Abstract
يمكن إعداد يتصاعد كلها من الأمعاء الدقيقة والقولون الماوس للتحليل الكمي أو لاحقة تكون مضيعة للوقت وصعبا. وصفنا استخدام جهاز بسيط لخفض والأمعاء "لفة" الماوس للتحضير بشكل سريع التحضير جبل كلها ذات جودة عالية وموحدة لتلك التي يمكن تحقيقها عن طريق اليد. ويتألف الجهاز قاعدة أن يحمل 4 قضبان الفولاذ المقاوم للصدأ وأعلى، والذي يعمل دليلا القطع. يتم إدراج قضبان في تجويف الأمعاء الدقيقة [مقسمة إلى ثلثي] والقولون. ثم توضع قضبان والعينات على قطعة من الورق أو بطاقة مرشح في فتحات عقد في قاعدة الجهاز. ثم يتم وضع الجزء العلوي من الجهاز وبمثابة دليل القطع. وتستخدم الأقسام الزاوية اثنين في وسط قطعة كبار لتوجيه سكين أو مشرط وقطع الأمعاء طوليا على الجزء العلوي من قضبان. مرة واحدة وقد تم قطع الأجزاء المعوية، تتم إزالة الجزء العلوي وبطاقة، TISSرق وقضبان إزالة بلطف من الجهاز ووضعها على مقاعد البدلاء. ثم يتم إرجاع قضبان بلطف جانبية للشد وعصا شرائح المعوية على قطعة الكامن وراء ورقة أو بطاقة مرشح. ويمكن بعد ذلك فحص الإعداد النهائي أو ثابتة وتخزينها لتحليلها لاحقا. الاستعدادات لا تقدر بثمن لدراسة التغيرات المعوية في نماذج الفئران العادية أو المعدلة وراثيا. وقد استخدمت الاستعدادات لدراسة وتقدير حجم آثار التهاب (التهاب القولون)، والضرر، والآفات ما قبل السرطانية (الشاذة سرداب البؤر (ACFs) والميوسين المنضب بؤر (MDFs)) واللحمية أو الأورام.
Introduction
الماوس والماوس المعدلة وراثيا 1-3 ونموذجا لا تقدر بثمن لدراسة مختلف الأمراض وخاصة سرطان وعلاقته التهاب في الجهاز الهضمي. هذا وغالبا ما يتطلب إعداد يتصاعد كلها من الأمعاء الدقيقة و / أو القولون.
إعداد يتصاعد كلها يمكن القيام به مع زوج دقة مقص تعويض ولكن يمكن أن يستغرق حوالي 20 دقيقة في الماوس 4. هذا ليس عملي جدا للدراسات المقارنة، والتي تتطلب قدرا كبيرا من الفئران (ويقول 10 في مجموعة تخضع للتحليل الإحصائي). وبالإضافة إلى ذلك، وطول الوقت الذي يستغرقه يزيد من خطر تدهور الأنسجة. محاولة للتخفيف من حدة هذه المشكلة أدت إلى محاكمة مختلف الوسائل إعداد القطع. واستند الأول في سلسلة من لوحات معدنية، مع بساتين القطع، ولكن حجب لوحات النسيج وكان قطع وبالتالي من الصعب السيطرة عليها.
A conventionaل قلم رصاص سداسية قدمت أخيرا إلهام للجهاز القطع، ونحن يمكن بعد ذلك نرى كيف شكل نصف قلم رصاص من شأنه أن يجعل دليلا جيدا لمشرط (الشكل 1). وأدى ذلك إلى تصميم لإطار مع أربعة أدلة قطع 5. كانت فعالية هذا الجهاز دراماتيكية كما الاستعدادات في الشكل (4) تبين الفرق بين إعداد مقص وإعداد الجهاز.
شيد قمم الأجهزة الأصلية من عدة قطع من المعدن، ولكن تلك في وقت لاحق، وكان تشكيله النموذج الحالي من قطعة صلبة من الدوراليومين مزيج من ألمونيوم و نحاس. تم تشكيله على قاعدة من أعلى مستويات الجودة الراتنج عالية الكثافة.
