Abstract
Voorbereiding whole mounts van de muis dunne darm en colon voor daaropvolgende analyse of kwantificatie kan tijdrovend en moeilijk. We beschrijven het gebruik van een eenvoudige inrichting te snijden en "roll" mouse darmen snel bereiden ganse berg preparaten van superieure en uniforme kwaliteit wat kan worden bereikt met de hand. De inrichting omvat een basis die 4 roestvrij stalen staaf en een top, waarin een zaaggeleider handelt houdt. De staven worden in de lumen van de dunne darm [onderverdeeld in drieën] en het colon. De staven en monsters worden vervolgens op een stuk filtreerpapier en kaart geplaatst in het bedrijf sleuven in de basis van de inrichting. De bovenkant van het apparaat wordt vervolgens geplaatst en dient als een snijgeleider. De twee schuine gedeelten in het midden van het bovenste stuk worden gebruikt om een mes of scalpel en snijden de darm longitudinaal aan de bovenzijde van de staven. Zodra de intestinale secties werden gesneden, wordt boven verwijderd en de kaart, tissUE en staven voorzichtig van het apparaat verwijderd en geplaatst op de bank. De staven worden vervolgens voorzichtig opzij gerold te vlakken en plak de intestinale segmenten op het onderliggende stuk filter papier of karton. Het uiteindelijke preparaat kan vervolgens worden onderzocht of vastgesteld en opgeslagen voor latere analyse. De preparaten zijn van onschatbare waarde voor de studie van intestinale veranderingen in normale of genetisch gemodificeerde muismodellen. De preparaten werden gebruikt voor de studie en kwantificering van de effecten van ontsteking (colitis), beschadiging, voorstadia van kanker (afwijkende crypt foci (ACFs) en mucine verarmd foci (MDF)) en poliepen of tumoren.
Introduction
De muis en de genetisch gemodificeerde muizen 1-3 zijn een waardevol model voor de studie van verschillende pathologieën met name kanker en zijn relatie met ontsteking in het maagdarmkanaal. Dit vereist vaak het bereiden van whole mounts van de dunne darm en / of colon.
De bereiding van whole mounts kan met een nauwkeurigheid paar van offset schaar maar kan ongeveer 20 minuten per muis 4 nemen. Dit is niet praktisch voor vergelijkende onderzoeken, die een aanzienlijke hoeveelheid muizen vereisen (zeg 10 per groep onderworpen aan statistische analyse). Bovendien is de tijd die het risico op weefselafbraak. Een poging om dit probleem te verminderen tot het proces van verschillende snij preparaat hulpmiddelen. De eerste was gebaseerd op een aantal metalen platen met scherpe bosjes, maar de platen verduisterd het weefsel en het snijden was derhalve moeilijk te controleren.
Een conventional zeskantige potlood eindelijk voorzien inspiratie voor de snij-inrichting, zoals we dan kon zien hoe een half potlood vorm een goede gids voor een scalpel (figuur 1) zou maken. Dit resulteerde in een ontwerp voor een frame met vier snij geleidingen 5. De doeltreffendheid van deze inrichting was dramatisch als preparaten in figuur 4 tonen het verschil tussen de schaar preparaat en het preparaat toestel.
De toppen van de oorspronkelijke apparaten werd opgebouwd uit verschillende stukken metaal, maar later degenen, en het huidige model werd gefreesd uit een massief stuk Duralumin. De basis werd gefreesd uit de hoogste kwaliteit high-density hars.
Het apparaat heeft bewezen van groot nut voor de bereiding van whole mounts muis darm als het aanzienlijk versnelt en verbetert de kwaliteit en consistentie van de preparaten, die een breed scala van toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De verschillende experimentele procedures en de humane euthanasie worden goedgekeurd door de ontvangende instellingen ethische commissie en door de bevoegde regelgevende instanties. Euthanasie wordt normaal bereikt met behulp van CO 2 stikken, gevolgd door cervicale dislocatie.
1. Inrichting
- Machine het hoofdgedeelte van de basis van het apparaat uit een massief blok van high-density acetyl-hars, zoals beschreven in dit manuscript. Aan elk uiteinde creëren 3 mm hoog verheven strips en machine deel van deze 2,5 mm bosjes aan de stangen te nemen (zie figuur 2 en figuur 3).
- Maak hengels uit een 2,4 mm roestvrij staal met afgeronde uiteinden.
LET OP: Het belangrijkste kader van het deksel werd gefreesd uit Duralumin plaat. Een beperkt aantal afgewerkte inrichtingen zijn verkrijgbaar bij Dr. Goodlad.
