Summary
Mikrobiella populationer innehåller väsentliga cell heterogenitet, som kan diktera övergripande beteende. Molekylär probe analyser genom flödescytometri kan bestämma fysiologiska tillstånd av celler, men dess tillämpning varierar mellan arter. Denna studie ger ett protokoll för att exakt bestämma cell dödlighet inom en cyanobakterie befolkning, utan att underskatta eller spela falskt positiva resultat.
Abstract
Microbial subpopulationer i fält- och laboratoriestudier har visat att visa hög heterogenitet i morfologiska och fysiologiska parametrar. Fastställande av realtids tillståndet hos en mikrobiell cell går utöver levande eller döda kategorier, eftersom mikrober kan existera i ett vilande tillstånd, varvid celldelning och metaboliska aktiviteter minskar. Med tanke på behovet för detektering och kvantifiering av mikrober, flödescytometri (FCM) med molekylära sonder ger en snabb och noggrann metod för att avgöra den totala befolkningen livskraft. Genom att använda Sytox Grön och Sytox Orange i modellen cyanobakterier Microcystis aeruginosa att upptäcka membranintegritet, utvecklar vi en överförbar metod för snabb indikation på en enda cell dödlighet. De molekylära prober används inom den här tidskriften kommer att kallas grön eller orange nukleinsyraprober respektive (även om det finns andra produkter med liknande excitations- och emissionsvåglängder som har en jämförbar sätt action, vi särskilt hänvisar i förgrunden nämnda prober). Protokoll som använder molekylära sönder varierar mellan arter, som skiljer sig huvudsakligen i koncentration och inkubationstider. Efter denna protokoll som anges på M.aeruginosa den gröna nukleinsyrasonden optimerades vid koncentrationer av 0,5 ^ M efter 30 min av inkubation och den orange nukleinsyrasonden på en iM efter 10 minuter. I båda sonder koncentrationer mindre än den angivna optimala lett till en underrapportering av celler med membranskada. Omvänt, 5 pM koncentrationer och högre i båda sonderna uppvisade en typ av icke-specifik färgning, varvid "live" celler producerade ett mål fluorescens, vilket leder till en överrepresentation av "icke-viabla 'cellantal. De positiva kontrollerna (värmeavdödade) gav testbar död biomassa, även om det är lämpligt att kontrollen generation fortfarande föremål för debatt. Genom att visa en logisk följd av åtgärder för att optimera den gröna och orange nukleinsyraprober vi demonstrate hur man skapar ett protokoll som kan användas för att effektivt analysera cyanobakterier fysiologiska tillstånd.
Introduction
Cellen är ett komplext system, som ständigt svarar på miljön genom att modifiera fysiologiska parametrar och att ändra dess funktion. Populationsdynamik av isogena mikrobiella populationer både i naturen och laboratorie påverkas av utvecklingen av subpopulationer, förekommer även under relativt konstanta miljöförhållanden 1 - 3. Variabiliteten av naturliga mikrobiella samhällen uppstår på grund av den mycket varierande naturen av miljöförhållanden. Dessa ibland stokastiska processer därefter producerar subpopulationer som är mycket annorlunda än befolkningen i genomsnitt. Nya rön har visat att dessa fysiologiska delpopulationer reagerar olika på miljöförhållanden och kan producera signal föreningar eller inhibitorer som dramatiskt påverkar och påverka den totala populationen 3,4.
Upprättande av en metod för att definiera heterogenitet inom en population är nyckeln till unelse ekologi mikrober i olika miljöer och är viktigt när man bygger kunskap om olägenhet cyanobakterier, såsom giftiga Microcystis, som påverkar tungt på människors vattensäkerhet. Arter som Anabaena visa morfologiska heterogenitet som svar på miljöförändringar, utveckling av specialiserade celler som heterocysts och akinetes 2. Däremot behöver Microcystis cellerna inte visa uppenbara morfologisk heterogenitet under en stressreaktion. Diskrimineringen mellan viabla och icke-viabla celler är den viktigaste aspekten av fysiologisk differentiering och möjliggör en bättre förståelse av mikrobiella populationsdynamik. Men fortfarande svårt och dåligt kännetecknas 1,5,6 den konceptuella problemet med bakterie lönsamhet själv.
Flödescytometri (FCM) är en pålitlig och snabb metod för att analysera enskilda celler. För att öka förståelsen för en enda cell fysionik genom FCM har molekylära sonder använts för att skilja ett antal metaboliska och biokemiska processer 7. Detta har lett till ökad kunskap om arter på cellulär och befolkningsnivå och i sin tur bidragit till vattenresursförvaltning 8,9. Men organismer skiljer sig i fråga om molekylär sond upptag och utflöde på grund av porer och pumpar i cellväggar och membran, som har lett till ett antal molekylär sond konstruktion och protokollförs 6,10,11. Molekylära prober tillgängliga för kommersiella och forskningsändamål levereras ofta med en generisk protokoll som kan tillämpas på en helt annan celltyp. Man måste vara mycket försiktig med att överföra protokoll som utvecklats för en celltyp till en annan 6, är det därför en viktig uppgift att optimera molekylära sonder effektivt före användning.
Den gröna och orangea nukleinsyrasonder binder till både dubbel- och enkelsträngade nukleinsyror med minimal grund väljivity och används för att bedöma plasmamembranintegritet av celler. Den gröna nukleinsyraprob har en markant förbättrad cellmärkning fluorescenssignal i förhållande till andra molekylära prober, såsom propidiumjodid baserade föreningar 12, vilka även kan fungera som en indikator på cellviabilitet. Uttrycket "cellviabiliteten" här förutsätter att DNA nedbrytning sker efter förlusten av plasmamembranet integritet. Nukleinsyrasondema är osymmetriska cyaninfärgämnen med tre positiva laddningar och kan inte komma in i cellerna med intakta membran enligt kännetecknas koncentrationer i både eukaryota 11,13 och prokaryota 14,15 organismer. Bindningen av en nukleinsyrasond till nukleinsyror kan resultera i upp till en> 500-faldig ökning av fluorescensemissioner från endogena signaler i celler som har sin membranintegritet äventyras. Även om molekylära prober, såsom den gröna nukleinsyraprob kan vara en bra indikator på enkelcellfysiologi, finns det ett behov to optimera varje sond med det avsedda målorganismen, som inkubationstider har varierat från 7 min - 30 min och koncentrationsintervall från 0,1 iM - 0,5 iM i Microcystis experiment enbart 15-19.
