Abstract
הכנת mounts של מעי הדק ומעי גס עכבר לניתוח או כימות שלאחר מכן כל יכולה להיות זמן רב וקשה. אנו מתארים את השימוש במכשיר פשוט לחתוך ומעיים עכבר 'גליל' להכין במהירות הכנות הר שלמות של איכות מעולה ואחידה לזה שיכול להיות מושגת על ידי יד. המכשיר כולל בסיס שמחזיק 4 מוטות נירוסטה ועליונה, הפועל מדריך חיתוך. המוטות מוכנסות לתוך חלל המעי הקטן [מחולק לשלישים] והמעי הגס. המוטות והדגימות לאחר מכן הניחו על פיסת נייר סינון או כרטיס לחריצי ההחזקה בבסיס של המכשיר. חלקיו העליונים של המכשיר ולאחר מכן ממוקם ומשמש כמדריך חיתוך. שני הסעיפים בזווית במרכז פיסה העליונה משמשים כדי להנחות את סכין או אזמל ולחתוך את המעיים longitudinally בחלק העליון של המוטות. ברגע שחלקי המעי קוצצו, העליון מוסר ואת הכרטיס, TissUE ומוטות להסיר בעדינות את המכשיר והניח על הספסל. המוטות אז בעדינות התגלגלו הצידה כדי לשטח ואת מקל מגזרי מעיים על פיסת נייר סינון או כרטיס הבסיסית. ההכנה הסופית ואז ניתן לבדוק או קבועה ומאוחסנות לניתוח מאוחר יותר. ההכנות רבות ערך לחקר שינויים במעי במודלים של עכברים נורמלים או מהונדסים גנטי. ההכנות כבר בשימוש למחקר וכימות של ההשפעות של דלקת (דלקת המעי הגס), נזק, נגעים טרום סרטניים (מוקדי קריפטה הסוטים (ACFs) וmucin מדולדלים מוקדים (MDFs)) ופוליפים או גידולים.
Introduction
העכבר והעכבר המהונדס גנטי 1-3 הם מודל לא יסולא בפז ללימוד פתולוגיות שונות במיוחד סרטן והקשר שלה לדלקת במערכת העיכול. זה בדרך כלל דורש ההכנה של mounts של המעי דק ו / או מעי גס כולו.
ההכנה של כל mounts ניתן לעשות עם זוג דיוק מספריים לקזז אבל זה יכול לקחת כ -20 דקות לכל עכבר 4. זה לא מעשי מאוד למחקרים השוואתיים, הדורשים כמות משמעותית של עכברים (10 אומרים לנושא הקבוצה לניתוח סטטיסטי). בנוסף, אורך הזמן שלוקח מגביר את הסיכון של השפלה רקמה. ניסיון להקל על בעיה זו הוביל למשפטו של עזרי הכנת חיתוך שונים. הראשון היה מבוסס על סדרה של לוחות מתכת, עם מטעי חיתוך, אבל הצלחות טשטשו את הרקמה והחיתוך היה קשה ובכך לשלוט.
Conventionaעיפרון שישה-צדדי l לבסוף סיפק השראה למכשיר החיתוך, כפי שאנו יכולים לראות כיצד צורת חצי עיפרון תעשה מדריך טוב לאזמל (איור 1). זה הביא לעיצוב מסגרת עם ארבעה מדריכי חיתוך 5. היעילות של מכשיר זה הייתה דרמטית כמו ההכנות באיור 4 מדגימות את ההבדל בין הכנת המספריים והכנת ההתקן.
צמרות המכשירים המקוריים נבנו מכמה חתיכות של מתכת, אך מאוחר יותר אלה, והמודל הנוכחי מכונה מתוך פיסת duralumin מוצקה. הבסיס היה במכונה מתוך שרף בצפיפות גבוהה באיכות הגבוהה ביותר.
