Abstract
Подготовка тотальных мыши тонкой и толстой кишки для последующего анализа или количественного может быть трудоемким и сложным. Мы описываем использование простого устройства, чтобы сократить и кишечник ролл "мыши быстро подготовить вся гора препараты с превосходной и однородного качества к тому, что может быть достигнуто вручную. Устройство содержит основание, который содержит 4 стержни из нержавеющей стали и верх, который действует режущий направляющую. Стержни вставляются в просвет тонкой кишки [разделенного на три части] и толстой кишки. Стержни и образцы помещают над кусочек фильтровальной бумаги или картона в удерживающие прорези в основании устройства. В верхней части устройства затем устанавливают и служит режущей направл ющей. Два угловые участки в центре верхней части в качестве руководства нож или скальпель, и сократить кишечник продольно на верхней части стержней. После того, как кишечные участки были сокращены, верхний удаляется, и карта, Tissие и стержни осторожно удаляют из устройства и размещается на скамейке. Стержни затем осторожно откатился в сторону, чтобы сгладить и придерживаться кишечных сегментов на основной части фильтровальной бумаги или карты. Конечный препарат может затем быть рассмотрены или фиксированной и сохраняются для последующего анализа. Препараты незаменимы для изучения изменений в кишечной нормальных или генетически модифицированных мышах. Препараты были использованы для изучения и количественной оценки последствий воспаления (колит), повреждения, предраковых поражений (аберрантная склепа очаги (ACFS) и муцин истощены очаги (кросса)) и полипы или опухоли.
Introduction
Мышь и генетически модифицированные мыши 1-3 являются бесценным моделью для изучения различных патологий, особенно рака и его отношения к воспалению желудочно-кишечного тракта. Это часто требует подготовки тотальных тонкой кишки и / или толстой кишки.
Подготовка тотальных может быть сделано с точностью пары офсетных ножницами, но это может занять около 20 минут на мышь 4. Это не очень практично для сравнительных исследований, которые требуют значительного количества мышей (скажем, 10 на группу при условии статистического анализа). Кроме того, продолжительность времени принимать увеличивает риск деградации тканей. Попытка решить эту проблему привели к суду различных средств подготовки резки. Первый был основан на серии металлических пластин, с режущими рощ, но пластины скрыты ткани и резки, таким образом, трудно контролировать.
Conventionaл шестисторонних карандаш, наконец, источником вдохновения для режущего устройства, как мы могли бы увидеть, как форма половина карандаш бы хороший гид для скальпеля (рис 1). Это привело к конструкции для кадра с четырьмя направляющими режущих 5. Эффективность этого устройства драматично, как препараты на рисунке 4 показывают разницу между подготовкой ножницами и подготовки устройства.
Верхушки оригинальных устройств была построена из нескольких кусков металла, но более поздние, и нынешняя модель была механической из цельного куска дюралюминия. База была механической из высочайшего качества с высокой плотностью смолы.
Устройство оказалось весьма полезным для подготовки тотальных мышиного кишечника, как это значительно ускоряет и улучшает качество и согласованность препаратов, которые имеют широкий спектр применения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Различные экспериментальные процедуры и гуманный эвтаназии утверждаются хозяева учреждений этическим комитетом и соответствующими регулирующими органами. Эвтаназии, как правило, достигается с помощью СО 2 удушья с последующим смещением шейных позвонков.
1. Устройство
- Машина основная часть основания устройства от из твердого блока высокой плотности ацетил смолы, как описано в этой рукописи. На каждом конце создать 3 мм высокогорья полоски, а часть машины из этих 2,5 мм рощи, чтобы взять стержни (рисунок 2 и рисунок 3).
- Сделать стержни из 2,4 мм нержавеющей стали диаметром с закругленными концами-офф.
ПРИМЕЧАНИЕ: Основной каркас крышки был изготовлен из дюралюминия пластины. Ограниченное количество готовой устройств доступны от доктора Гудлэд.
2. Использование устройства
- Рассеките из тонкой и толстой кишки от брюшной полости с помощью ножници в перчатках пальцы. Удалить брыжейки, удерживая его пинцетом с изогнутыми и осторожно потянув ее из кишечника.