Här presenterar vi ett protokoll för att optimera cytometrisk analyserna av grönt och de relativt nya apelsin nukleinsyrasonder (som hittills inte testats på blågrön arten M.aeruginosa). Följande utvecklad metodik kan sedan överföras till andra arter och användas som en plattform för att optimera protokoll i andra molekylära sonder, vilket ökar förståelsen av mikrober och deras ekologiska beteende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av Molecular Probe och flödescytometer
- Utspädda förrådslösningar av nukleinsyra-prober, som levereras som en 5 mM lösning i dimetylsulfoxid (DMSO) och alikvoter av passande koncentrationer ultrarent filtrerad H2O
- Förvara nukleinsyrasondema i mörker mellan -5 ° C och - 25 ° C fram till användning.
- Slå på flödescytometern och last programpaket (se tabell över Materials / Utrustning för FCM specifikationer).
- Placera ett tomt hemolys rör (12 x 75 mm) på prov induceringssonden (SIP), klicka på rensa och sedan tillbaka spola att starta rengöringsprocessen FCM.
OBS: Några exempel steg för SIP kan rymma flera olika typer av rör, inklusive mikrocentrifugrör. Molekyl sökfragmentsutspädare och omslutande vätska som används i FCM-anordningen är från en analytisk kvalitet "typ 1" 0,22 ^ m membranfiltreras källa. - Platsett nytt hemolys rör med 2 ml ultrarent filtrerad H2O på SIP, sätta en tidsgräns för 10-15 minuter och en fluidhastighet till snabb (eller en flödeshastighet på> 66 ul / min).
- Välj en ny datacell, sätta på relevanta tröskelvärden för fluorescens och ljusspridning kanaler för att minska bakgrundsljud och klicka på "kör".
- Om de totala händelser per sekund är inte under tillverkarens rekommendation, kör sedan en 2 ml prov av dekontamineringslösning under 2 min på snabbt och sedan upprepa steg 1,4 och 1,5.
OBS: Kontrollera tillverkarens rekommendationer för FCM uppstart rengöringsprotokoll, eftersom de kan variera mellan olika modeller. Testning för specifika trösklar måste också ligga i linje med FCM modellen viss utrustning gör det möjligt för användaren att tillämpa spänningar vinster för fotomultiplikatorrören (PMTs) förbättrar eller minskar den elektriska signalen registrerades från de optiska detektorerna. FCM-modell som används i detta experiningen har fast spännings PMTs och använde en tröskel på 80000 framåtljusspridning (FSC-H) för att utesluta partiklar som är mindre än 2,0 pm och elektroniskt brus.
2. Beredning av kulturer och Initial celltal
- Autoklav 98 ml ultrarena filtrerad H2O och 2 ml alger media (x50 koncentration) i en 250 ml bägare under 20 minuter vid 120 ° C
- Från en initial monokultur av M.aeruginosa (PCC 7806) i en hög steady state densitet plats 2 ml av provet i ett rör under SIP. Dela upp varje kolonibildning genom skakning eller sonikering 20 och bekräfta jämnt fördelade celler genom ljusmikroskop.
OBS: Överdriven exponering för ultraljudsvågor kan leda till cell-lys och bör användas med försiktighet. Eftersom ultraljudsbehandling kan kollapsa gasblåsor (som återfinns i arter som M.aeruginosa) utgångar, såsom sidoljusspridning (SSC-H) intensitet kan bli mer sensitive. - Inom FCM programvara, välj ett histogram komplott för att spela in data från framåtljusspridning (FSC-H) och konfigurera tomten specifikationer genom att klicka på "log" för att visa i en logaritmisk skala på axeln.
- I en separat utgång, välj ett annat histogram (log axel) för att spela in naturliga fluorescens såsom tillbehörsfotopigment fykocyanin (FL4-H, 675 ± 12,5 nm), som finns i M.aeruginosa.
- Använd en ljuskälla som kan hetsas fykocyanin och en detektor som kan filtrera utsläppen från den resulterande fluorescens.
OBS: Photosynthetic pigment såsom klorofyll kan exciteras med den vanligen använda 488 nm blå laser, medan fykocyanin exciteras över 600 nm och kommer endast att detekteras med en röd ljuskälla 21. Kontrollera med flödescytometrar tillverkaren för excitation ljuskällor och spektra av utsläppsdetektorer, här både en 488 nm och 640 nm laser användes tillsammans meden 675 ± 12,5 nm optiskt filter. - För registrering av de utvalda inställningar närmast kärn storlek målorganismen (10 nm) och en relativt långsam flödeshastighet (14 ul / min) högsta upplösning.
OBS: För bästa upplösning prover bör köras enligt tillverkare rekommendation av händelser per sekund. - Innan de kan få uppgifter använder en tröskel till gate ut ljusspridning och / eller fluorescens signaler som orsakas av elektronisk bakgrundsljud eller cellprov skräp.
- Välj en ny datacell skapar en täthet tomt med FSC-H och SSC-H-parametrar på en logaritmisk skala och sedan på Kör.
- Om provtätheten leder till en överdriven händelsehastigheten, kan utspädnings åtgärder vidtas för att öka noggrannhet och precision.
- På densiteten tomten gäller mjukvaru grindar från tidigare histogrammet att utesluta låga nivå spridningssignaler, som produceras av bakgrundsljud eller skräp (FSC <320000). Omvänt grind högre relativ fluorescensfykocyanin signaler från celler och endast inkludera dessa händelser (FL4, 56000 - 1950000).
- Använd antalet celler som registrerats i gated områden och dela det med den totala volymen av prov som har passerat genom FCM för att räkna ut hur många celler per ml.
OBS: FCM modell som används här har en mikroprocessorstyrd peristaltisk pump system som gör prowolym som skall bestämmas. Andra FCM utrustning kan kräva en kalibrerad pärlsuspensionen eller en beräkning av H2O vikt / volymskillnader för att kontrollera den totala provvolymen. - Tillsätt önskad volym av celler till de nylagade media för att starta ett parti tillväxtcykel (250.000 celler / ml) i M.aeruginosa.
OBS: Arter kommer att skilja sig i tillväxttakten beroende på deras in situ parametrar miljö och näringsinnehåll tillgänglighet, så en satscykeln bör förinspelade för att bestämma livscykelfaser.
3. Optimnisation för molekylär Probe Cell Upptag
- Harvest hälften av M.aeruginosa kulturen som framställts i steg 2 från en exponentiell fas och använda som en "levande" kontroll.
