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Medicine

Molecular Probe Optimization per determinare mortalità delle cellule in un organismo fotosintetico ( doi: 10.3791/53036 Published: January 29, 2016

Summary

Popolazioni microbiche contengono eterogeneità delle cellule sostanziale, che può dettare il comportamento generale. Analisi della sonda molecolare attraverso citometria a flusso in grado di determinare stati fisiologici di cellule, ma la sua applicazione varia tra le specie. Questo studio fornisce un protocollo per determinare con precisione la mortalità delle cellule all'interno di una popolazione cianobatterio, senza sottovalutare o la registrazione di risultati falsi positivi.

Abstract

Sottopopolazioni microbiche in studi sul campo e di laboratorio hanno dimostrato di visualizzare elevata eterogeneità nei parametri morfologici e fisiologici. Determinare il reale stato tempo da una cella microbica va oltre le categorie, vivi o morti, come possono esistere microbi in uno stato inattivo, per cui la divisione cellulare e attività metaboliche sono ridotti. Data la necessità di individuazione e la quantificazione dei microbi, citometria a flusso (FCM) con sonde molecolari fornisce un metodo rapido e accurato per determinare la redditività complessiva della popolazione. Utilizzando Sytox verde e Sytox arancione nel modello cianobatteri Microcystis aeruginosa per rilevare l'integrità della membrana, sviluppiamo un metodo trasferibile per una rapida indicazione di mortalità singola cellula. Le sonde molecolari utilizzati all'interno di questa rivista si farà riferimento alle sonde di acidi nucleici come verde o arancione rispettivamente (anche se ci sono altri prodotti con simili eccitazione e di emissione che hanno una modalità comparabili di action, abbiamo espressamente riferimento alla ribalta menzionato sonde). Protocolli che utilizzano sonde molecolari variano tra le specie, che differiscono principalmente in tempi di concentrazione e di incubazione. Seguendo questo protocollo intraprendere M.aeruginosa sonda verde acido nucleico è stato ottimizzato a concentrazioni di 0,5 mM dopo 30 min di incubazione e la sonda di acido nucleico a 1 pM arancione dopo 10 min. In entrambe le concentrazioni sonde in meno rispetto alla ottimale indicata portato ad un sotto segnalazione di cellule con danni membrana. Al contrario, 5 mM concentrazioni e superiore in entrambe le sonde hanno mostrato un tipo di colorazione aspecifica, per cui le cellule 'dal vivo' hanno prodotto una fluorescenza bersaglio, portando ad una rappresentazione su di numero di cellule 'non vitali. I controlli positivi (calore ucciso), a condizione biomassa morto verificabile, anche se l'opportunità di generazione di controllo rimane oggetto di dibattito. Dimostrando una sequenza logica di passi per ottimizzare le sonde di acido nucleico verde e arancione noi demonstrate come creare un protocollo che può essere utilizzato per analizzare efficacemente stato fisiologico cianobatteri.

Introduction

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La cella è un sistema complesso, che risponde costantemente all'ambiente modificando parametri fisiologici e alterarne la funzione. Dinamica delle popolazioni di popolazioni microbiche isogeni sia in natura e di laboratorio sono danneggiati dallo sviluppo di sottopopolazioni, che si verificano anche in condizioni ambientali relativamente costanti 1 - 3. La variabilità delle comunità microbiche naturali nasce a causa della natura altamente variabile delle condizioni ambientali. Questi processi talvolta stocastici successivamente producono sottopopolazioni che sono molto diversa da quella media della popolazione. Recenti evidenze hanno rivelato che queste sottopopolazioni fisiologiche reazioni diverse condizioni ambientali e possono produrre composti di segnale o inibitori che colpiscono drammaticamente e influenzano il 3,4 popolazione complessiva.

Stabilire un metodo per definire l'eterogeneità all'interno di una popolazione è la chiave per unprensione l'ecologia dei microbi in vari ambienti ed è essenziale per la costruzione di conoscenza di cianobatteri fastidio, come il Microcystis tossici, che incide pesantemente sulla sicurezza dell'acqua umana. Specie, come Anabaena visualizzare l'eterogeneità morfologica in risposta alle fluttuazioni ambientali, lo sviluppo di cellule specializzate come eterocisti e akinetes 2. Al contrario, le cellule Microcystis non visualizzano evidente eterogeneità morfologica durante una risposta allo stress. La discriminazione tra cellule vitali e non vitali è l'aspetto più importante di differenziazione fisiologica e consente una migliore comprensione della dinamica delle popolazioni microbiche. Tuttavia, il problema concettuale di vitalità batterica stessa rimane difficile e poco caratterizzati 1,5,6.

Citometria a flusso (FCM) è un metodo affidabile e veloce di analizzare singole cellule. Per aumentare la comprensione della fisio singola cellulalogia attraverso FCM, sonde molecolari sono stati utilizzati per distinguere una serie di processi metabolici e biochimici 7. Ciò ha portato ad una maggiore conoscenza delle specie a livello cellulare e la popolazione ea sua volta aiutato gestione delle risorse idriche 8,9. Tuttavia, gli organismi differiscono in termini di assorbimento di sonda molecolare e efflusso a causa dei pori e pompe in pareti e membrane cellulari, che hanno portato ad una serie di progettazione della sonda molecolare e implementazione del protocollo 6,10,11. Sonde molecolari disponibili a fini commerciali e di ricerca sono spesso forniti con un protocollo generico che può essere applicabile a un tipo di cellule molto diverso. Si deve fare molta attenzione nel trasferire protocolli sviluppati per un tipo cellulare all'altro 6, è quindi un compito essenziale per ottimizzare sonde molecolari efficacemente prima dell'uso.