وقد أثبت الجهاز أن تكون ذات فائدة كبيرة لإعداد يتصاعد كاملة من الماوس الأمعاء لأنها تسرع كثيرا ويحسن من جودة واتساق والاستعدادات، التي لديها مجموعة واسعة من التطبيقات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية المختلفة والقتل الرحيم إنسانية من قبل لجنة أخلاقية المؤسسات المضيفة والهيئات التنظيمية المناسبة. ويتحقق القتل الرحيم عادة باستخدام CO 2 الخنق تليها خلع عنق الرحم.
1. جهاز
- آلة الجزء الرئيسي للقاعدة الجهاز من خارج كتلة صلبة عالية الكثافة الراتنج الاسيتيل، كما هو موضح في هذه المخطوطة. في نهاية كل إنشاء 3 مم عالية ارتقى الشرائط، وآلة جزء من هذه 2.5 ملم بساتين لاتخاذ قضبان (انظر الشكل 2 والشكل 3).
- جعل قضبان من 2.4 مم الفولاذ المقاوم للصدأ مع نهايات مدورة حالا.
تم تشكيله الإطار الرئيسي للغطاء من لوحة الدوراليومين مزيج من ألمونيوم و نحاس: ملاحظة. كما يتوفر عدد محدود من أجهزة الانتهاء من الدكتور Goodlad.
2. استخدام الجهاز
- تشريح خارج الأمعاء الدقيقة والقولون من تجويف البطن باستخدام مقصوأصابع القفاز. إزالة مساريق من خلال عقد مع ملقط المنحنية وبلطف سحبه بعيدا من الأمعاء.
- شطف الأمعاء مع الفوسفات الباردة مخزنة المالحة (PBS، ودرجة الحموضة 7.4) باستخدام نوع جيلسون ماصة، الذي كان قد خفض في نهاية الأوسع بحيث يمكن أن يصلح على 10 أو 20 مل بالتركيبة حقنة بلاستيكية.
- وضع الأمعاء الدقيقة (SB) إلى ورقة منشفة ورقية وتقسم إلى ثلاثة أقسام متساوية في الطول (الداني، منتصف، والقاصي - SB1، SB2 وSB3) باستخدام المقص. إزالة الأعور ووضع القولون.
- جعل العديد من الجروح الصغيرة جدا في قطاعات المعوية مع مقص لتسمح للسائل للهروب ووضع ورقة منشفة ورقية على الأمعاء وبلطف تشغيل الاصبع على التحضيرات للضغط على السائل وصمة عار الجافة.
- رفع المقاطع وإدخال قضبان الفولاذ المقاوم للصدأ التي تم المبللة مسبقا عن طريق نقع في كوب من الفوسفات مخزنة المالحة.
ملاحظة: الأمعاء يمكن أن يكون فيverted إذا رغبت في ذلك (تحولت الداخل الى الخارج). - تسمية قطعة من بطاقة أو تصفية قطع الورق إلى حجم لتناسب قاعدة الجهاز. قلم رصاص هو أفضل، لأنه لا يتأثر كل الحلول تقريبا. واقترح تاريخ التشريح، رمز التجريبية ورقم هوية الحيوان.
- وضع بطاقة أو ورقة مرشح في قاعدة الجهاز. إدراج قضبان والأمعاء في الفتحات الموجودة في قاعدة الجهاز. تأكد من وضع نهاية القريبة من القطاعات بطريقة موحدة. يجب أن تكون نهايات القريبة بالقرب من التسميات البطاقة.
- ضع قطعة العلوي من الجهاز على قاعدة. استخدام أشرطة الزاوية لتوجيه شفرة مشرط لقطع طولي الأقسام.
ملاحظة: كما أنه يساعد إذا كان النسيج هو بلطف وعناية عقدت مع ساكنا لضمان أن لا يتحرك مع السكين. - إزالة قطعة العلوي من الجهاز. إزالة بعناية ورقة والأنسجة مرشح (لا يزال على عصيهم).
ملاحظة: قطعة من بطاقة شديدة وضعت تحت سن الفيلوتستعرض ورقة ثالثا مساعدة الرفع. - الرطب قليلا (مع الإصبع القفاز مغموسة في PBS) قطاعات. لفة قضيب، جنبا إلى جنب لفتح القناة الهضمية وينتشر بشكل مسطح. سوف الأنسجة ثم الانضمام إلى ورقة الترشيح.