OBS: Prov utspädda från en hög densitet kultur direkt till en exponentiell fas kan påverka optimering resultat genom död cell omsättning, jämfört med den av kulturer som ympats från en initial lag / induktionsfasen. - Förbered den andra halvan som en "död" kontroll med hjälp av metoder såsom 70% etanol, uppvärmning av prover vid 60 ° C under 1 timme, paraformaldehyd eller 4% formaldehyd i 30 minuter 6,11,22. Kolla variationer i prov mikro (t ex., PH).
OBS: Den positiva, värmeavdödade, "död" kontroll i M.aeruginosa skiljer sig från en "levande" provet genom dess minskning av fykocyanin signaler. Induktion dödlighet med andra metoder får inte orsaka samma effekt och kommer VARy i arter. - Inrätta blandade prover med olika förhållanden av "live" och "döda prover (t.ex. 0%, 25%, 50%, 100%).
- Dela upp kolonibildning genom virvling eller ultraljudsbehandling och kontrollera pH.
- Välj en 488 nm laser tillsammans med detektorer som kan spela in fluorescens från den gröna (FL1, 530 ± 15 nm) och orange (FL2, 585 ± 20 nm) nukleinsyrasökfragment och 640 nm laser för att spela fykocyanin signaler via sin respektive detektor.
ANMÄRKNING: När bundet till DNA, har det gröna nukleinsyrasonden en ungefärlig fluorescens excitationsvåglängd av 504 nm och emissionsmaxima av 523 nm, medan den orange nukleinsyrasonden har en excitationsvåglängd av 547 nm och utsläpp maxima av 570 nm. En 488 nm argonjon solid state laser kan användas för att excitera både molekylära sonder, kommer dock en grön laser (upp till 547 nm) ger en högre apelsin fluorescens. - Som utgångspunkt, införamolekylär sond med tillverkarens rekommenderade koncentration till 50% "live" och 50% "död" kultur och inkubera i mörker.
- Välj en ny datacell, placera provet under SIP med trösklar och triggers som kommer att minska bakgrundsljud (FSC-H 80000).
- Skapa en densitet tomt med FSC-H och SSC-H-parametrar, och tre histogram. Ett histogram med hjälp av respektive molekylär sond optisk detektor kanal (FL1 eller 2), att man detektera fykocyanin utsläpp (FL4-H) och den andra FSC-H, allt på en logaritmisk skala.
- Inkubera proverna av M.aeruginosa med nukleinsyraprober i mörker under upp till 60 minuter, inspelning i separata dataceller, vid ett antal tidpunkter (1, 5, 10, 15, 30 och 60 min).
OBS: När du justerar parametrar såsom pH check med tillverkare för eventuella reaktioner från vissa kemikalier (för den testade nukleinsyraprober en buffert kan inte innehålla fosfater eller höga halter av monovalent eller divalånade katjoner, som bindnings med DNA kommer att minska). - Applicera en programvara port till endast omfatta FSC-H histogram (320000 - 1500000) för målorganismer cellstorleken, i respektive fluorescenssonden kanal histogram.
OBS: De koncentrationer som användes i detta protokoll var 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 och 100 pM, som kan ändras genom att antingen öka eller minska volymen av M.aeruginosa prov eller initial stamlösning av nuklein prober. - I fluorescenssondkanalen, tillämpa en annan allomfattande program porten till den högsta toppen i histogrammet (grön FL1-H, 240000 - 1650000, orange FL2-H, 30000 - 165000) och därefter grind som positiva sond fluorescens i densiteten tomten.
- Kör steg från 3,1 till 3,11 med 100% "levande", 100% "döda" och alla blandade odlingsprover, justera de molekylära sondkoncentrationer (t.ex. x 0,1 x 10) och / eller temperatur och pH-värden om det behövs. <li> Jämför antalet positiva molekylär sond fluorescenssignaler till den ursprungliga celldensiteten av "döda" celler (tagen från halv totala FSC-H eller en 100% "död" kultur) för att hitta det totala procenttalet av celler som färgades med nukleinsyran prober.
- Gör detta för varje tidsperiod inom varje koncentration för att hitta den optimala protokollet för den största andelen av cell nukleinsyra sond upptag utan att producera icke-specifik färgning (använda de medel i en enkelriktad ANOVA eller Kruskal-Wallis envägs variansanalys, om uppgifterna är icke-parametrisk).
4. Molekylär Probe Fluorescens Diskriminering
- Vid testning av fluorescens störningar / överlappning från inneboende eller icke-specifik cellfärgning välja de 50% "levande" och 50% "döda" blandade kulturuppgifter och ta bort alla grindar.
- Applicera en programvara port till endast omfatta FSC-H histogram (320000 - 1500000) för målorganismer cellstorleken, i fykocyaninkanal histogram.
- Gate högsta fykocyanin topp och etikett som "levande", med tillägg av de lägsta toppen märkta som "död".
- Gör en ytterligare grindsteg i respektive molekylära sond fluorescenshistogram kanal med en i taget, den "levande" och sedan "död" fykocyanin (FL4) signaler, som registrerar både medel våglängder.
OBS: Läget för att inducera mortalitet i detta experiment gjordes av värmebehandling, som enligt detta protokoll tydligt minskar fykocyanin signaler. Andra metoder för framställning av populationer av "döda" celler kan ge olika effekter i de förvärvade körningar. - Ratio de genomsnittliga våglängderna positiva molekylära sond fluorescens ("död") och den inneboende / icke-specifik signal ("live") för att bestämma protokoll känslighet.
OBS: För att förbättra fluorescens diskriminering "live" och "död" popultioner, öka kolkällan till aktiv fläck upptag i närings utarmade celler eller etylendiamintetraättiksyra (EDTA) för att förbättra cellväggspermeabilitet och resulterande fluorescenssignaler 6. Begränsad ersättning i vissa FCM modeller för spektral överlappning kan utföras av användaren manipuleras parvis korrigering under prov förvärv (PMT spänningsändringar) eller post-analytiska specialiserad mjukvara. - Välj den optimerat protokoll där den högsta mängden av "döda" celler har färgats utan förekomst ospecifik färgning. Om ett antal prov har liknande resultat acceptera protokoll med den lägsta koncentrationen och inkubationstiden, tillsammans med god fluorescenssignal diskriminering. Följ tillverkarens anvisningar för cytometern avstängningsproceduren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Framåtriktad ljusspridning (FSC) och sidoljusspridning (SSC) utgångar från en M.aeruginosa satsvis odling i exponentiell fas ger information om cellstorlek (diameter) och intern kornighet respektive (Figur 1A). FSC kan skilja celler som är för stora och / eller liten för att vara M.aeruginosa. Denna diskriminering eller grind kan göras genom raffinering data mellan vissa punkter i en FSC-utgång (Figur 1C). Fykocyanin, en stor konstitution M.aeruginosa fotoapparat ger en stark signal när förhördes av en röd ljuskälla (ex: 640; em: 675 ± 12,5 nm), som kan användas för att ytterligare gate populationer, liknande den som görs i FSC gating men med fluorescens (figur 1D). Från FSC och fluorescens signaler kan data gated från den ursprungliga produktions (Figur 1A) särskilda uppgifter om M.aeruginosa för fInal kroppar (figur 1B).