Le sonde di acidi nucleici verde e arancione si legano a due acidi nucleici doppie e singole flessibili con base minimale selezionareivity e sono utilizzati per valutare l'integrità della membrana plasmatica delle cellule. La sonda verde acido nucleico ha un netto miglioramento segnale di fluorescenza marcatura delle cellule rispetto ad altre sonde molecolari, come i composti a base di ioduro di propidio-12, che può anche agire come un indicatore della vitalità cellulare. Il termine 'vitalità cellulare' qui si presuppone che la degradazione del DNA si verifica dopo la perdita di integrità della membrana plasmatica. Le sonde di acido nucleico sono coloranti cianinici asimmetrici con tre cariche positive e non possono entrare nelle cellule con membrane intatte sotto concentrazioni caratterizzati, sia eucariotiche e procariotiche 14,15 11,13 organismi. Il legame di una sonda di acido nucleico ad acidi nucleici può portare fino a un aumento di emissioni di fluorescenza da segnali endogeni> 500 in cellule che hanno la loro integrità della membrana compromessa. Sebbene sonde molecolari quali sonda verde acido nucleico può essere un buon indicatore della fisiologia singola cella, è necessario to ottimizzare ogni sonda con il previsto obiettivo di organismo, come i tempi di incubazione hanno variato dal 7 min - 30 min e concentrazione varia da 0,1 micron - 0,5 micron di esperimenti Microcystis solo 15-19.

Qui vi presentiamo un protocollo per ottimizzare le analisi di citometria di verde e relativamente nuove sonde di acidi nucleici arancione (che fino ad oggi non sono stati testati sulla specie di cianobatteri M.aeruginosa). Il seguente metodologia sviluppata può essere trasferita ad altre specie e usato come piattaforma per ottimizzare protocolli in altre sonde molecolari, aumentando così la comprensione di microbi e il loro comportamento ecologico.

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Protocol

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1. Preparazione della sonda molecolare e citofluorimetro

  1. Diluire le soluzioni madre delle sonde di acido nucleico, che vengono forniti come soluzione 5 mM in dimetilsolfossido (DMSO) per aliquote di concentrazioni richieste in ultrapura filtrato H 2 O.
  2. Conservare le sonde di acido nucleico in condizioni di oscurità tra -5 ° C e - 25 ° C fino al momento dell'uso.
  3. Accendere il citofluorimetro e pacchetto software di carico (vedi tabella dei materiali / Attrezzature per le specifiche FCM).
  4. Inserire un tubo vuoto emolisi (12 x 75 mm) sulla sonda di iniezione del campione (SIP), fare clic su sbloccare e poi di nuovo a filo per avviare il processo di pulizia FCM.
    NOTA: alcune fasi di esempio per il SIP in grado di ospitare diversi tipi di tubi compresi i tubi microcentrifuga. La sonda del diluente e liquido guaina molecolare impiegato nell'apparecchiatura FCM è da un grado analitico "tipo 1" 0,22 micron membrana fonte filtrata.
  5. Luogoun tubo emolisi fresco con 2 ml di filtrato ultrapura H 2 O sul SIP, impostare un limite di tempo per 10 - 15 min e una velocità di digiunare fluidico (o un flusso di> 66 ml / min).
  6. Selezionare una nuova cella di dati, mettere su soglie rilevanti per fluorescenza e canali dispersione di luce per ridurre il rumore di fondo e fare clic su 'run'.
  7. Se gli eventi totali al secondo non sono al di sotto raccomandazione dei costruttori, quindi eseguire un campione 2 ml di soluzione di decontaminazione per 2 minuti sul veloce e quindi ripetere i passaggi 1.4 e 1.5.
    NOTA: Si prega di verificare le raccomandazioni del fabbricante per FCM start-up dei protocolli di pulizia, in quanto possono variare tra i modelli. Test per soglie specifiche deve anche essere in linea con il modello di FCM come alcune attrezzature permette all'utente di applicare tensioni guadagni per i tubi fotomoltiplicatori (PMT) migliorando o diminuendo il segnale elettrico registrato dai rivelatori ottici. Il modello usato in questo FCM esperimentimento ha fissato PMT tensione e utilizzato una soglia di 80.000 forward scatter di luce (FSC-H) di escludere le particelle inferiori a 2,0 micron e di rumore elettronico.

2. Preparazione delle Culture e Conti cellula iniziale

  1. Autoclave 98 ml di H 2 ultrapure filtrato O e 2 ml di media algali (concentrazione x50) in un becher da 250 ml per 20 minuti a 120 ° C.
  2. Da un monocolture iniziale di M.aeruginosa (PCC 7806) in un alto stato stazionario luogo densità 2 ml di campione in un tubo sotto il SIP. Disaggregare qualsiasi formazione di colonie nel vortex o sonicazione 20 e confermare le cellule disperse in modo uniforme attraverso la microscopia ottica.
    NOTA: L'eccessiva esposizione a onde ultrasoniche può portare alla lisi cellulare e deve essere usato con cautela. Dal momento che sonicazione può crollare vescicole di gas (come si trova in specie come M.aeruginosa) Uscite come la luce laterale scatter (SSC-H) intensità può diventare più sensitive.
  3. All'interno del software FCM, selezionare un grafico a istogramma per registrare i dati di diffusione della luce in avanti (FSC-H) e configurare le specifiche di scena facendo clic su "log" per visualizzare in una scala logaritmica sull'asse.
  4. In un'uscita separata, selezionare un altro istogramma (log asse) per registrare la fluorescenza naturale come il pigmento fotosintetico ficocianina accessorio (FL4-H, 675 ± 12,5 nm), trovato in M.aeruginosa.
  5. Utilizzare una fonte di luce che può eccitare ficocianina e un rilevatore in grado di filtrare le emissioni di fluorescenza risultante.
    NOTA: pigmenti fotosintetici come la clorofilla può essere eccitato con comunemente utilizzati laser blu 488 nm, mentre phycocyanin è eccitato sopra 600 nm e verrà rilevato solo con una sorgente di luce rossa 21. Verificare con il produttore citofluorimetri per sorgenti luminose di eccitazione e gli spettri di rivelatori di emissione, qui sia un 488 nm e un laser 640 nm sono stati utilizzati insieme aun filtro ottico nm 675 ± 12,5.
  6. Per la registrazione delle selezionare le impostazioni massime risoluzioni più vicine alla dimensione nucleo dell'organismo bersaglio (10 micron) e un flusso relativamente lento (14 ml / min).
    NOTA: Per ottenere i migliori campioni di risoluzione deve essere eseguito secondo produce raccomandazione di eventi al secondo.
  7. Prima che i dati di acquisizione utilizzano una soglia per escludere diffondono la luce e / o segnali di fluorescenza che sono causati dal rumore di fondo elettronico o detriti campione di cellule.
  8. Selezionare una nuova cella di dati, creare una trama densità con parametri SSC-H FSC-H e su una scala logaritmica e scegliere Esegui.
  9. Se la densità del campione porta ad un tasso di eventi eccessivo, diluizioni possono essere adottate per aumentare l'accuratezza e la precisione.
  10. Sul terreno densità di applicare cancelli software dal istogramma precedente per escludere segnali di basso livello di dispersione, dovute al rumore di fondo o detriti (FSC <320.000). Viceversa porta maggiore di fluorescenza relativoSegnali ficocianina dalle cellule e solo comprendono questi eventi (fl4, 56.000 - 1.950.000).
  11. Utilizzare il numero di cellule registrate nelle aree gated e dividerlo per il volume totale del campione che è passato attraverso il FCM, capire come molte cellule per ml.
    NOTA: Il modello FCM usato qui ha un sistema di pompa peristaltica controllato da un microprocessore che consente volume del campione da determinare. Altre apparecchiature FCM può richiedere una sospensione di sferette calibrato o un calcolo di H 2 differenze di peso O / volume per verificare il volume totale del campione.
  12. Aggiungere il volume richiesto di cellule ai media appena preparate per avviare un ciclo di crescita batch (250.000 cellule / ml) di M.aeruginosa.
    NOTA: Specie differiranno nei tassi di crescita a seconda delle loro parametri in situ ambientali e disponibilità di nutrienti, per cui un ciclo di lotto dovrebbe essere pre-registrate per determinare le fasi del ciclo di vita.