- فحص البصر الاستعدادات لأي الآفات الجسيمة.
- نقل الأنسجة الالتزام بها ورقة الترشيح إلى حمام ضحل (أو شطيرة مربع) تحتوي على مثبت.
ملاحظة: بعد تتمسك الأنسجة إلى ورقة الترشيح أو بطاقة سيبقى تعلق بحزم. وهناك مجموعة واسعة من المثبتات يمكن استخدامها للحفاظ على التحضير. فمن المستحسن أن السائل Carnoy ينبغي أن تستخدم لدراسة انتشار الاسلحة الخلايا المعوية 6، وهو تثبيت المثالي لأفضل الطرق تكاثر الخلايا. ومع ذلك الفورمالين أو يمكن أن تستخدم أيضا العديد من مثبتات أخرى إذا كانت هناك حاجة النهاية الأخرى. - بعد تثبيت (عادة 3 ساعات)، ونقل التحضيرات إلى 70٪ من الإيثانول. ويمكن بعد ذلك يتم تخزين العينات حتى المطلوبة. التحضيرات جلدراستها أون الوجه و / أو المستخدمة في إعداد العينات النسيجية لH & E أو غيرها من تقنيات تلطيخ النسيجية، المناعية و / أو التهجين في الموقع.
ملاحظة: المطول التثبيت يمكن أن تقلل من القابلية للتفاعل المناعى و / أو التهجين الموضعي للتفاعل في. صناديق البولي بروبلين شطيرة مثالية لتخزين عدد كبير من التحضيرات. - إذا لزم الأمر الأنسجة الثابتة من مختلف شرائح المعوية يمكن أن يتم في 'القوائم السويسرية وملطخة مجموعة كاملة من وسائل النسيجية 6 بما في ذلك تلك المذكورة أعلاه. لجعل 'لفة السويسرية تتم إزالة أجزاء الأمعاء من ورقة الترشيح، وتوالت حول عصا كوكتيل أو مسواك، المضمون مع دبوس الحشري ومعالجتها للشمع التضمين 6.
- إذا لزم الأمر، وصمة عار على النسيج السائبة مع الميثيلين الأزرق إلى تصور الشاذة سرداب البؤر 7.
- يسجل الاستعدادات الثابتة فيأوقات الفراغ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الاورام الحميدة هي سهلة لتحديد إطار stereomicroscope مع مصدر ضوء بارد إلى جانب إلقاء الضوء على الأنسجة (الشكل 4). ومن المفيد للاحتفال البطاقة مع علامات قلم رصاص عندما لوحظ ورم من اجل ان يحرز يمكن مناقشتها في وقت لاحق ويمكن لمشغلي مختلفة التوصل إلى اتفاق. الأنسجة يمكن أن يكون الجزء الأكبر الملون [مع الميثيلين الأزرق] لتحديد الشاذة سرداب البؤر 8 أو الميوسين بؤر المنضب (MDFs) 9 عن طريق الإضاءة من فوق أو من خلال الإضاءة غير المشبعة (الشكل 5).
ويمكن أيضا موقع الآفات أن سجل على أساس الموضعية 8. للقيام يحتاج هذا واحد لأول مرة إلى إعداد شبكة من 10 ساحة في حزمة الرسم الكمبيوتر، قم بنسخ هذا عدة مرات ثم تمتد عدة شبكات لأحجام المعروفة المختلفة وطباعة على ورقة خلات (انظر الشكل 6) [النقش هو مفيد و برنامج بسيط نسبيا للقيام بذلك]. يمكن للمرء ثم العثور على الشبكة الذي يناسب ل ength هذا الباب واستخدامه لتسجيل أحداث الفائدة.
مرة واحدة يسجل هدف كل أو جزء من الأنسجة يمكن إزالتها لمزيد من التحليل أو يمكن توالت قطاعات كاملة تصل إلى "لفة السويسرية لباجتزاء النسيجي. في حين وصفت هذا الإجراء وتقنيا تحديا 10 طبيعة مسطحة وحتى من الاستعدادات يجعل هذا الإجراء أكثر من ذلك بكثير واضحة. إعداد الكلي يمكن استخدامها لتسجيل "الزوائد الكلي" وفات السويسرية تستخدم لتسجيل "الزوائد الصغيرة '11،12 (الشكل 7).