2. Gebruik van het apparaat
- Ontleden de dunne darm en colon uit de buikholte met een schaaren gehandschoende vingers. Verwijder het mesenterium door houden met gebogen pincet en voorzichtig weg te trekken uit de darm.
- Spoel de darmen met koude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) met een Gilson soort pipetpunt, die afgesneden hadden aan het bredere uiteinde zodat het past op een 10 of 20 ml plastic spuit luer fitting.
- Lay-out van de dunne darm (SB) op een vel keukenpapier en verdelen in drie gelijke delen in de lengte (proximale, midden en distale - SB1, SB2 en SB3) met een schaar. Verwijder de blindedarm en de lay-out van de dikke darm.
- Maak een aantal zeer kleine sneetjes in de intestinale segmenten met een schaar om de vloeistof te ontsnappen en plaats een vel papier handdoek over de darmen en voorzichtig lopen een vinger over de voorbereidingen te persen uit de vloeistof en dep droog.
- Til de secties en steek de roestvrij stalen staven die eerder werden bevochtigd door onderdompeling in een bekerglas van fosfaat gebufferde zoutoplossing.
OPMERKING: De darm kan inomgezet indien gewenst (binnenste buiten gekeerd). - Label een stuk karton of filtreerpapier op maat gesneden om te passen in de basis van de inrichting. Potlood best, omdat het niet beïnvloed door vrijwel alle oplossingen. Autopsie datum, experimentele code en de identificatie van dieren nummer worden voorgesteld.
- Plaats de kaart of filterpapier in de basis van de inrichting. Plaats de staven en darmen in de openingen in de voet van de inrichting. Zorg ervoor dat het proximale uiteinde van het segment is gepositioneerd in een gestandaardiseerde manier. De proximale einden moet in de buurt van de kaart labels.
- Plaats het bovenste stuk van het toestel over de basis. Gebruik de schuine balken van een scalpel te begeleiden naar de lengterichting snijden van de secties.
Opmerking: Het helpt als het weefsel voorzichtig en zorgvuldig gevoerd met een vinger zodat het niet beweegt met het mes. - Verwijder het bovenstuk van het apparaat. Verwijder voorzichtig het filter papier en weefsels (nog steeds op hun staven).
LET OP: Een stuk van stijve kaart geplaatst onder de filter papier zal helpen tillen. - Iets nat (met een gehandschoende vinger gedoopt in PBS) de segmenten. Rol de staaf, van links naar rechts om de openstelling van de darm en verspreid het plat. Het weefsel zal dan hechten aan het filterpapier.
- Visueel onderzoekt de voorbereidingen voor een grove laesies.
- Breng het weefsel gehecht aan het filterpapier op een ondiep bad (of sandwich box) met fixatief.
NB: Na het weefsel hecht aan het filter papier of kaart zal blijven stevig bevestigd. Een groot aantal fixatieven kunnen worden gebruikt voor de bereiding behouden. Aanbevolen wordt Carnoy's vloeistof moet worden gebruikt voor de studie van intestinale celwoekeringen 6, de ideale bevestiging voor de beste celproliferatie methoden; Maar formaline of vele andere fixatieven kunnen ook worden gebruikt als andere eindpunten vereist. - Na fixatie (meestal 3 uur), breng de preparaten in 70% ethanol. De monsters kunnen vervolgens worden bewaard kunnen worden. De preparaten cEen bestudeerd en het gezicht en / of voor de bereiding van histologische monsters voor H & E kleuring of andere histologische technieken, immunohistochemie en / of in situ hybridisatie.
OPMERKING: Langdurige fixatie kan immunohistochemische reactiviteit en / of in situ hybridisatie reactiviteit reduceren. Polypropyleen sandwich dozen zijn ideaal voor opslag van een groot aantal preparaten. - Indien nodig kan de gefixeerde weefsels uit de verschillende intestinale segmenten kunnen worden gemaakt in Swiss rolls 'en gekleurd door het hele bereik van histologische werkwijzen 6 waaronder die hierboven beschreven. Om een 'Swiss roll' maken de intestinale segmenten worden verwijderd uit het filter papier, rolde rond een cocktailprikker of een tandenstoker, beveiligd met een entomologische pin en verwerkt voor het inbedden van 6 wax.
- Indien nodig, vlekken op het grootste weefsel met methyleenblauw om afwijkende crypte haarden 7 visualiseren.