3. Optimzazione di sonda molecolare assorbimento cellulare

  1. Vendemmia a metà della cultura M.aeruginosa preparato in fase 2 da una fase esponenziale e utilizzare come controllo 'dal vivo'.
    NOTA: I campioni diluiti da una coltura ad alta densità direttamente a una fase esponenziale possono influenzare i risultati di ottimizzazione attraverso turnover di cellule morte, rispetto a quello di colture inoculate da una fase iniziale lag / induzione.
  2. Preparare l'altra metà come controllo 'morto', utilizzando metodi quali il 70% di etanolo, i campioni di riscaldamento a 60 ° C per 1 ora, paraformaldeide o 4% di formaldeide per 30 minuti 6,11,22. Controllare variazioni del microambiente campioni (ad es., PH).
    NOTA: Il, ucciso al calore, controllo positivo 'morto' in M.aeruginosa si distingue da un campione di 'live' attraverso la sua diminuzione di segnali ficocianina. Indurre la mortalità con altri metodi non può causare la stessa uscita e verrà VARy in specie.
  3. Impostare campioni miscelati con diversi rapporti di 'live' e campioni 'morti' (ad esempio, 0%, 25%, 50%, 100%).
  4. Disaggregare la formazione di colonie con vortex o sonicazione e controllare il pH.
  5. Selezionare un laser a 488 nm a fianco di rilevatori che possono registrare la fluorescenza del verde (FL1, 530 ± 15 nm) e arancione (FL2, 585 ± 20 nm) sonde di acidi nucleici e il laser 640 nm a registrare segnali ficocianina attraverso il suo rispettivo rivelatore.
    NOTA: Quando è legato al DNA, la sonda verde acido nucleico ha un approssimativo di fluorescenza di eccitazione lunghezza d'onda di 504 nm ed emissione massimi di 523 nm, mentre la sonda arancione acido nucleico ha una lunghezza d'onda di eccitazione di 547 nm ed emissione massimi di 570 nm. Un laser a stato solido a ioni argon 488 nm può essere utilizzata per eccitare entrambe le sonde molecolari, tuttavia, un laser verde (fino a 547 nm) produrrà una maggiore fluorescenza arancione.
  6. Come punto di partenza, introdurre laSonda molecolare con i produttori raccomanda concentrazione alla cultura 'morto' 50% 'live' e il 50% e incubare al buio.
  7. Selezionare una nuova cella di dati, mettere il campione sotto il SIP con soglie e trigger in grado di ridurre il rumore di fondo (FSC-H 80.000).
  8. Creare una trama densità con parametri SSC-H FSC-H e, e tre istogrammi. Un istogramma utilizzando il rispettivo tastatore molecolare canale rilevatore ottico (FL1 o 2), uno per rilevare emissioni phycocyanin (FL4-H) e l'altra FSC-H, tutti su scala logaritmica.
  9. Incubare i campioni di M.aeruginosa con sonde di acido nucleico nel buio fino a 60 min, la registrazione in celle di dati separati, in un numero di punti di tempo (1, 5, 10, 15, 30 e 60 min).
    NOTA: Quando la regolazione dei parametri quali l'assegno di pH con produce per potenziali reazioni di taluni prodotti chimici (per l'acido nucleico testato sonde un buffer non può contenere fosfati o alti livelli di monovalenti o divacationi prestato, come il legame con il DNA sarà ridotto).
  10. Applicare un cancello software per includere solo l'istogramma FSC-H (320.000 - 1.500.000) per la destinazione di organismi dimensione della cella, nel rispettivo canale istogramma sonda a fluorescenza.
    NOTA: Le concentrazioni usate in questo protocollo erano 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 e 100 micron, che possono essere modificati per aumentare o diminuire il volume del campione M.aeruginosa o soluzione madre iniziale di sonde nucleici.
  11. Nel canale della sonda a fluorescenza, applicare un altro cancello software incluso per la vetta più alta l'istogramma (verde FL1-H, 240.000 - 1.650.000, arancio FL2-H, 30.000 - 165.000) e, successivamente, cancello che la sonda positivo fluorescenza nella trama densità.
  12. Eseguire i passaggi 3,1-3,11 con il 100% "dal vivo", 100% 'morti' e tutti i campioni di cultura mista, regolando le concentrazioni delle sonde molecolari (ad esempio x 0,1 x 10) e / o la temperatura e livelli di pH, se necessario.
  13. <li> Confrontare il numero di segnali molecolari sonda fluorescenza positivi alla densità cellula originaria della cellule "morti" (tratto da metà totale FSC-H o di una cultura al 100% 'morto') per trovare la percentuale totale di cellule colorate con l'acido nucleico sonde.
  14. Fate questo per ogni periodo di tempo all'interno di ciascuna concentrazione per trovare il protocollo ottimale per la più alta percentuale di nucleico cella sonda assorbimento senza produrre non specifica colorazione (usare i mezzi in-Way One ANOVA o Test di Kruskal-Wallis, se i dati sono non parametrica).