الشكل 1. كيف جاء الالهام من الجهاز من قلم رصاص. المناقشات في وحدة الرصاص خدمة البيولوجية لفكرة استخدام شكل قلم رصاص نصف ليكون بمثابة دليل القطع.53042 / 53042fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تمت إزالة الشكل 2. صور من الجهاز الأصلي. وقد تم بناء الجهاز الأصلي من عدة قطع من المعدن، من جهة، أعد. (A) الجهاز تجميعها. (B) الجزء العلوي من الجهاز لعرض قضبان في الموقف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. صور من جهاز أعيد تصميمها. (A) هو آلة الإطار الرئيسي للغطاء من لوحة الدوراليومين مزيج من ألمونيوم و نحاس. (B) وقاعدة (ينظر في الأسود)مصنوع من كتلة صلبة عالية الكثافة الراتنج الاسيتيل، وبعد 4 قضبان القابلة للإزالة يجلس في القناة. أظهرت هو ورقة فلتر (أبيض) وضعت على رأس القاعدة (أسود) (C) وجهة النظر النهائية للجهاز: يتم وضع غطاء (A) في الجزء العلوي من الحوض (B). وتظهر أبعاد بالسنتيمتر. وكانت قضبان 2.4 مم في القطر مع نهايات مدورة حالا. أنظر المرجع 5 لمزيد من التفاصيل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. إعداد غوت المصنوع من تعويض مقص واستخدام الجهاز. (A) وأعدت الأمعاء باستخدام مقص تعويض. (B) للأمعاء أعدت مع قطع القناة الهضمية يظهر حتى العرض في جميع أنحاء الأمعاء و عرض أفضل من الأنسجة، مما يجعل العد، والمراقبة من الاورام الحميدة أسهل بكثير. تعديل من الشكل 3 في تكاثر الخلايا 6. يشار شريط النطاق مع الوحدة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. بؤر سرداب الشاذة ينظر في جبل كامل من القولون ملطخة الميثيلين الأزرق، وجبل بأكمله القولون كانت ملطخة الأكبر مع الميثيلين الأزرق لتحديد الشاذة سرداب البؤر، كما هو موضح بالأسهم. يشار شريط النطاق مع الوحدة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الملفات / ftp_upload / 53042 / 53042fig6.jpg "/>
تطبع الشكل 6. قالب للأوراق خلات لتسجيل الموضعية. أحجام مختلفة من شبكة من 10 الساحات في اكياس من خلات. وضعت قطع الأمعاء على الشبكة الذي يناسب طول القسم، وسجل الأحداث ذات الأهمية مثل عدد العد من الآفات في كل مربع. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7. سويس رول من الأمعاء الدقيقة الماوس H & E الملون. لفة السويسرية الأمعاء الدقيقة المعروضة من APC (مين / +) الماوس، ويتميز كذلك في نموذج الجسم الحي من الأمعاء ورم سفر التكوين. السهام تشير إلى أورام التمثيلية. ويظهر شريط النطاق مع الوحدة.42 / 53042fig7large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الجهاز تسرع كثيرا من عملية بحيث يمكن للمشغلين اثنين تشريح الجثة بالكامل ماوس في غضون 6 دقائق. وسوف يشمل ذلك فحص بصري للآفات جسيمة واضحة وزنها وتحديد الأجهزة الرئيسية. وسوف تسمح أيضا للشركات لشطف، وصمة عار وتزن المعدة، الأعور والأمعاء الدقيقة والقولون واعداد يتصاعد كلها. الأنسجة بالارض يمكن أن تكون ثابتة بشكل سريع جدا، وبالتالي تجنب القطع الأثرية تدهور.