המכשיר הוכיח להיות תועלת רבה להכנת mounts של מעי עכבר כל שהיא במידה רבה מאיצה את ומשפרת את האיכות ועקביות של ההכנות, שיש מגוון רחב של יישומים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוצדורות השונות והמתת החסד ההומנית מאושרים על ידי הוועדה האתית מוסדות מארחים ועל ידי הגופים רגולטוריים המתאימים. המתת חסד מושגת בדרך כלל באמצעות CO 2 מחנק ואחריו נקע בצוואר הרחם.
1. התקן
- מכונת החלק העיקרי של הבסיס של המכשיר מחוץ לגוש מוצק של שרף אצטיל צפיפות גבוהה, כפי שתוארו בכתב היד הזה. בכל קצה ליצור רצועות 3 מ"מ גבוה גבוהות, וחלק מכונה מתוך 2.5 מ"מ מטעים אלה לקחת את המוטות (ראה איור 2 ואיור 3).
- הפוך מוטות מפלדת אל-חלד בקוטר 2.4 מ"מ עם קצוות מעוגלים.
הערה: המסגרת העיקרית של המכסה הייתה במכונה מתוך צלחת duralumin. מספר מוגבל של מכשירים סיימו זמינים ד"ר Goodlad.
2. שימוש במכשיר
- לנתח את המעי הדק ומעי גס מחלל הבטן באמצעות מספרייםואצבעות בכפפות. הסר את לפדר על ידי מחזיק אותו עם מלקחיים מעוקלים ומשייכתו בעדינות מהמעי.
- יש לשטוף את המעיים עם נאגר מלוח פוספט הקר (PBS, pH 7.4) באמצעות קצה פיפטה סוג Gilson, שנכרת בסופו של הדבר הרחב יותר שלה, כך שניתן להתאים אותו מזרק פלסטיק הולם 10 או 20 מיליליטר luer.
- הנח את המעי דק (SB) לגיליון של נייר מגבת ומתחלקים לשלושה חלקים שווים באורך (הפרוקסימלי, אמצע, ודיסטלי - SB1, SB2 וSB3) באמצעות מספריים. הסר את cecum ולפרוס את המעי הגס.
- הפוך כמה חתכים קטנים מאוד למגזרי מעיים עם מספריים כדי לאפשר הנוזל לברוח והנח גיליון של נייר מגבת על המעיים ובעדינות לרוץ אצבע על ההכנות לסחוט את הנוזל ולמחוק יבשים.
- הרם את החלקים ולהכניס את מוטות הנירוסטה שהרטיבו בעבר על ידי שריה בכוס של פוספט שנאגרו מלוח.
הערה: המעי יכול להיות בverted אם כך רצוי (הפוך לחלוטין). - תווית חתיכה לחתוך נייר כרטיס או מסנן לגודל שיתאים לבסיס של המכשיר. העיפרון הוא הטוב ביותר, כפי שהוא אינו מושפע על ידי כמעט כל הפתרונות. תאריך נתיחה שלאחר המוות, קוד ניסיוני ומספר זיהוי של בעלי החיים שהציע.
- הנח את הכרטיס או נייר סינון לתוך הבסיס של המכשיר. הכנס את המוטות ומעיים לתוך החריצים בבסיס של המכשיר. ודא שהקצה הפרוקסימלי של המגזרים ממוקם באופן אחיד. הקצוות הפרוקסימלי צריכים להיות ליד תוויות הכרטיס.
- מניחים את החתיכה של המכשיר על הבסיס העליונה. השתמש בברים בזווית כדי להדריך את להב סכין מנתחים לחתוך longitudinally הסעיפים.
הערה: אם זה עוזר לי הרקמה היא בעדינות ובזהירות שנערכה עם אצבע כדי לוודא שהוא לא זז עם הסכין. - הסר את חתיכת המכשיר העליונה. מוציא בזהירות את נייר הסינון ורקמות (עדיין על המוטות שלהם).
הערה: פיסת נוקשה כרטיס ממוקמת מתחת לfilנייר ter יסייע להרמה. - מעט רטוב (עם אצבע עטויה בכפפה הטבולה בPBS) המגזרים. מגלגל את המוט, צד לצד כדי לפתוח את הבטן ולהפיץ אותו שטוח. אז הרקמה תדבק נייר הסינון.