4. Molecular Probe fluorescenza Discriminazione

  1. Per il test di fluorescenza interferenza / sovrapposizione di colorazione della cellula intrinseca o non specifico selezionare i dati coltura mista "morti" il 50% 'dal vivo' e il 50% e togliere tutte le porte.
  2. Applicare un gate software per includere solo l'istogramma FSC-H (320.000 - 1.500.000) per il target Organismi dimensione della cella, nel ficocianinaistogramma del canale.
  3. Porta la cima più alta ficocianina ed etichetta come 'live', con l'aggiunta del picco più basso etichettato come 'morto'.
  4. Eseguire un ulteriore passo cancello nel rispettivo canale istogramma sonda di fluorescenza molecolare, utilizzando uno alla volta, il 'live' e poi ficocianina 'morto' (FL4) segnali, registrando entrambe le lunghezze d'onda media.
    NOTA: La modalità per indurre la mortalità in questo esperimento è stato fatto da un trattamento termico, che in virtù del presente protocollo si riduce chiaramente segnali ficocianina. Altri metodi di popolazioni di cellule che producono "morti" possono produrre risultati differenti nelle corse acquisite.
  5. Rapporto le lunghezze d'onda medi della fluorescenza positiva molecolare sonda ('morto') e il segnale / non specifico intrinseco ('live') per determinare la sensibilità protocollo.
    NOTA: per migliorare la fluorescenza discriminazione di 'live' e Vuh 'morto'zioni, aumentano la fonte di carbonio per l'assorbimento macchia attiva nelle cellule di nutrienti impoverito o acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per migliorare la permeabilità della parete cellulare e conseguenti segnali di fluorescenza 6. Compensazione limitata in alcuni modelli FCM per sovrapposizione spettrale può essere effettuata dall'utente manipolata correzione coppie durante l'acquisizione dei campioni (variazioni di tensione PMT) o da post-analitica software specializzato.
  6. Selezionare il protocollo ottimizzato dove la più alta quantità di cellule "morti" è stato macchiato, senza il verificarsi non specifica colorazione. Se un numero di prova di avere risultati simili accettare il protocollo con la concentrazione e l'incubazione di tempo più basso, insieme a una buona discriminazione segnale di fluorescenza. Seguire produce le istruzioni per la procedura di spegnimento citometro.

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Representative Results

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Forward scatter luce (FSC) e uscite luce laterale scatter (SSC) da una cultura lotto M.aeruginosa in fase esponenziale fornisce informazioni sulla dimensione della cella (diametro) e granularità interno rispettivamente (Figura 1A). FSC può discriminare le cellule che sono troppo grandi e / o piccolo per essere M.aeruginosa. Questa discriminazione o di gating può essere fatto da dati di raffinazione tra alcuni punti di una uscita FSC (Figura 1C). Ficocianina, un importante costituzione dell'apparato fotosintetico M.aeruginosa produce un forte segnale quando interrogato da una sorgente di luce rossa (es: 640; em: 675 ± 12,5 nm), che può essere utilizzato per ulteriori popolazioni cancello, simile a quello fatto in FSC gating ma con fluorescenza (Figura 1D). Da segnali FSC e fluorescenza, i dati possono essere gated dall'uscita originale (Figura 1A) a dati specifici sulla M.aeruginosa per fconta delle cellule Inal (Figura 1B).

Autofluorescenza per cella in popolazioni cianobatteri differisce in funzione di stato fisiologico. Qui le cellule sono state raccolte da una cultura fase esponenziale mostrando relativamente elevato di fluorescenza lontano rosso per una popolazione di controllo 'live' e il controllo 'morto' è stato esposto a 60 ° C di calore per 1 ora. Quando 'vivono' più elevati controlli pigmentate inferiori pigmentate e 'morti' sono mescolati lo spostamento in diminuzione in autofluorescenza è chiaro (figure 2A & B). Il 'morto' la fluorescenza delle cellule e parametri FSC possono essere utilizzati per discriminare le cellule totali che hanno preso la sonda molecolare. In membrana compromessa o cellule "morte" le sonde di acido nucleico produrranno un segnale addizionale sia su; FL1 canale (530 ± 15 nm) per la sonda di acido nucleico verde o canale FL2 (585 ± 20 nm) per l'ac nucleico arancioSonda id (Figure 3A e B), rispetto al 'vivere' segnale di fluorescenza nativa. La conferma di entrambe le sonde di acido nucleico nelle cellule con membrane di danno può essere visto attraverso epifluorescenza (Figure 4A & S).