Autofluorescens per cell i cyanobakterier populationer skiljer sig som en funktion av fysiologiskt tillstånd. Här celler skördades från en exponentiell fas kultur visar relativt hög långt röd fluorescens för en "levande" kontrollpopulation och "döda" kontroll utsattes för 60 ° C värme under 1 timme. När "live" högre pigmenterade och "döda" lägre pigmente kontroller blandas minskande förskjutning i autofluorescens är klart (figurerna 2A och B). Den "döda" cell fluorescens och FSC parametrar kan användas för att särskilja de totala cellerna som har tagit upp den molekylära proben. I membran äventyras eller "döda" celler nukleinsyrasondema kommer att producera en extra signal, antingen på; FL1 kanal (530 ± 15 nm) för den gröna nukleinsyrasonden eller FL2-kanalen (585 ± 20 nm) för den orange nuk acid sond (figurerna 3A och B), jämfört med den nativa "live" fluorescenssignal. Bekräftelse av både nukleinsyraprober i celler med skador membran kan ses genom epifluorescensmikroskopi (figurerna 4A & D).
Den totala andelen av celler som hade färgas av den gröna nukleinsyrasonden erhölls från blandade prover, som var pre-gated att endast M.aeruginosa storlek celler från en FSC-H histogram (320000 - 1500000). I en 50:50 "live: död" prov, grön fluorescens celler gated från den högsta toppen i en FL1 (530 ± 15 nm) histogram jämfördes med ursprungliga densitet i "döda" cellpopulation (antingen genom att halvera den totala FSC H eller köra en separat cellräkning på endast 100% "döda" cellprover i). Ovanför 100% skulle indikera att icke-specifik färgning sker. Medelvärdet procenttal celler som hade tagit upp den gröna nucleic acid prob varierade från; 15 ± 0,3% under 0,05 ^ M en efter min till 177,1 ± 5,1% under 100 | iM under 10 min av inkubation (tabell 1). Koncentrationer över 1 iM (exklusive) visade icke-specifik färgning (dvs., "Live" celler som började ta upp den molekylära proben). En två-vägs ANOVA mellan koncentrationerna som inte uppvisar icke-specifik färgning (0,05 - 1 ^ M) och som visade en övergripande signifikant skillnad i interaktionen mellan koncentrationen av gröna nukleinsyraprob och inkubationstid i M.aeruginosa, F (12 , 40) = 6,48, p <0,001. Det fanns en huvudeffekt över koncentrationerna av grönt nukleinsyraprob används F (3, 40) = 836,92, p <0,001 och inkubationstider F (4,40) = 347,98, p <0,001. Efter-Hoc Tukey-test indikerade en signifikant skillnad mellan alla koncentrationer utom 0,5 och 1 | iM (p <0,001) och ensignifikant skillnad mellan alla inkubationstider på ett - 60 min (p <0,001). Emellertid en post hoc-Tukey Test från en One Way ANOVA avslöjade medelvärdet upptag av grönt nukleinsyraprob skiljer sig inte mellan 30 och 60 min för 0,05 fiM (p> 0,05) och 1 ^ M (p> 0,05) (figur 5A). Den genomsnittliga förhållandet mellan "levande" och "döda" relativa fluorescenssignaler i FL1 diskriminerings populationer (mäts genom FL4) varierade i den gröna nukleinsyrasonden från den högsta i 0,1 iM efter 60 min av 714 ± 14,8 (RFU) till lägsta av 0,8 ± 0,0 (RFU) i 100 ^ iM efter 30 minuter (Tabell 2). Jämföra förhållandet mellan relativ fluorescensenheter (RFU) för diskriminering intensitet i "live" och "död" FL1 signalerar en Two Way ANOVA redovisar en övergripande signifikant skillnad i interaktionen mellan koncentrationer och inkubationstider F p <0,001 med den gröna nukleinsyraprob. Det fanns också en signifikant skillnad i den huvudsakliga effekten i alla koncentrationer F (7,80) = 475,41, p <0,001 och inkubationstider F (4,80) = 78,28, p <0,001. Förhållandena diskriminering av fluorescenssignaler mellan "live" och värme dödade "döda" celler ökade med tiden mellan koncentrationer av 0,05 um och en iM men minskade mellan 5 iM och 100 ^ M (figur 5B).
Den procentuella andelen celler som färgades med den orange nukleinsyraprob såg en genomsnittlig låg procentandel av 4 ± 0,3%, i en koncentration av 0,05 | iM efter en minut, stiger till 166 ± 3,5% under 100 ^ M efter 10 min av inkubation (tabell 3). Återigen koncentrationer över 1 iM presenterade även icke-specifik färgning av levande celler. A Two-Way ANOVA between koncentrationerna som inte visade någon ospecifik färgning (0,05 - 1 pM) rapporterade en total signifikant skillnad i interaktionen mellan alla koncentrationer av den orangefärgade nukleinsyrasonden och inkubationstider i M.aeruginosa, F (12, 40) = 133,55, p <0,001. Det fanns en statistiskt signifikant huvudeffekt över koncentrationer F (3, 40) = 6919,67, p <0,001 och inkubationstider F (3, 40) = 1161,45, p <0,001. Men en post hoc-Tukey-test genom en One Way ANOVA på bara 1 iM indikerade att inkubationstider mellan 10, 30 och 60 minuter hade ingen statistisk skillnad i upptag av apelsin nukleinsyraprob (alla p> 0,05) (Figur 6A). Fluorescenssignalen diskriminering mellan "levande" och "döda" färgade befolkningen i FL2 varierade i orange nukleinsyrasond från den lägsta på 0,3 ± 0,0 (RFU) efter 60 minuter i 50 iM och 30 mii 100 iM till högsta 158,3 ± 0,4 (RFU) efter 60 minuter vid en koncentration av 0,1 pM (tabell 4). A Two Way ANOVA rapporterat en ökad total statistisk signifikans i samspelet mellan koncentration och inkubationstid F (28, 80) = 28.12, p <0,001. De huvudsakliga effekterna av koncentrations F (7, 80) = 607,9, p <0,001 och inkubationstider F (4, 80) = 31,24, p <0,001 befanns också bli väsentligt annorlunda. Fluorescens diskriminering mellan signalerna från "levande" och värme dödade "döda" celler i FL2 ökade med tiden mellan koncentrationer av 0,05 um och 0,5 iM men minskade mellan 1 iM och 100 ^ M (figur 6B). Därför den optimala koncentrationen för den gröna nukleinsyrasonden är 0,5 pM med en inkubationstid på 30 min och för den orange nukleinsyrasonden den optimala koncentrationen är 1 | iM incubetas för 10 minuter.