- מבחינה ויזואלית לבחון את ההיערכות לכל נגעי ברוטו.
- העברת הרקמה דבקה נייר הסינון למקבע מכיל אמבטיה רדודה (או תיבת כריך).
הערה: לאחר הרקמות שומרת על נייר הסינון או לכרטיס הוא יישאר מחובר היטב. מגוון רחב של fixatives יכול לשמש כדי לשמר את ההכנה. מומלץ שהנוזל של Carnoy צריך לשמש למחקר של proliferations תא המעיים 6, המהווה את הקיבעון האידיאלי לשיטות התפשטות תאים הטובות ביותר; עם זאת פורמלין או יכול לשמש גם רב fixatives אחר אם נקודות קצה אחרות נדרשים. - לאחר הקיבוע (3 שעות בדרך כלל), להעביר את ההכנות לאתנול 70%. אז יכולות להיות מאוחסנות הדגימות עד נדרשת. הכנות גלהיחקר en פנים ו / או המשמש להכנת דגימות היסטולוגית עבור H & E או טכניקות צביעה היסטולוגית אחרות, אימונוהיסטוכימיה ו / או הכלאה באתר.
הערה: קיבעון ממושך יכול להפחית תגובתיות immunohistochemical ו / או בתגובתיות הכלאה באתר. תיבות כריך פוליפרופילן הן אידיאליים לאחסון מספר רב של ההכנות. - אם נדרש רקמות קבועות מהמגזרים השונים במערכת העיכול יכול להפוך להיות "לחמניות שוויצרי 'ומוכתם במגוון השלם של שיטות היסטולוגית 6 כוללים אלה שתוארו לעיל. כדי להפוך 'רול שוויצרי' מגזרי המעיים יוסרו מנייר הסינון, התגלגל מקל קוקטייל או קיסם, מאובטח עם סיכת אנטומולוגיה ומעובד לשעוות הטבעת 6.
- אם נדרש, להכתים את הרקמה בתפזורת עם תילן הכחול לדמיין מוקדי קריפטה הסוטים 7.
- ציון ההכנות קבועות בפנאי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פוליפים הם קלים לזהות תחת סטראו עם מקור אור קר לצד להאיר את הרקמה (איור 4). זה מועיל כדי לסמן את הכרטיס עם סימני עיפרון כאשר פוליפ הוא ציין כדי שהניקוד ניתן לדון בהמשך ומפעילים שונים יכולים להגיע להסכם. הרקמה יכולה להיות גם בתפזורת מוכתמת [עם מתילן הכחול] לזהות מוקדים חריגים קריפטה 8 או mucin מוקדים מדולדלים (MDFs) 9 על ידי תאורה מלמעלה או על ידי תאורת טרנס (איור 5).
מיקום נגעים יכול להיות גם הבקיע על בסיס positional 8. כדי לעשות זאת יש צורך הראשון להכין רשת של 10 מ"ר בחבילת ציור מחשב, להעתיק את זה כמה פעמים ולאחר מכן למתוח כמה רשתות בגדלים שונים וידועים להדפיס על גיליון אצטט (ראה איור 6) [התחריט הוא שימושי ו תכנית פשוטה יחסית לעושה את זה]. אפשר אז למצוא רשת שמתאימה l ength של הסעיף ולהשתמש בו כדי להבקיע האירועים של עניין.
ברגע שכבש, חלק או כל הרקמה ניתן להסיר לניתוח נוסף או יכולים להיות מגולגלים כל החלקים ל'רול שוויצרי 'לחתך היסטולוגית. בעוד הליך זה תוארה מבחינה טכנית מאתגרים 10 הטבע השטוח ואפילו של ההכנות עושה הליך זה הרבה יותר פשוט. הכנת מאקרו יכול לשמש כדי להבקיע "פוליפים מאקרו 'ולחמניות שוויצרי משמשות לציון 11,12 (איור 7)' הפוליפים מיקרו".