La percentuale totale di cellule che erano state macchiate dalla sonda verde acido nucleico è stato ottenuto da campioni misti, che sono stati pre-dipendenti per includere solo M.aeruginosa dimensionato cellule da un istogramma FSC-H (320.000 - 1.500.000). In un 'live: morto' 50:50 del campione, le cellule fluorescenza verde gated dalla vetta più alta in un FL1 (530 ± 15 nm) istogramma è stato confrontato con densità originale nella popolazione di cellule 'morto' (o dimezzando la FSC totale H o l'esecuzione di un numero di celle separato solo i campioni di cellule di 100% "morti"). Sopra 100% indicherebbe che si verifica una colorazione non specifica. La percentuale media di cellule che aveva preso la Nucle verdeic sonda acido variava da; 15 ± 0,3% in 0,05 mM dopo 1 min a 177,1 ± 5,1% in 100 mM per 10 min di incubazione (Tabella 1). Concentrazioni più di 1 micron (ad esclusione di) mostrato colorazione non specifica (es., Le cellule 'dal vivo' che hanno cominciato a prendere la sonda molecolare). Una ANOVA a due vie tra le concentrazioni che non presentano colorazione non specifica (0.05 - 1 pM) e mostravano una differenza significativa complessiva nell'interazione tra la concentrazione di sonda di acido nucleico verde e tempo di incubazione in M.aeruginosa, F (12 , 40) = 6.48, p <0.001. C'è stato un effetto principale attraverso le concentrazioni di sonda verde acidi nucleici utilizzati F (3, 40) = 836,92, p <0.001 e tempi di incubazione F (4,40) = 347,98, p <0,001. Un test post-hoc Tukey indicato una differenza significativa tra tutte le concentrazioni tranne 0,5 e 1 mM (p <0,001) e undifferenza significativa tra tutti i tempi di incubazione di 1-60 min (p ​​<0.001). Tuttavia, un Post hoc Tukey test da una Via ANOVA One ha rivelato la diffusione media di sonda verde acido nucleico non differisce tra 30 e 60 minuti per 0,05 micron (p> 0.05) e 1 micron (p> 0,05) (Figura 5A). Il rapporto medio di segnali 'dal vivo' e 'morti' relative fluorescenza a FL1 per la discriminazione delle popolazioni (misurata attraverso FL4) variava nella sonda di acido nucleico verde dalla più alta in 0.1 micron dopo 60 min di 714 ± 14,8 (RFU) al più basso di 0,8 ± 0,0 (RFU) in 100 mM dopo 30 minuti (Tabella 2). Confrontando i rapporti di unità relativa fluorescenza (RFU) per la discriminazione intensità in 'live' e 'morto' FL1 segnala un ANOVA univariata due relazioni una differenza significativa globale nell'interazione tra concentrazioni e tempi di incubazione F p <0,001 con la sonda verde acido nucleico. C'è stata anche una differenza significativa nella effetto principale in tutti concentrazioni F (7,80) = 475,41, p <0.001 e tempi di incubazione F (4,80) = 78.28, p <0.001. I rapporti di discriminazione dei segnali di fluorescenza tra il 'live' e calore uccise "morti" cellule sono aumentate con il tempo tra le concentrazioni di 0,05 micron e 1 micron, ma sono diminuite tra il 5 micron e 100 micron (Figura 5B).

La percentuale di cellule che sono state colorate con la sonda arancione acido nucleico vide percentuale medio basso di 4 ± 0,3%, in una concentrazione di 0,05 mM dopo 1 min, salendo a 166 ± 3,5% in 100 mM dopo 10 min di incubazione (Tabella 3). Concentrazioni di nuovo oltre 1 micron anche presentati non specifica colorazione di cellule vive. A Two-Way ANOVA between le concentrazioni che hanno mostrato alcuna colorazione aspecifica (0,05-1 micron) ha riportato una differenza significativa globale nell'interazione tra tutte le concentrazioni della sonda arancio acido nucleico e tempi di incubazione in M.aeruginosa, F (12, 40) = 133,55, p <0.001. Ci fu un aumento statisticamente significativo effetto principale attraverso concentrazioni F (3, 40) = 6.919,67, p <0.001 e tempi di incubazione F (3, 40) = 1.161,45, p <0,001. Comunque un test post hoc Tukey attraverso un modo ANOVA One su appena 1 micron indicato che i tempi di incubazione tra i 10, 30 e 60 minuti ha avuto alcuna differenza statistica nella diffusione di arancia sonda di acido nucleico (tutti p> 0,05) (Figura 6A). Discriminazione segnale di fluorescenza tra le popolazioni 'dal vivo' e 'morti' macchiato in FL2 variava in arancione sonda di acido nucleico dalla più bassa di 0,3 ± 0,0 (RFU) dopo 60 min a 50 micron e 30 min in 100 mM al più alto di 158,3 ± 0,4 (RFU) dopo 60 min ad una concentrazione di 0,1 mM (Tabella 4). Un Two Way ANOVA ha riportato un significato statistico complessivo nelle interazioni tra concentrazioni e tempo di incubazione F (28, 80) = 28.12, p <0,001. I principali effetti di concentrazione F (7, 80) = 607,9, p <0.001 e tempi di incubazione F (4, 80) = 31.24, p <0.001 sono stati trovati anche essere tutto molto diverso. Fluorescenza discriminazione tra i segnali dalle cellule 'morte' 'dal vivo' e di calore ucciso in FL2 è aumentata con il tempo tra le concentrazioni di 0,05 micron e 0,5 micron, ma diminuito tra 1 micron e 100 micron (Figura 6B). Pertanto, la concentrazione ottimale per la sonda verde acido nucleico è 0.5 mM con un tempo di incubazione di 30 min e per la sonda di acido nucleico arancione la concentrazione ottimale è 1 pM incusospeso per 10 min.

Figura 1
Figura 1. FCM Uscite M.aeruginosa Attraverso FSC, SSC e Far Red fluorescenza (675 ± 12,5 nm). (A) FSC e SSC di M.aeruginosa PCC 7806. (B) Lo stesso output Figura 1A con FSC recintato e lontano fluorescenza rossa (es: 640; em: 675 ± 12.5 nm). (C) FSC rappresenta le dimensioni della cella. La freccia rossa indica rivestito l'area che è recintato per ridurre il rumore di fondo o di altre particelle di dimensioni. (D) i segnali ad alta ficocianina prodotte da M.aeruginosa in una cultura lotto fase esponenziale con rosso Arrowed aree recintato. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.