- Ril de vaste preparaten invrijetijdsbesteding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Poliepen zijn gemakkelijk te herkennen onder een stereomicroscoop met een koude lichtbron opzij belichten van het weefsel (Figuur 4). Het is nuttig om de kaart met potlood merken markeren wanneer een poliep wordt waargenomen, zodat scoren later kan worden besproken en de verschillende operatoren kunnen een akkoord te komen. Het weefsel kan ook bulk worden gekleurd [met methyleenblauw] te identificeren afwijkende crypte haarden 8 of mucineproductie uitgeput brandpunten (MDF) 9 door belichting van bovenaf of door het trans-verlichting (Figuur 5).
De plaats van laesies kunnen worden gescoord op een positionele basis 8. Om dit te doen men eerst moet een raster van 10 vierkante bereiden in een computer tekenpakket, kopieer deze meerdere malen en dan strek de verschillende netten aan diverse bekende formaten en afdrukken op een acetaat (zie figuur 6) [Intaglio is een nuttig en relatief eenvoudig programma om dit te doen]. Men kan dan het vinden van een raster dat de l past ength van de sectie en gebruik deze om de score van de gebeurtenissen van belang.
Eenmaal gescoord, of een gedeelte van het weefsel kan worden verwijderd voor verdere analyse of hele delen oprolbaar een "Swiss roll" voor histologische coupes. Hoewel deze procedure is beschreven als technisch ingewikkeld 10 het vlak en ook de aard van de preparaten maakt deze methode veel eenvoudiger. De macro preparaat kan worden gebruikt om te scoren 'macro poliepen en de Zwitserse rollen gebruikt om micro poliepen' 11,12 (figuur 7) scoren.
Figuur 1. Hoe de inspiratie van het apparaat kwam van een potlood. De besprekingen in de biologische Dienst eenheid leidde tot het idee van het gebruik van een half potlood vorm op te treden als een snij-gids.53042 / 53042fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Foto's van de oorspronkelijke inrichting. De oorspronkelijke inrichting is opgebouwd uit meerdere stukken van metaal, met de hand bewerkt. (A) Het apparaat gemonteerd. (B) De bovenkant van het apparaat verwijderd om de stangen in positie weer. Zoom klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Foto's van de vernieuwde apparaat. (A) De belangrijkste kader van het deksel wordt gefreesd uit Duralumin plaat. (B) De basis (gezien in het zwart)bestaat uit een massief blok van high-density acetyl hars met 4 verwijderbare staven zitten in een kanaal. Getoond wordt een filtreerpapier (wit) die op de bovenkant van de basis (zwart) (C) de laatste van de inrichting. De deksel (A) op de bovenkant van het bassin (B) geplaatst. Afmetingen in centimeters worden weergegeven. De staafjes waren 2,4 mm in diameter met afgeronde uiteinden. Zie referentie 5 voor meer informatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Gut preparaat gemaakt met offset schaar en gebruiken van het apparaat. (A) De darmen bereid onder offset schaar. (B) De met de darm frees met de breedte zelfs hele darm en ingewanden de betere presentatie van het weefsel, die tellen maakt, en observatie van poliepen veel gemakkelijker. Gemodificeerde uit figuur 3 in Cell Proliferation 6. Schaal bar met het apparaat wordt aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Afwijkende crypte haarden gezien in hele berg van de dikke darm gekleurd met methyleenblauw. De hele montage colon werd bulk gekleurd met methyleenblauw om afwijkende crypte haarden identificeren, aangegeven door pijlen. Schaal bar met het apparaat wordt aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Bestanden / ftp_upload / 53042 / 53042fig6.jpg "/>
Figuur 6. Template voor acetaat platen voor positionele scoren. Verschillende maten van raster van 10 vierkanten worden afgedrukt op acetaat lakens. De cut darm wordt gelegd op de grid dat de lengte van het onderdeel past, en de gebeurtenissen die van belang zijn, zoals het tellen van het aantal letsels in elk vierkant scoorde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7. Swiss roll van een H & E gekleurde muis dunne darm. De dunne darm Swiss roll getoond is van een APC (min / +) muis, een goed gekarakteriseerd in vivo model van intestinale tumor ontstaan. Pijlen geven vertegenwoordiger adenomen. Schaal bar met het apparaat wordt getoond.42 / 53042fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het apparaat aanzienlijk versnelt het proces, zodat twee operators volledig kan autopsie een muis binnen 6 min. Dit omvat een visuele controle voor de hand liggende grove laesies en wegen en de vaststelling van de belangrijkste organen. Het zal het ook mogelijk de operatoren te spoelen, dep en wegen van de maag, blindedarm, dunne darm en dikke darm en de voorbereiding van de hele mounts. De afgeplatte weefsel kan snel worden vastgesteld en derhalve afbraak voorkomen artefacten.