איור 1. איך ההשראה של המכשיר הגיעה מעיפרון. דיונים ביתרון יחידת השירות הביולוגי לרעיון של שימוש בצורת עיפרון מחצית לפעול כמדריך חיתוך.53042 53042fig1large.jpg "target =" / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. תמונות של המכשיר המקורי. המכשיר המקורי נבנו מכמה חתיכות של מתכת, שהוכנו על ידי יד. (א) המכשיר מורכב. (ב) העליונה של המכשיר הוסר כדי להראות את המוטות בעמדה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
3. תמונות דמותו של מכשיר מחדש. (א) המסגרת העיקרית של מכסה מכונה מתוך צלחת duralumin. (ב) הבסיס (ראה בשחור)עשוי מגוש מוצק של שרף אצטיל צפיפות גבוהה, שיש 4 מוטות נשלפים יושבות בתעלה. מוצג הוא נייר סינון (לבן) ממוקם בחלק העליון של הבסיס (השחור) המבט הסופי של המכשיר (C):. המכסה () ממוקם בחלק העליון של האגן (B). מידות בסנטימטרים מוצגות. המוטות היו 2.4 מ"מ קוטר עם קצוות מעוגלים. ראה התייחסות 5 לפרטים נוספים. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הכנת 4. גוט איור שנעשתה עם קיזוז מספריים ושימוש במכשיר. () המעיים מוכנים באמצעות מספריים קיזוז. (ב) המעיים מוכנים עם חותך הבטן מראה גם הרוחב לאורך כל הבטן ו ההצגה טובה יותר של הרקמה, מה שהופך את הספירה, ותצפית של פוליפים הרבה יותר קלה. שונה מאיור 3 בתא הפצת נשק 6. בר סולם עם היחידה מצויינים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
5. מוקדי קריפטה Aberrant איור ראו בהר המעי הגס מוכתם מתילן הכחול כולו. הר השלם המעי הגס היה מוכתם בתפזורת מתילן הכחול לזהות מוקדי קריפטה חריגים, שמוצגת על ידי חיצים. בר סולם עם היחידה מצויינים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
קבצים / ftp_upload / 53042 / 53042fig6.jpg "/>
איור תבנית 6. לגיליונות אצטט לניקוד positional. גדלים שונים של רשת של 10 ריבועים מודפסות על גיליונות אצטט. המעי לחתוך הוא הניח על הרשת שמתאימה לאורכו של הקטע, והאירועים של ריבית הבקיע כגון מספר ספירה של נגעים בכל ריבוע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7. רול שוויצרי של מעי דק עכבר H & E מוכתמת. רול השוויצרי המעי הדק המוצג הוא מ( / + מינ ') עכבר APC, מאופיין היטב במודל vivo של גידול-בראשית מעיים. חצים מצביעים אדנומות נציג. בר סולם עם היחידה מוצג.42 53042fig7large.jpg "target =" / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המכשיר מאוד מאיץ את התהליך, כך ששני מפעילים יכולים נתיחה לאחר מוות בעכבר באופן מלא בתוך 6 דקות. זה יכלול בדיקה חזותית לנגעי ברוטו ברורים ומשקל ותיקון האיברים העיקריים. זה גם יאפשר למפעילים לשטוף, למחוק ולשקול את הקיבה, מעי אטום, מעי דק ומעי גס ולהכין את כל mounts. הרקמה שיטחה ניתן לתקן מהר מאוד ובכך להימנע מחפצי השפלה.
אחד היתרונות הגדולים של המכשיר (מלבד מהירות) הוא שהמכשיר יכול ליצור את הייצור של הכנות איכות הרבה יותר טובה, שאז עושה ניתוח וכימות הרבה יותר קל בהמשך. En ניקוד פנים הוא אידיאלי לכימות נגעים מסרטנים ומראש מסרטנים מקרוסקופית (כגון מספר פוליפ, קוטר וניטל נפח). אפילו הטבע של ההכנות הופך אותם אידיאלי לשימוש מאוחר יותר מתגלגל לתוך 'לחמניות שוויצרי' וחתך כך שהניתוח היסטולוגית של 'עמ' מיקרוניתן גם לכמת המספר 'olyp. מוקדי קריפטה סוטות ונגעים טרום neoplastic אחרים יכולים גם להיות דמיינו באמצעות mounts כל.