Figura 2. Spostamento Ficocianina segnale in M.aeruginosa Quando Calore trattato. Cambio di M.aeruginosa autofluorescenza in cellule 'vive' e 'morte' utilizzati per convalidare nucleico sonda acido assorbimento. (A) Segnali Lungi rosso spostamento da un più alto pigmentato 'live' della popolazione (verde) per un più basso pigmentato popolazione 'morto' (rosso). (B) FSC e fluorescenza rossa uscite combinate lontano con uno spostamento di circa due ordini di grandezza. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Arancione fluorescenza Spostamento in M.aeruginosa Da 'Live' Unstained per 'morto' cellule colorate. 'dal vivo' e 'morti' controlli misti M.aeruginosa incubate con arancia sonda di acido nucleico ad una concentrazione di 1,0 micron per 30 min. (A) FL2 (585 ± 20 nm) canale riporta un aumento del passaggio da un 'live' della popolazione non colorati (verde) per un 'morto' popolazione macchiato (arancione) attraverso due ordini di grandezza. (B) A 'morto' popolazione macchiato (arancione), che ha diminuito i segnali molto rosse, ma aumentato segnali FL2 da una popolazione 'live' (verde). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. epifluorescenza Microscopia di M.aeruginosa con sonde molecolari. MicROSCOPE immagini da un M.aeruginosa 50:50 live: popolazione morti incubate con sonde di acidi nucleici, tutte le immagini x1,000 ingrandimento. (A) Un'immagine epifluorescenza di sonda di acido nucleico verde ripreso dalle cellule "morti". Cellule 'Live' appaiono di colore rosso a causa della autofluorescenza di clorofilla. (B) Vista Microscopio ottico di figura 4A mostra le cellule 'live' verdi pigmentate e cellule pigmentate minori "morti", con danni membrana. (C) Live: morti 50:50 popolazione mista M.aeruginosa. (D) Arancione nucleico sonda acido incubazione dalla figura 4C, con le cellule "morti" che rivelano un colore arancione attraverso epifluorescenza. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5 Figura 5. percentuale di cellule etichettati con Green Nucleic Acid Probe e il rapporto di 'Live' di Segnali FL1 'morti'. Significano percentuale di cellule M.aeruginosa colorate con la sonda di acido nucleico verde in diversi tempi di concentrazione e di incubazione. (A) 0.1 micron non macchia abbastanza cellule, 5 micron esposizione colorazione aspecifica e concentrazioni di 0,5 micron e 1 micron macchiati quasi il 100% della popolazione, che mostra i tempi ottimali di incubazione dopo 30 minuti (a). (B) 'Live: morto' rapporti di segnali FL1 da una fase di crescita esponenziale e campioni trattati termicamente. Le concentrazioni di 0,5 micron e 1 micron mostrano una buona discriminazione dei segnali FL1 aumentando con il tempo di incubazione (rapporti RFU due ordini di grandezza). Le concentrazioni di 10 micron e oltre (non rappresentate sul grafico) mostrano scarso discriminazioni segnale di fluorescenza e la sovrapposizione di 'live' un'morti' popolazioni d. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6. percentuale di cellule etichettati con Orange Nucleic Acid Probe e il rapporto di 'Live' di Signals 'morto'. I risultati di variazioni di concentrazione e il tempo di incubazione in popolazioni di M.aeruginosa. (A) Media percentuale di cellule che avevano registrato un segnale di fluorescenza arancio in FL2 con concentrazioni di; 0,1 mM e 0,5 mM non colorazione abbastanza cellule, cellule vive 5 mM colorazione (colorazione non specifica), insieme con la concentrazione ottimale di 1 pM dopo 10 min (a). (B) La sonda arancione acido nucleico 'dal vivo: morti "rapporti in FL2 mostrano una buona discriminazione e non più di lappaturadi segnali di fluorescenza in concentrazioni di 1 micron o meno e poveri segnali FL2 sovrapposti (rapporti inferiore a un ordine di grandezza) con concentrazioni di oltre 1 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Conc. Tempo di incubazione (min)
(micron) 1 5 10 30 60
0.05 15.0 0.3 22.1 0.9 28.1 1.9 41.0 1.9 50.2 2.1
0.1 23.5 1.5 44.1 1.8 54.7 1.6 70,5 0.8 78.3 1.0
0.5 49.0 3.4 74.8 4.8 87.6 3.6 97.3 0.8 98,8 0.1
1 58,5 1.6 77.4 0.7 88.4 0.4 98.0 0.1 99,2 0.1
5 91,4 0.9 98,7 0.5 99.3 0.7 102.2 1.3 106.3 0.8
10 96.1 0.5 97,7 0.1 97,9 0.1 102.0 0.5 113.4 5.1
50 94.6 0.6 99,5 2.3 112.7 3.8 148,7 2.4 153,9 13.0
100 165,8 3.1 174.4 5.7 177,1 5.1 161.5 2.5 159,7 6.6

Tabella 1. Percentuale assorbimento di Green Nucleic Acid sonda nelle celle. Tabella che riporta i dati del test di ottimizzazione usando la sonda di acido nucleico verde e un 'live' e il 50% 'morto' (trattato termicamente) campione 50% della popolazione. Le percentuali medio di cellule che hanno registratoverde nucleico acido sonda a fluorescenza (FL1) sono stati calcolati rispetto al numero totale di cellule "morti" ottenuti da un conteggio FSC-H. Valori superiori al 100% mostrano colorazione aspecifica (SE sottolineato).