Figur 1. FCM utgångar av M.aeruginosa Genom FSC, SSC & Far Red Fluorescence (675 ± 12,5 nm). (A) FSC och SSC i M.aeruginosa PCC 7806. (B) Samma ut som Figur 1A med gated FSC och långt röd fluorescens (ex: 640; em: 675 ± 12,5 nm). (C) FSC representerar storlekarna hos cellen. Den röda fodrade pilen betecknar det område som är gated för att reducera bakgrundsljud eller andra storlek partiklar. (D) Hög fykocyanin signaler som produceras från M.aeruginosa i en exponentiell fas satsvis odling med röd pil gated områden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. fykocyanin Signal Shift i M.aeruginosa När värmebehandlat. Byte av M.aeruginosa autofluorescens i "levande" och "döda" celler som används för att validera nukleinsyrasonden upptag. (A) Far röda signaler växling från ett högre pigmenterad "live" befolkning (grön) till ett lägre pigmenterad "död" befolkning (röd). (B) FSC och långt rött fluorescens kombinerade utgångar med en förskjutning av nästan två tiopotenser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Orange Fluorescence Shift i M.aeruginosa Från Live "Unstained för att "döda" färgade celler. M.aeruginosa 'levande "och" döda "blandade kontroller inkuberade med apelsin nukleinsyraprob i en koncentration av 1,0 | j, m i 30 min. (A) FL2 (585 ± 20 nm) kanal rapporterar en ökad övergång från en "levande" ofärgade populationen (grön) till en "död" färgade befolkningen (orange) genom två storleksordningar. (B) En "död" färgade befolkningen (orange) som har minskat betydligt röda signaler men ökade FL2 signaler från en "levande" befolkning (grön). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. epifluorescensmikroskopi av M.aeruginosa med Molecular Probes. Microscope bilder från en M.aeruginosa 50:50 levande: död population odlades med nukleinsyrasonder, alla bilder x1,000 förstoring. (A) En epifluorescens bild av grönt nukleinsyraprob tas upp av "döda" celler. "Levande" celler verkar rött på grund av autofluorescens av klorofyll. (B) Ljus mikroskop bild av figur 4A visar "levande" gröna pigmenterade celler och mindre pigmenterade "döda" celler, med membranskada. (C) Live: död 50:50 blandad M.aeruginosa befolkning. (D) Orange nukleinsyraprob inkubation från figur 4C, med "döda" celler avslöjar en orange färg genom epifluorescensmikroskopi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Procent av celler Märkta med grön nukleinsyraprob och förhållandet mellan "Levande" till "döda" FL1 Signaler. Medelvärde procentandel M.aeruginosa celler färgade med den gröna nukleinsyrasond i olika koncentration och inkubationstider. (A) 0,1 iM inte färga tillräckligt med celler, 5 iM visar ospecifik färgning och koncentrationer av 0,5 | iM och 1 iM färgade nästan 100% av befolkningen, visar optimala inkubationstider efter 30 min (a). (B) "Live: död" förhållanden av FL1 signaler från en exponentiell tillväxtfas och värmebehandlade prover. Koncentrationerna av 0,5 | iM och 1 iM visar god diskriminering av FL1 signaler ökar med inkubationstiden (RFU förhållanden två storleksordningar). Koncentrationerna av 10 | iM och över (inte representerade på grafen) visar dålig fluorescenssignalen diskriminering och överlappning av "levande" end 'döda' populationer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Andel av celler Märkta med Orange nukleinsyraprob och förhållandet mellan "Live" till "Dead" Signaler. Resultat från koncentration och inkubationstid förändringar i populationer av M.aeruginosa. (A) Mean andel av celler som hade spelat en apelsin fluorescenssignal i FL2 med koncentrationer av; 0,1 ^ M och 0,5 ^ M inte färgning tillräckligt med celler, 5 pM färgning levande celler (icke-specifik färgning), tillsammans med den optimala koncentrationen av 1 ^ M efter 10 min (a). (B) Den orange nukleinsyraprob "live: döda" förhållanden i FL2 visa god diskriminering och ingen överlappandeav fluorescens signaler i koncentrationer av 1 iM eller mindre och dåliga överlappande FL2 signaler (förhållanden lägre än en storleksordning) med koncentrationer över 1 iM. klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
| Konc. | Inkubationstid (min) | |||||||||
| (pM) | 1 | 5 | 10 | 30 | 60 | |||||
| 0,05 | 15,0 | 0,3 | 22,1 | 0,9 | 28,1 | 1,9 | 41,0 | 1,9 | 50,2 | 2,1 |
| 0,1 | 23,5 | 1,5 | 44,1 | 1,8 | 54,7 | 1,6 | 70,5 | 0,8 | 78,3 | 1,0 |
| 0,5 | 49,0 | 3,4 | 74,8 | 4,8 | 87,6 | 3,6 | 97,3 | 0,8 | 98,8 | 0,1 |
| 1 | 58,5 | 1,6 | 77,4 | 0,7 | 88,4 | 0,4 | 98,0 | 0,1 | 99,2 | 0,1 |
| 5 | 91,4 | 0,9 | 98,7 | 0,5 | 99,3 | 0,7 | 102,2 | 1,3 | 106,3 | 0,8 |
| 10 | 96,1 | 0,5 | 97,7 | 0,1 | 97,9 | 0,1 | 102,0 | 0,5 | 113,4 | 5,1 |
| 50 | 94,6 | 0,6 | 99,5 | 2,3 | 112,7 | 3,8 | 148,7 | 2,4 | 153,9 | 13,0 |
| 100 | 165,8 | 3,1 | 174,4 | 5,7 | 177,1 | 5,1 | 161,5 | 2,5 | 159,7 | 6,6 |
Tabell 1. Procentuell Upptag av grön nukleinsyrasond i celler. Tabell visar data från optimeringsexperiment med hjälp av gröna nukleinsyrasonden och en "levande" och 50% "död" (värmebehandlade) population 50%. De genomsnittliga procentandelar av celler som har spelats ingrön nukleinsyraprob fluorescens (FL1) har beräknats mot det totala antalet "döda" celler erhållna från en FSC-H räknas. Värden över 100% visar ospecifik färgning (SE understruket).