שינויים דלקתיים במודלים שונים קוליטיס גם ניתן לצפות באמצעות mounts כל.
יתר על כן המיקום כמותיים והמרחבי של אירועים אלה באזורים שונים של המעי ניתן לקבוע. הגבלה של הטכניקה היא כי השימוש במכשיר דורש קצת מיומנות, במיוחד בניקוד של הרקמה עם האזמל. רוב המפעילים יכולים לשלוט בטכניקה בזמן קצר לאחר תרגול דקות ספורים. ההכנות ייקחו רק כמה דקות, אבל דגימות קטנות אם נדרש שימור מיידי ניתן לקחת לקיבעון או קפוא ולאחר מכן את שאר הרקמות מוכנות כרגיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Delrin | Ryan Plastics, Earls Barton, UK | High-density acetal resin similar material would suffice | |
| Duralumin plate | Metal Supplies Ltd, Park Road,Dukinfield. SK16 5LP UK | Aluminium allow dating back to 1909 so alterative suppliers are available | |
| Finished device(s) ready for use | Contact Dr Goodlad r.goodlad@imperial.ac.uk | Contact r.goodlad@imperial.ac.uk for supply details |
References
- Goodlad, R. A. Cancer Handbook. Alison, M. R. , John Wiley and Sons, Ltd. 243-262 (2007).
- Ward, J. M., Treuting, P. M. Rodent intestinal epithelial carcinogenesis: pathology and preclinical models. Toxicol Pathol. 42, 148-161 (2014).
- Sundberg, J. P., Hogenesch, H., Nikitin, A. Y., Treuting, P. M., Ward, J. M. Training mouse pathologists: ten years of workshops on the Pathology of Mouse Models of Human Disease. Toxicol Pathol. 40, 823-825 (2012).
- Wasan, H. S., Novelli, M., Bee, J., Bodmer, W. F. Dietary fat influences on polyp phenotype in multiple intestinal neoplasia mice. Proc Natl Acade Sci USA. 94, 3308-3313 (1997).
- Rudling, R., Hassan, A. B., Kitau, J., Mandir, N., Goodlad, R. A. A simple device to rapidly prepare whole mounts of murine intestine. Cell Prolif. 39, 415-420 (2006).
- Alferez, D., Goodlad, R. A. To best measure cell proliferation in samples from the intestine. Cell Prolif. 40, 231-240 (2007).
- Park, H. S., Goodlad, R. A., Wright, N. A. The incidence of aberrant crypt foci and colonic carcinoma in dimethylhydrazine-treated rats varies in a site-specific manner and depends on tumor histology. Cancer Res. 57, 4507-4510 (1997).
- Park, H. S., et al. Effects of epidermal growth factor and dimethylhydrazine on crypt size, cell proliferation, and crypt fission in the rat colon. Cell proliferation and crypt fission are controlled independently. Am J Pathol. 151, 843-852 (1997).
- Femia, A. P., Dolara, P., Caderni, G. Mucin-depleted foci (MDF) in the colon of rats treated with azoxymethane (AOM) are useful biomarkers for colon carcinogenesis. Carcinogenesis. 25, 277-281 (2004).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
- Goodlad, R. A., et al. Inhibiting vascular endothelial growth factor receptor-2 signaling reduces tumor burden in the ApcMin/+ mouse model of early intestinal cancer. Carcinogenesis. 27, 2133-2139 (2006).
- Mandir, N., Englyst, H., Goodlad, R. A. Resistant carbohydrates stimulate cell proliferation and crypt fission in wild-type mice and in the Apc(Min/+) mouse model of intestinal cancer, association with enhanced polyp development. Br J Nutr. 100, 711-721 (2008).