Conc. Tempo di incubazione (min)
(micron) 1 5 10 30 60
0.05 92.9 5.4 170.0 10.9 237.2 14.9 385,5 15.0 481,9 17.7
0.1 178,3 18.1 343,0 19.5 437,0 20.6 619,1 12.1 714,1 14.8
0.5 202.5 5.9 308.3 13.1 365,8 33.5 426,8 67.2 480,4 73.2
1 205,8 12.1 225,9 13.7 237.3 15.6 241,5 5.8 263,1 8.1
5 69.9 2.6 53.0 0.6 40.2 1.7 27.1 3.7 21.1 3.4
10 44.3 2.9 28.7 5.6 23.6 4.9 11.6 1.2 7.6 1.4
50 6.9 0.1 3.9 0.1 2.9 0.1 1.2 0.1 1.1 0.1
100 1.7 0.1 1.3 0.1 1.1 0.1 0.8 0.1 0.8 0.1

Tabella 2. Rapporto di Green segnali di fluorescenza in 'live' e cellule colorate M.aeruginosa 'morti'. Discriminazione FL1 segnale tra le cellule colorate con la sonda di acido nucleico verde e non specifici registrazioni intrinseche. Il campione conteneva un 50% di 'live' e il 50% 'morto' (trattato termicamente) M.aeruginosadella stessa popolazione misurato su tutti i tempi di concentrazione e di incubazione (SE sottolineato).

Conc. Tempo di incubazione (min)
(micron) 1 5 10 30 60
0.05 4.0 0.3 14.9 0.2 23.5 0.8 39.1 2.4 37.6 1.5
0.1 14.6 0.4 42.2 0.5 55.0 1.1 72.8 0.9 80.2 0.1
0.5 54.5 0.4 79.8 1.2 86.4 0.4 91.2 0.1 93.2 0.1
1 92.0 0.8 94,8 0.1 96.9 0.6 98.4 0.6 98.4 0.3
5 91,4 1.5 93.5 1.8 102.9 5.4 118,9 0.1 124,8 0.1
10 95.9 1.0 102.4 1.8 132,9 6.0 148,9 4.8 132,8 5.1
50 107.5 3.7 130,6 16.6 145.2 0.2 135.4 16.2 114.6 6.6
100 97,1 0.1 130,7 7.8 166.1 3.5 144.7 6.8 115.1 6.2

Tabella 3. Percentuale assorbimento di Orange Nucleic Acid sonda in cellule. Tabella con i dati di ottimizzazione usando la sonda di acido nucleico arancia e un 50% di 'live' e il 50% 'morto' (trattato termicamente) campione di popolazione. La percentuale media di cellule che hanno registrato arancione nucleico acido sonda a fluorescenza (FL2) sono stati calcolati rispetto al numero totale di cellule "morti" da un conteggio FSC-H (SE sottolineato).

Conc. Tempo di incubazione (min)
(micron) 1 5 10 30 60
0.05 20.4 0.9 41.3 1.3 56.1 2.4 80,4 3.6 83.3 1.8
0.1 31.2 1.4 76,1 2.4 100.9 3.1 146.2 0.6 158.3 0.4
0.5 80.6 0.4 124,9 2.4 137.3 1.1 138,7 </ td> 2.1 132,8 3.9
1 89.7 16.0 80.9 16.9 69.1 10.7 43.0 5.7 35.9 6.5
5 10.4 0.6 7.5 0.1 5.0 1.0 2.7 0.5 1.5 0.1
10 7.0 0.1 3.6 0.3 2.2 0.4 1.6 0.1 1.2 0.1
50 2.2 0.4 1.6 0.3 1.3 0.0 0.6 0.1 0.3 0.0
100 1.7 0.1 1.1 0.1 0.7 0.1 0.3 0.0 0.5 0.2

Tabella 4. Rapporto di Orange acido nucleico in 'live' e cellule colorate M.aeruginosa 'morti'. Discriminazione FL2 segnale tra le cellule colorate dalla sonda arancione acido nucleico (FL2) e non specifici registrazioni intrinseche. Il campione conteneva un 50% di 'live' e il 50% 'morto' (trattato termicamente) M.aeruginosa della stessa popolazione misurato su tutti i tempi di concentrazione e di incubazione (SE sottolineato).

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Discussion

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Le aumento del numero di pubblicazioni utilizzando sonde molecolari indica che i dati affidabili e informativi possono essere ottenuti 5,6,8 - 15,19,22,23. Come ancora non c'è nessuna macchia perfetta per la vitalità cellulare che può essere efficace in tutte le specie con la stessa concentrazione e l'incubazione tempo 6,10. Anche lo stesso tipo di sonda con emissioni di fluorescenza alterati mostra la necessità di stabilire la concentrazione e l'incubazione ora corrette (Tabelle 1 e 3). Come si è visto quando si utilizza questo protocollo, la concentrazione e l'incubazione momento ottimale per arancione sonda di acido nucleico si trova a 10 minuti a 1 micron, mentre la sonda verde acido nucleico avrebbe bisogno solo di metà della concentrazione, ma prende tre volte più lunghi (figure 5 e 6). Entrambi questi monomeri cianinici cellule impermeant con concentrazioni superiori a 1,0 micron iniziato a produrre una sovrapposizione delle emissioni di spettri con cellule non-membrana feriti. Questa sovrapposizione di Signals fornisce la prova che la colorazione non specifica verifica in cui le cellule 'live' stanno prendendo la sonda molecolare. La risultante su fluorescenza da colorazione aspecifica generato falsi positivi, sottolineando la necessità di uno sviluppo del protocollo da stabilire con attenzione per ogni sonda molecolare e bersaglio organismo. Le fasi più critiche nella ottimizzazione una sonda molecolare sarebbero: 1) comprendere come la sonda molecolare interagisce con lo strumento FCM; 2) l'adozione di idonei dal vivo e controlli morti; 3) sviluppare la conoscenza di gating parametri dalle uscite FCM e 4) la modifica del protocollo attraverso la comprensione degli ambienti in-situ.