واحدة من المزايا الرئيسية للجهاز (بغض النظر عن السرعة) هو أن الجهاز يمكن أن تولد إنتاج مستحضرات ذات جودة أفضل بكثير، الأمر الذي يجعل ثم تحليلها لاحقا وتقدير أسهل بكثير. أون وجه التهديف يعتبر مثاليا لقياس الآفات المسببة للسرطان وقبل مسرطنة العيانية (مثل عدد ورم والقطر وحجم العبء). وحتى طبيعة الاستعدادات يجعلها مثالية للالمتداول في وقت لاحق إلى "فات السويسرية وباجتزاء بحيث التحليل النسيجي لل'ع الصغيرويمكن أيضا أن يكون كميا عدد olyp. ويمكن أيضا الشاذة بؤر سرداب والآفات ما قبل الأورام الأخرى يمكن تصور استخدام يتصاعد كلها.
ويمكن ملاحظة التغيرات الالتهابية في نماذج التهاب القولون المختلفة باستخدام يتصاعد كلها.
وعلاوة على ذلك الموقع الكمي والمكاني لهذه الأحداث في مناطق مختلفة من الأمعاء يمكن تحديدها. الحد من هذه التقنية هو أن استخدام الجهاز يتطلب بعض المهارة، وخاصة في التهديف من الأنسجة مع مشرط. يمكن لمعظم مشغلي إتقان هذه التقنية في وقت قصير بعد دقائق قليلة الممارسة. التحضيرات يستغرق سوى بضع دقائق ولكن يمكن أن تؤخذ عينات صغيرة إذا كان مطلوبا المحافظة لحظة لتثبيت أو تجميدها ومن ثم بقية الأنسجة إعداد كالمعتاد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Delrin | Ryan Plastics, Earls Barton, UK | High-density acetal resin similar material would suffice | |
| Duralumin plate | Metal Supplies Ltd, Park Road,Dukinfield. SK16 5LP UK | Aluminium allow dating back to 1909 so alterative suppliers are available | |
| Finished device(s) ready for use | Contact Dr Goodlad r.goodlad@imperial.ac.uk | Contact r.goodlad@imperial.ac.uk for supply details |
References
- Goodlad, R. A. Cancer Handbook. Alison, M. R. , John Wiley and Sons, Ltd. 243-262 (2007).
- Ward, J. M., Treuting, P. M. Rodent intestinal epithelial carcinogenesis: pathology and preclinical models. Toxicol Pathol. 42, 148-161 (2014).
- Sundberg, J. P., Hogenesch, H., Nikitin, A. Y., Treuting, P. M., Ward, J. M. Training mouse pathologists: ten years of workshops on the Pathology of Mouse Models of Human Disease. Toxicol Pathol. 40, 823-825 (2012).
- Wasan, H. S., Novelli, M., Bee, J., Bodmer, W. F. Dietary fat influences on polyp phenotype in multiple intestinal neoplasia mice. Proc Natl Acade Sci USA. 94, 3308-3313 (1997).
- Rudling, R., Hassan, A. B., Kitau, J., Mandir, N., Goodlad, R. A. A simple device to rapidly prepare whole mounts of murine intestine. Cell Prolif. 39, 415-420 (2006).
- Alferez, D., Goodlad, R. A. To best measure cell proliferation in samples from the intestine. Cell Prolif. 40, 231-240 (2007).
- Park, H. S., Goodlad, R. A., Wright, N. A. The incidence of aberrant crypt foci and colonic carcinoma in dimethylhydrazine-treated rats varies in a site-specific manner and depends on tumor histology. Cancer Res. 57, 4507-4510 (1997).
- Park, H. S., et al. Effects of epidermal growth factor and dimethylhydrazine on crypt size, cell proliferation, and crypt fission in the rat colon. Cell proliferation and crypt fission are controlled independently. Am J Pathol. 151, 843-852 (1997).
- Femia, A. P., Dolara, P., Caderni, G. Mucin-depleted foci (MDF) in the colon of rats treated with azoxymethane (AOM) are useful biomarkers for colon carcinogenesis. Carcinogenesis. 25, 277-281 (2004).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
- Goodlad, R. A., et al. Inhibiting vascular endothelial growth factor receptor-2 signaling reduces tumor burden in the ApcMin/+ mouse model of early intestinal cancer. Carcinogenesis. 27, 2133-2139 (2006).
- Mandir, N., Englyst, H., Goodlad, R. A. Resistant carbohydrates stimulate cell proliferation and crypt fission in wild-type mice and in the Apc(Min/+) mouse model of intestinal cancer, association with enhanced polyp development. Br J Nutr. 100, 711-721 (2008).