| Konc. | Inkubationstid (min) | |||||||||
| (pM) | 1 | 5 | 10 | 30 | 60 | |||||
| 0,05 | 92,9 | 5,4 | 170,0 | 10,9 | 237,2 | 14,9 | 385,5 | 15,0 | 481,9 | 17,7 |
| 0,1 | 178,3 | 18,1 | 343,0 | 19.5 | 437,0 | 20,6 | 619,1 | 12,1 | 714,1 | 14,8 |
| 0,5 | 202,5 | 5,9 | 308,3 | 13,1 | 365,8 | 33,5 | 426,8 | 67,2 | 480,4 | 73,2 |
| 1 | 205,8 | 12,1 | 225,9 | 13,7 | 237,3 | 15,6 | 241,5 | 5,8 | 263,1 | 8,1 |
| 5 | 69,9 | 2,6 | 53,0 | 0,6 | 40,2 | 1,7 | 27,1 | 3,7 | 21,1 | 3,4 |
| 10 | 44,3 | 2,9 | 28,7 | 5,6 | 23,6 | 4,9 | 11,6 | 1,2 | 7,6 | 1,4 |
| 50 | 6,9 | 0,1 | 3,9 | 0,1 | 2,9 | 0,1 | 1,2 | 0,1 | 1,1 | 0,1 |
| 100 | 1,7 | 0,1 | 1,3 | 0,1 | 1,1 | 0,1 | 0,8 | 0,1 | 0,8 | 0,1 |
Tabell 2. Förhållandet mellan grön fluorescens signaler i "Live" och "Dead" Stained M.aeruginosa Cells. FL1 signal diskriminering mellan celler färgade med den gröna nukleinsyrasonden och icke-specifika inneboende inspelningar. Provet innehöll en 50% "live" och 50% "död" (värmebehandlade) M.aeruginosaav samma population mätt över alla koncentration och inkubationstider (SE understruket).
| Konc. | Inkubationstid (min) | |||||||||
| (pM) | 1 | 5 | 10 | 30 | 60 | |||||
| 0,05 | 4,0 | 0,3 | 14,9 | 0,2 | 23,5 | 0,8 | 39,1 | 2,4 | 37,6 | 1,5 |
| 0,1 | 14,6 | 0,4 | 42,2 | 0,5 | 55,0 | 1,1 | 72,8 | 0,9 | 80,2 | 0,1 |
| 0,5 | 54,5 | 0,4 | 79,8 | 1,2 | 86,4 | 0,4 | 91,2 | 0,1 | 93,2 | 0,1 |
| 1 | 92,0 | 0,8 | 94,8 | 0,1 | 96,9 | 0,6 | 98,4 | 0,6 | 98,4 | 0,3 |
| 5 | 91,4 | 1,5 | 93,5 | 1,8 | 102,9 | 5,4 | 118,9 | 0,1 | 124,8 | 0,1 |
| 10 | 95,9 | 1,0 | 102,4 | 1,8 | 132,9 | 6,0 | 148,9 | 4,8 | 132,8 | 5,1 |
| 50 | 107,5 | 3,7 130,6 | 16,6 | 145,2 | 0,2 | 135,4 | 16,2 | 114,6 | 6,6 | |
| 100 | 97,1 | 0,1 | 130,7 | 7,8 | 166,1 | 3,5 | 144,7 | 6,8 | 115,1 | 6,2 |
Tabell 3. Procentuell Upptag av Orange nukleinsyrasond i celler. Bord med optimerings data med hjälp av den orange nukleinsyrasonden och 50% "live" och 50% "död" (värmebehandlade) population. Medelvärdet procenttal celler som har spelat in apelsin nukleinsyraprob fluorescens (FL2) har beräknats mot det totala antalet "döda" celler från en FSC-H-count (SE understruket).
| Konc. | Inkubationstid (min) | |||||||||
| (pM) | 1 | 5 | 10 | 30 | 60 | |||||
| 0,05 | 20,4 | 0,9 | 41,3 | 1,3 | 56,1 | 2,4 | 80,4 | 3,6 | 83,3 | 1,8 |
| 0,1 | 31,2 | 1,4 | 76,1 | 2,4 | 100,9 | 3,1 | 146,2 | 0,6 | 158,3 | 0,4 |
| 0,5 | 80,6 | 0,4 | 124,9 | 2,4 | 137,3 | 1,1 | 138,7 </ td> | 2,1 | 132,8 | 3,9 |
| 1 | 89,7 | 16,0 | 80,9 | 16,9 | 69,1 | 10,7 | 43,0 | 5,7 | 35,9 | 6,5 |
| 5 | 10,4 | 0,6 | 7,5 | 0,1 | 5,0 | 1,0 | 2,7 | 0,5 | 1,5 | 0,1 |
| 10 | 7,0 | 0,1 | 3,6 | 0,3 | 2,2 | 0,4 | 1,6 | 0,1 | 1,2 | 0,1 |
| 50 | 2,2 | 0,4 | 1,6 | 0,3 | 1,3 | 0,0 | 0,6 | 0,1 | 0,3 | 0,0 |
| 100 | 1,7 | 0,1 | 1,1 | 0,1 | 0,7 | 0,1 | 0,3 | 0,0 | 0,5 | 0,2 |
Tabell 4. Förhållandet mellan Orange nukleinsyra i "Live" och "Dead" Stained M.aeruginosa Cells. FL2 signal diskriminering mellan celler färgade från orange nukleinsyrasonden (FL2) och icke-specifika inneboende inspelningar. Provet innehöll en 50% "live" och 50% "död" (värmebehandlade) M.aeruginosa av samma population mätt över alla koncentration och inkubationstider (SE understruket).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ökade antalet publikationer med hjälp molekylära sonder tyder på att tillförlitliga och informativa data kan erhållas 5,6,8 - 15,19,22,23. Än så länge finns det ingen perfekt fläck för cellviabilitet som kan vara effektiva i alla arter med samma koncentration och inkubationstid 6,10. Även samma typ av prob med förändrade fluorescensemissioner visar ett behov av att etablera den korrekta koncentrationen och inkubationstiden (Tabellerna 1 och 3). Som framgår vid användning av detta protokoll, den optimala koncentrationen och inkubationstiden för apelsin nukleinsyraprob är 10 minuter vid en iM, medan den gröna nukleinsyrasonden skulle bara behöva halva koncentrationen men tar tre gånger så lång (figurer 5 och 6). Båda dessa cell impermeant cyanin monomerer med koncentrationer över 1,0 iM började tillverka en överlappning av utsläppen spektra med icke-membran skadade celler. Denna överlappning av signals visar att icke-specifik färgning sker där "live" celler tar upp den molekylära proben. Den resulterande över fluorescens från icke-specifik färgning genererade falska positiva, vilket understryker behovet av att utarbeta protokoll noga fastställas för varje molekylär sond och målorganismen. De mest kritiska stegen i optimera en molekylär sond skulle vara: 1) att förstå hur den molekylära proben samverkar med FCM instrument; 2) om antagande av lämpliga levande och döda kontroller; 3) Att utveckla kunskaper om grind parametrar från FCM utgångar och 4) om ändring av protokollet genom förståelse av in-situ-miljöer.