Een van de grote voordelen van de inrichting (behalve toerental) is dat de inrichting de productie van veel betere kwaliteit preparaten, die vervolgens daaropvolgende analyse en kwantificatie veel eenvoudiger te genereren. En face scoren is ideaal voor het kwantificeren macroscopische kankerverwekkende en pre-carcinogene laesies (zoals poliep nummer, diameter en last volume). Het zelfs karakter van de voorbereidingen maakt ze ideaal voor latere rollen in 'Zwitserse rollen en snijden, zodat histologische analyse van' micro polyp 'nummer kan ook worden gekwantificeerd. Afwijkende crypt foci en andere pre-neoplastische laesies kunnen worden gevisualiseerd met behulp van de whole mounts.
Inflammatoire veranderingen in diverse colitis modellen kunnen ook worden waargenomen met behulp van de hele mounts.
Verder is de kwantitatieve en ruimtelijke locatie van deze gebeurtenissen in verschillende gebieden van de darmen worden bepaald. Beperking van de techniek is dat het gebruik van het apparaat vereist enige handigheid, vooral in het scoren van het weefsel met de scalpel. De meeste operators kunnen de techniek in korte tijd onder de knie na een paar minuten de praktijk. De voorbereidingen duren slechts een paar minuten, maar als onmiddellijke conservering nodig kleine monsters kunnen worden genomen voor fixatie of bevroren en dan de rest van de bereide zoals gebruikelijk weefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Delrin | Ryan Plastics, Earls Barton, UK | High-density acetal resin similar material would suffice | |
| Duralumin plate | Metal Supplies Ltd, Park Road,Dukinfield. SK16 5LP UK | Aluminium allow dating back to 1909 so alterative suppliers are available | |
| Finished device(s) ready for use | Contact Dr Goodlad r.goodlad@imperial.ac.uk | Contact r.goodlad@imperial.ac.uk for supply details |
References
- Goodlad, R. A. Cancer Handbook. Alison, M. R. , John Wiley and Sons, Ltd. 243-262 (2007).
- Ward, J. M., Treuting, P. M. Rodent intestinal epithelial carcinogenesis: pathology and preclinical models. Toxicol Pathol. 42, 148-161 (2014).
- Sundberg, J. P., Hogenesch, H., Nikitin, A. Y., Treuting, P. M., Ward, J. M. Training mouse pathologists: ten years of workshops on the Pathology of Mouse Models of Human Disease. Toxicol Pathol. 40, 823-825 (2012).
- Wasan, H. S., Novelli, M., Bee, J., Bodmer, W. F. Dietary fat influences on polyp phenotype in multiple intestinal neoplasia mice. Proc Natl Acade Sci USA. 94, 3308-3313 (1997).
- Rudling, R., Hassan, A. B., Kitau, J., Mandir, N., Goodlad, R. A. A simple device to rapidly prepare whole mounts of murine intestine. Cell Prolif. 39, 415-420 (2006).
- Alferez, D., Goodlad, R. A. To best measure cell proliferation in samples from the intestine. Cell Prolif. 40, 231-240 (2007).
- Park, H. S., Goodlad, R. A., Wright, N. A. The incidence of aberrant crypt foci and colonic carcinoma in dimethylhydrazine-treated rats varies in a site-specific manner and depends on tumor histology. Cancer Res. 57, 4507-4510 (1997).
- Park, H. S., et al. Effects of epidermal growth factor and dimethylhydrazine on crypt size, cell proliferation, and crypt fission in the rat colon. Cell proliferation and crypt fission are controlled independently. Am J Pathol. 151, 843-852 (1997).
- Femia, A. P., Dolara, P., Caderni, G. Mucin-depleted foci (MDF) in the colon of rats treated with azoxymethane (AOM) are useful biomarkers for colon carcinogenesis. Carcinogenesis. 25, 277-281 (2004).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
- Goodlad, R. A., et al. Inhibiting vascular endothelial growth factor receptor-2 signaling reduces tumor burden in the ApcMin/+ mouse model of early intestinal cancer. Carcinogenesis. 27, 2133-2139 (2006).
- Mandir, N., Englyst, H., Goodlad, R. A. Resistant carbohydrates stimulate cell proliferation and crypt fission in wild-type mice and in the Apc(Min/+) mouse model of intestinal cancer, association with enhanced polyp development. Br J Nutr. 100, 711-721 (2008).
