 5.7 35.9 6.5
10.4 0.6 7.5 0.1 5 1.0 2.7 0.5 1.5 0.1
10 7 0.1 3.6 0.3 2.2 0.4 1.6 0.1 1.2 0.1
50 2.2 0.4 1.6 0.3 1.3 0.0 0.6 0.1 0.3 0.0
100 1.7 0.1 1.1 0.1 0.7 0.1 0.3 0.0 0.5 0.2

在“真实”和“死区”彩色 微囊藻 细胞 表4比率橙核酸 细胞从橙色核酸探针(FL2)和非特异性固有录音染色之间FL2信号鉴别。样品含有50%的“活”,50%“死”(热处理)测量了所有的浓度和孵育时间相同人口微囊藻 (SE下划线)。

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Discussion

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使用分子探针的出版物的数目增加表明可靠和信息数据可以得到5,6,8 - 15,19,22,23。作为然而没有完美的染色细胞存活,可以是有效的在所有物种具有相同的浓度和温育时间6,10。即使是同一类型的探针具有改变的荧光发射的表示需要建立正确的浓度和温育时间( 表1和3)。如使用此协议时看到的那样,最佳浓度和温育时间为橙色核酸探针是在1μM的10分钟,而绿色核酸探针将只需要一半的浓度,但不对三倍长( 图5和6)。这两种细胞非透性花青单体与浓度大于1.0微米的开始,以产生在排放光谱与非膜损伤的细胞的重叠。 SI的这种重叠gnals提供的证据表明非特异性染色时,其中“活”细胞被占用的分子探针。在从非特异性染色所得超过荧光产生误报,强调必须仔细针对每个分子探针与靶生物确定,必须对协议的发展。在优化的分子探针的最重要的步骤是:1)如何理解分子探针进行交互与FCM仪器; 2)采用合适的活的和死的控制; 3)从发展FCM输出的门控参数的知识和4)通过现场环境的理解修改的协议。

的光源,滤光器,以改变流式细胞仪内的PMT电压和检测器的能力而变化,从一家生产厂商,所以下的发光光谱在于相对于荧光通道什么激发波长从激光和其中的认识是至关重要的。随着收购的数据,阈值可以征收增加的决议,否则将失去也许是背景噪音,碎片或死亡的细胞聚集。分子探针可以提供深入了解物种的生存力无培养,通过单一参数,例如,膜电位,DNA含量和酶活性。然而,环境样品中可以存在类似的细胞的大小和荧光的许多生物。此外uniagal培养内,细胞群将不可避免地具有一定程度的生理状态3,这可能影响分子探针摄取。一个FCM的主要优点是它的区分,并在实时的个体细胞水平,研究当原位微生物生存能力 ,因为它们通常经受快速和动态条件,这是不可或缺表征生理状态的能力。尽管它的频繁使用,细胞活力的概念仍然难以确定。通常用于细胞增殖,可行性是非常打进一个基础的增长方式。这托底假设可能功亏一篑,因为条件可能不适合单个细胞复制,但他们仍可能容忍的。在非增殖的生理状态的细胞已经进入一个静止或G(0)细胞周期阶段27可能无法使用分子探针提供DNA的循环或代谢基于探针漏报互动。

使用实验室生长或新鲜分离细胞,以优化分子探针将有助于生态研究中所用的数据的精炼。从分批培养在优化中使用的细胞通常采取指数或早期固定相并假定具有最高的存活率。然而,格外小心,必须使用高细胞密度,那些在后期稳定期或微生物产生的细胞外基质时,应考虑。在这个协议中对细胞的死人口控制暴露于60℃加热1小时,带确认的膜损伤和颜料降解通过显微镜看到的( 图4)和 FCM荧光输出( 图2和3)。模拟自然的细胞死亡的原因是极其困难的;摄取食草动物,病毒裂解,程序性细胞死亡或不对称分裂24的可能性并不总是可行或在实验室条件下观察到。道德的实验模式经常受到质疑,因为它们可能不等同于从环境中引起的应力例如热杀灭),并有可能是多相反应,其中某些个体死亡,其他细胞显示没有可观察的细胞退化或死亡3 25。为了避免这种矛盾由测量的实验,必须明确规定,以免引起混淆6,23,宽松的研究与标准化的操作定义。

各种替代方法甲肝Ë被用来分析细胞活力培养与分子探针结合。荧光显微镜是用传统的技术,尽管漂白或从附近的细胞中引入假象信号可能会给出一个低于或超过人口,如果没有记录足够快的生理状态的估计。这使得通过优化成像非常困难的,具有潜在的精度低。细胞活力的同时使用DNA和RNA扩增方法,如基因组的评估;聚合酶链反应(PCR),逆转录酶(RT-PCR)和核酸序列为基础的扩增(NASBA)也已经使用。然而,基因组的评估仅充当生存能力验证的间接方法,核酸的持久性在很大程度上取决于环境条件,与实际细胞活力的相关潜在变化非常28。通过自然的照片使用的光散射和/或荧光组合ynthetic颜料( 图1)门的人群可以的:数据提高分辨率,找出稀有人群的反应,降低假阳性结果。 FCM沿分子探针突出从先前提到的技术在测试单细胞生理其速度,精度和记录的多个参数。

FCM是在水生微生物学,并与加成分子探针的一个强大的分析工具具有在多个领域,包括,单细胞和社区分析,以工业部门例如,监测饮用水供应)宽电位。未来的发展可以看到,FCM将荧光原位杂交(FISH),它可以检测和定位在密集的异类样本中的个别细胞的特异性基因序列。 FCM和分子探针可移植性的用于原位录音的发展可以提供关于水源的重要数据来实现S早期trategies资源管理。下面这里开发的优化协议,FCM和分子探针可以潜在在提供有关微生物生理学在水生环境有价值的数据的关键作用。

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Disclosures

作者宣称,他们有没有竞争的财务权益。

Acknowledgments

作者要感谢博士生戴维哈特内尔和伯恩茅斯大学的支持和资助的研究和设施。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cyanobacteria Media Sigma-Aldrich C3061-500ML BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution)
Decontamination Fluid BD Biosciences 653155 Run for 2 min when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µl/min.  Followed by 2 min of sheath H2O.
Flow Cytometer BD Biosciences by request BD Accuri C6
SYTOX Green Life Technologies S7020 Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO
SYTOX Orange Life Technologies S11368 Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO

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分子探针的优化,以确定细胞死亡的光合生物(<em&gt;铜绿微囊藻</em&gt;)使用流式细胞仪
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Chapman, I. J., Esteban, G. F., Franklin, D. J. Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (107), e53036, doi:10.3791/53036 (2016).More

Chapman, I. J., Esteban, G. F., Franklin, D. J. Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (107), e53036, doi:10.3791/53036 (2016).

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