Ljuskällan, optiska filter, förmåga att ändra PMT spänning och detektorer inom flödescytometrar varierar från tillverkare till tillverkare, så en medvetenhet om vad excitationsvåglängd från lasern och där emissionsspektra ligger i förhållande till fluorescenskanalerna är avgörande. Med förvärv av uppgifter,trösklar kan åläggas att öka upplösning som annars skulle gå förlorad till kanske bakgrundsljud, skräp eller döda cellaggregat. Molekylära sönder kan erbjuda en inblick i lönsamheten av arter utan odling, genom enskilda parametrar såsom membranpotential, DNA-innehåll och enzymaktivitet. Men inom miljöprover kan det finnas många organismer av liknande cellstorlek och fluorescens. Förutom inom uniagal kulturer, kommer populationer av celler oundvikligen en viss grad av fysiologiska tillstånd 3, som kan påverka molekylär sond upptag. En av de största fördelarna med FCM är dess förmåga att urskilja och karakterisera fysiologiska tillstånd på individuell cellnivå i realtid, vilket är viktigt när man studerar mikroorganismer lönsamhet på plats, eftersom de ofta utsätts för snabba och dynamiska förhållanden. Trots sin frekvent användning, fortfarande svårt att definiera begreppet cellviabilitet. Vanligtvis appliceras på cellulär proliferation,lönsamhet är mycket poäng på en tillväxtbaserad strategi. Denna ligger till grund antagande kan misslyckas, eftersom villkoren inte kan passa enskilda celler att reproducera, men de kan ändå vara acceptabel. Celler i en nonproliferating fysiologiskt tillstånd som har gått in i en inaktivitet eller G (0) cellcykelfasen 27 kan inte interagera med en molekylär sond ger falskt negativa i DNA cykel eller metabolisk baserade prober.
Med hjälp av odlade laboratorie- eller nyligen isolerade celler för att optimera molekylära prober kommer att underlätta raffinering av data som används i ekologiska studier. Celler som används vid optimering av satskulturer vanligen tas vid exponentiell eller tidiga stationära faser och antas ha den högsta lönsamheten. Dock måste extra försiktighet iakttas vid användning av höga celltätheter, de i en sen stationär fas eller mikrober som producerar extracellulära matriser. I detta protokoll styrningen för de döda population av celler exponerades för 60 ° C värme under 1 h,med bekräftelse av membranskada och pigment nedbrytning sedd genom mikroskopi (Figur 4) och FCM fluorescens utgångar (fig 2 och 3). Simulera orsakerna till naturlig celldöd är extremt svårt eftersom; intag av betare, viral lys, programmerad celldöd eller möjligheten att asymmetriska division 24 är inte alltid genomförbara eller observeras under laboratorieförhållanden. Experimentella sätt moral ofta ifråga eftersom de inte kan motsvara spänningar induceras från omgivningen (t.ex. värme dödande) och det kan finnas en heterogen reaktion, varigenom vissa personer dödas och andra celler visar inga observerbara cellnedbrytning eller död 3 25. För att undvika en sådan paradox den operationella definitionen av vilka försöken uppmätta måste fastställas tydligt för att inte leda till förvirring 6,23, lätta normalisering mellan studier.
Olika alternativa metoder have använts analys cellviabiliteten i kulturer i samband med molekylära sonder. Epifluorescensmikroskopi är en traditionell teknik som används, även om fotoblekning eller införande av föremåls signaler från närliggande celler kan ge en under- eller över uppskattning av en befolknings fysiologiska tillstånd om inte angivits tillräckligt snabbt. Detta gör optimering genom avbildning mycket svårt, med potentiellt låg noggrannhet. Genomisk bedömning av cellulär viabilitet med användning av både DNA- och RNA-amplifieringsmetoder såsom; polymeraskedjereaktion (PCR), omvänd transkriptas (RT-PCR) och nukleinsyrasekvens-baserad amplifiering (NASBA) har också använts. Men tjänar genom bedömning endast som en indirekt metod för validering livskraft som uthållighet av nukleinsyra beror mycket på miljöförhållanden, med korrelationen mellan faktiska cellviabilitet potentiellt varierande oerhört 28. Genom att använda en kombination av ljusspridning och / eller fluorescens genom naturliga bilderynthetic pigment (Figur 1) grind populationer kan: öka upplösningen av data, identifiera sällsynta befolknings svaren och minska falska positiva resultat. FCM längs molekylära prober skiljer sig från de tidigare nämnda tekniker testa enda cell fysiologiska för sin snabbhet, precision och registrering av flera parametrar.
FCM är ett kraftfullt analysverktyg i akvatisk mikrobiologi och med tillägg av molekylära sonder har en bred potential i ett antal områden, bland annat, encelliga och gemenskap analys till industrisektorer (t.ex.., Övervakning dricksvattentag). Framtida framsteg kunde se FCM införliva fluorescens in situ hybridisering (FISH), som kan upptäcka och lokalisera specifika genetiska sekvenser i enskilda celler i täta heterogena prover. Utvecklingen av FCM och molekylär sond portabilitet för in-situ inspelningar kan ge viktiga uppgifter om vattenkällor för att genomföra tidiga strategies för resurshantering. Efter optimering protokoll som utvecklats här, FCM och molekylära prober kan potentiellt spela en avgörande roll för att ge värdefull information om mikrobiell fysiologi i vattenmiljöer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för doktorand Dave Hartnell och Bournemouth University för stöd och finansiering för forskning och anläggningar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanobacteria Media | Sigma-Aldrich | C3061-500ML | BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution) |
| Decontamination Fluid | BD Biosciences | 653155 | Run for 2 min when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µl/min. Followed by 2 min of sheath H2O. |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | by request | BD Accuri C6 |
| SYTOX Green | Life Technologies | S7020 | Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO |
| SYTOX Orange | Life Technologies | S11368 | Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO |
References
- Kell, D. B., Kaprelyants, A. S., Weichart, D. H., Harwood, C. R., Barer, M. R. Viability and Activity in Readily Culturable Bacteria: A Review and Discussion of the Practical Issues. Anton. Leeuw. Int. J. G. 73, 169-187 (1998).