La sorgente di luce, filtri ottici, capacità di cambiare tensione PMT e rivelatori all'interno citometri a flusso variano da produttore a produttore, così la consapevolezza di ciò eccitazione lunghezza d'onda del laser e dove gli spettri di emissione si trova in rapporto ai canali di fluorescenza sono cruciali. Con le acquisizioni di dati,soglie possono essere imposte crescente risoluzione che altrimenti andrebbe perso forse il rumore di fondo, detriti o aggregati di cellule morte. Sonde molecolari possono offrire comprensione della vitalità delle specie senza coltivazione, attraverso singoli parametri quali, potenziale di membrana, il contenuto di DNA e l'attività enzimatica. Tuttavia, all'interno di campioni ambientali ci possono essere molti organismi di dimensioni cellulare simile e fluorescenza. Inoltre all'interno delle culture uniagal, popolazioni di cellule avranno inevitabilmente un certo grado di stati fisiologici 3, che possono influenzare l'assorbimento molecolare sonda. Uno dei principali vantaggi di FCM è la sua capacità di distinguere e caratterizzare stati fisiologici a livello di cella singola in tempo reale, che è essenziale quando si studia microrganismi vitalità in situ, in quanto sono spesso sottoposti a condizioni rapide e dinamiche. Nonostante l'uso frequente, il concetto di vitalità cellulare rimane difficile da definire. Di solito applicata alla proliferazione cellulare,viabilità è molto segnato su un approccio basato sulla crescita. Questa ipotesi Underpinning potrebbe cadere a breve, come le condizioni non può soddisfare le singole cellule per riprodurre, ma può essere ancora tollerabile. Le cellule in uno stato fisiologico nonproliferating che hanno concluso un quiescenza o G (0) fase del ciclo cellulare 27 non possono interagire con una sonda molecolare dando falsi negativi nel ciclo di DNA o metabolica sonde basati.

Utilizzando cellule di laboratorio di produzione o isolati a fresco per ottimizzare sonde molecolari aiuterà la raffinazione di dati utilizzati negli studi ecologici. Le cellule utilizzate nella ottimizzazione da culture lotti sono comunemente prese a fasi stazionarie esponenziale o precoci e presume che la più alta redditività. Tuttavia, cautela deve essere presa quando si utilizzano alte densità cellulari, quelli in una fase tardiva stazionaria o microbi che producono matrici extracellulari. In questo protocollo il controllo della popolazione di cellule morte sono stati esposti a 60 ° C di calore per 1 ora,con la conferma di danno alla membrana e degrado pigmento visto attraverso microscopio (Figura 4) e le uscite di fluorescenza FCM (figure 2 e 3). Simulando le cause di morte naturale delle cellule è estremamente difficile come; ingestione da erbivori, lisi virale, morte cellulare programmata o la possibilità di divisione asimmetrica 24 non sono sempre fattibili o essere osservati in condizioni di laboratorio. Modalità sperimentali di moralità sono spesso in discussione in quanto non possono essere equivalenti alle sollecitazioni indotte dall'ambiente (ad esempio, l'uccisione di calore) e non ci può essere una risposta eterogenea, per cui alcuni individui vengono uccisi e di altre cellule non mostrano alcuna degradazione cellulare osservabile o la morte di 3 , 25. Per evitare un tale paradosso la definizione operativa con la quale gli esperimenti di misura devono essere stabiliti chiaramente in modo da non creare confusione 6,23, facilitando la normalizzazione tra gli studi.

Vari metodi alternativi have stato impiegato per la vitalità cellulare analisi culture in combinazione con sonde molecolari. Epifluorescenza è una tecnica tradizionale utilizzata, anche se photobleaching o l'introduzione di segnali manufatto da cellule vicine può dare un sotto o sopra stima di un popolazioni stato fisiologico se non registrati abbastanza rapidamente. Questo rende ottimizzazione attraverso l'imaging molto difficile, con potenzialmente scarsa precisione. La valutazione genomica di vitalità cellulare utilizzando sia DNA e RNA metodi di amplificazione come; reazione a catena della polimerasi (PCR), trascrittasi inversa (RT-PCR) e nucleico amplificazione basato su sequenza di acido (NASBA) sono stati utilizzati anche. Tuttavia, la valutazione genomico serve solo come un metodo indiretto di convalida redditività come la persistenza di acido nucleico dipende fortemente dalle condizioni ambientali, con la correlazione di vitalità cellulare attuale potenzialmente variando immensamente 28. Usando una combinazione di diffusione della luce e / o fluorescenza attraverso foto naturalipigmenti sint (Figura 1) gating delle popolazioni può: delibera di aumento di dati, individuare risposte rara popolazione e ridurre i falsi positivi. FCM lungo sonde molecolari si distingue dalle precedenti tecniche menzionate in fase di test fisiologico singola cella per la sua velocità, la precisione e la registrazione di più parametri.

FCM è un potente strumento analitico in microbiologia acquatica e con l'aggiunta di sonde molecolari ha un ampio potenziale in una serie di settori, tra cui, solo cellulari e di analisi comunitari per i settori industriali (ad es., Il monitoraggio di acqua potabile). Progressi futuri potrebbero vedere FCM incorporare ibridazione in situ fluorescente (FISH), in grado di rilevare e localizzare specifiche sequenze genetiche nelle cellule individuali all'interno di campioni eterogenei densi. Lo sviluppo di FCM e portabilità sonda molecolare per le registrazioni in situ potrebbe fornire dati vitali su fonti d'acqua per realizzare primi sSTRATEGIE per la gestione delle risorse. A seguito del protocollo di ottimizzazione sviluppato qui, FCM e sonde molecolari in grado di svolgere un ruolo fondamentale nel fornire dati preziosi sulla fisiologia microbica in ambienti acquatici.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgments

Gli autori vorrebbero riconoscere dottorando Dave Hartnell e Università di Bournemouth per il sostegno e il finanziamento per la ricerca e le strutture.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cyanobacteria Media Sigma-Aldrich C3061-500ML BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution)
Decontamination Fluid BD Biosciences 653155 Run for 2 min when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µl/min.  Followed by 2 min of sheath H2O.
Flow Cytometer BD Biosciences by request BD Accuri C6
SYTOX Green Life Technologies S7020 Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO
SYTOX Orange Life Technologies S11368 Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO

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Molecular Probe Optimization per determinare mortalità delle cellule in un organismo fotosintetico (<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) In citometria a flusso
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Chapman, I. J., Esteban, G. F., Franklin, D. J. Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (107), e53036, doi:10.3791/53036 (2016).More

Chapman, I. J., Esteban, G. F., Franklin, D. J. Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (107), e53036, doi:10.3791/53036 (2016).

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