- Adams, D. G., Duggan, P. S. Tansley Review No. 107. Heterocyst and Akinete Differentiation in cyanobacteria. New Phytol. 144 (1), 3-33 (1999).
- Lidstrom, M. E., Konopka, M. C. The Role of Physiological Heterogeneity in Microbial Population Behavior. Nat. Chem. Biol. 6 (10), 705-712 (2010).
- Dagnino, D., de Abreu Meireles, D., de Aquino Almeida, J. C. Growth of Nutrient-Replete Microcystis. PCC 7806 Cultures is Inhibited by an Extracellular Signal Produced by Chlorotic Cultures. Environ. Microbiol. 8 (1), 30-36 (2006).
- Davey, H. M., Kell, D. B., Weichart, D. H., Kaprelyants, A. S. Estimation of Microbial Viability Using Flow Cytometry. Curr. Protoc. Cytom. Chapter. Chapter 11, (2004).
- Davey, H. M. Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology. Appl. Environ. Microb. 77 (16), 5571-5576 (2011).
- Shapiro, H. M. Chapter 7, Parameters and Probes. Practical Flow Cytometry. , 273-410 (2003).
- Hammes, F., Berney, M., Wang, Y., Vital, M., Köster, O., Egli, T. Flow-Cytometric Total Bacterial Cell Counts as a Descriptive Microbiological Parameter for Drinking Water Treatment Processes. Water Res. 42 (1-2), 269-277 (2008).
- Wang, Y., Hammes, F., De Roy, K., Verstraete, W., Boon, N. Past, Present and Future Applications of Flow Cytometry in Aquatic Microbiology. Trends Biotechnol. 28 (8), 416-424 (2010).
- Shapiro, H. M., Nebe-von-Caron, G. Multiparameter Flow Cytometry of Bacteria. Methods. Mol. Biol. 263, 33-44 (2004).
- Peperzak, L., Brussaard, C. P. D. Flow Cytometric Applicability of Fluorescent Vitality Probes on Phytoplankton. J. Phycol. 47 (3), 692-702 (2011).
- Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. Bacterial Viability and Antibiotic Susceptibility Testing with SYTOX Green Nucleic Acid Stain. Appl. Environ. Microbiol. 63 (6), (1997).
- Franklin, D., Airs, R., Fernandes, M. Identification of Senescence and Death in Emiliania huxleyi. and Thalassiosira pseudonana. Cell Staining, Chlorophyll Alterations, and Dimethylsulfoniopropionate (DMSP) Metabolism. Limnol. Oceanogr. 57 (1), 305-317 (2012).
- Lebaron, P., Catala, P., Parthuisot, N. Effectiveness of SYTOX Green Stain for Bacterial Viability Assessment. Appl. Environ. Microbiol. 64 (7), 2697-2700 (1998).
- Mikula, P., Zezulka, S., Jancula, D., Marsalek, B. Metabolic Activity and Membrane Integrity Changes in Microcystis aeruginosa.- New Findings on Hydrogen Peroxide Toxicity in Cyanobacteria. Eur. J. Phycol. 47 (July), 195-206 (2012).
- Regel, R. H., Brookes, J. D., Ganf, G. G., Griffiths, R. W. The Influence of Experimentally Generated Turbulence on the Mash01 Unicellular Microcystis aeruginosa Strain. Hydrobiologia. 517 (1-3), 107-120 (2004).
- Kameyama, K., Sugiura, N., Inamori, Y., Maekawa, T. Characteristics of Microcystin production in the Cell Cycle of Microcystis viridis. Environ. toxicol. 19 (1), 20-25 (2004).
- Gustafsson, S., Hultberg, M., Figueroa, R. I., Rengefors, K. On the Control of HAB Species using Low Biosurfactant Concentrations. Harmful Algae. 8 (6), 857-863 (2009).
- Bouchard, J. N., Purdie, D. A. Effect of Elevated Temperature, Darkness, and Hydrogen Peroxide Treatment on Oxidative Stress and Cell Death in the Bloom-Forming Toxic Cyanobacterium Microcystis. J. Phycol. 47 (6), 1316-1325 (2011).
- Reynolds, C. S., Jaworski, G. H. M. Enumeration of Natural Microcystis Populations. Br. Phycol. J. 13 (3), 269-277 (1978).
- Marie, D., Simon, N., Vaulot, D. Phytoplankton Cell Counting by Flow Cytometry. Algal culturing techniques. Andersen, R. A. , Academic press. 253-268 (2005).
- Assunçao, P., Antuees, N. T., Rosales, R. S., de la Fe, C., Poveda, C., Poveda, J. B., Davey, H. M. Flow cytometric method for the assessment of the minimal inhibitory concentrations of antibacterial agents to Mycoplasma agalactiae. Cytom Part A. 69, 1071-1076 (2006).
- Davey, H. M., Kell, D. B. Flow Cytometry and Cell Sorting of Heterogeneous Microbial Populations: The Importance of Single-Cell Analyses. Microbiol. rev. 60 (4), 641-696 (1996).
- Franklin, D. J. Explaining the Causes of Cell Death in Cyanobacteria: What Role for Asymmetric Division? J. Plankton Res. 36 (1), 11-17 (2013).
- Kaprelyants, A. S., Mukamolova, G. V., Davey, H. M., Kell, D. B. Quantitative Analysis of the Physiological Heterogeneity within Starved Cultures of Micrococcus luteus. by Flow Cytometry and Cell Sorting. Appl. Environ. Microbiol. 62 (4), 1311-1316 (1996).
- Waggoner, A. Fluorescent probes for cytometry. Flow cytometry and sorting. Melamed, M. R., Lindmo, T., Mendelsohn, M. L. , 2nd, Wiley-Liss Inc. New York. 209-225 (1990).
- Gray, J. V., Petsko, G. A., Johnston, G. C., Ringe, D., Singer, R. A., Werner-washburne, M. "Sleeping Beauty": Quiescence in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68 (2), 187-206 (2004).
- Keer, J. T., Birch, L. Molecular Methods for the Assessment of Bacterial Viability. J. Microbiol. Methods. 53 (2), 175-183 (2003).