- Промыть кишечник с холодным фосфатным буферным раствором (PBS, рН 7,4) с использованием пипетки Gilson типа, который были срублены на его широкий конец, так что он может поместиться на 10 или 20 мл Люэровский соединитель пластиковый шприц.
- Выложите тонкой кишки (SB) на лист бумаги полотенце и разделить на три равные части по длине (проксимальных, средних и дистальных - SB1 SB2, SB3 и) с помощью ножниц. Удалить слепой кишки и выложить толстой кишки.
- Сделайте несколько очень небольшие порезы в кишечной сегментов с ножницами, чтобы жидкость, чтобы избежать и поместите лист бумаги полотенце в течение кишечника и осторожно запустить пальцем по подготовке выжать жидкость и промокните насухо.
- Лифт секции и вставить стержни из нержавеющей стали, которые ранее были смочены замачивания в стакане фосфатным буферным солевым раствором.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кишечник может быть впреобразуется при желании (вывернуть наизнанку). - Этикетка кусок карты или среза фильтра с размером бумаги, чтобы вписаться в базе устройства. Карандаш лучше, так как он не подвержен практически всех решений. Вскрытие дата, экспериментальный код и номер идентификации животных предлагается.
- Поместите карту или фильтровальную бумагу в основание устройства. Вставьте стержни и кишечник в пазы в нижней части устройства. Убедитесь, что проксимальный конец сегментов расположен в стандартизованной форме. Проксимальные концы должны быть рядом с этикетки карт.
- Поместите верхнюю часть устройства над базой. Используйте угловые бары, чтобы вести лезвие скальпеля продольно разрезать секции.
Примечание: Это помогает, если ткань осторожно и тщательно проведены с пальцем, чтобы она не двигается с ножом. - Удалить верхнюю часть устройства. Осторожно удалите бумагу фильтра и тканей (до сих пор на их стержней).
ПРИМЕЧАНИЕ: кусок плотной карты размещены под филтер бумага поможет атлетика. - Слегка влажный (в перчатке пальца, смоченным в PBS) сегментов. Раскатайте стержень, из стороны в сторону, чтобы открыть кишку и распространять его квартиру. Ткань будет прилипать к фильтровальной бумаге.
- Визуально проверьте подготовительную работу к любой грубых поражений.
- Передача ткани, приклеенный к фильтровальной бумаге в мелкой ванны (или сэндвич коробка), содержащей фиксатора.
Примечание: После того, как ткань прилипает к фильтровальной бумаге или на карту она останется прочно прикреплены. Широкий ассортимент фиксаторов можно использовать, чтобы сохранить подготовку. Рекомендуется, чтобы жидкость Карнуа следует использовать для изучения кишечных клеток пролиферации 6, который является идеальным для фиксации лучших способов пролиферации клеток; Однако формалина или других фиксаторов многие также может быть использован, если требуются другие конечные точки. - После фиксации (обычно 3 ч), передачи препаратов в 70% этанола. Затем образцы можно хранить до необходимости. Препараты сбыть изучены в фас и / или использовать для приготовления гистологических образцов для H & E или других гистологических методов окрашивания, иммуногистохимии и / или в гибридизация.
ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное фиксация может уменьшить иммуногистохимическое реактивность и / или в гибридизация реактивности. Сэндвич Полипропилен коробки идеально подходят для хранения большого количества препаратов. - При необходимости фиксированные ткани от различных кишечных сегментов могут быть превращены в "рулетов" и окрашивали всем диапазоне гистологических методов 6 в том числе описано выше. Чтобы сделать "рулет" кишечные сегменты удаляются из фильтровальной бумаги, каталась коктейль палочкой или зубочисткой, обеспеченного с энтомологического контактный и обрабатываются для встраивания воск 6.
- При необходимости, пятно объемной ткани с метиленовым синим, чтобы визуализировать аномальное очагов крипт 7.
- Оценка фиксированные препараты вдосуг.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Полипы легко определить в соответствии с стереомикроскопа с холодным источником света в сторону освещения ткани (фиг.4). Это полезно, чтобы отметить карту с карандашом, когда полип наблюдается для того, чтобы скоринг можно обсудить позже, и различные операторы могут достичь соглашения. Ткань также может быть масса окрашенных [метиленовым синим], чтобы определить аберрантная склепа очаги 8 или муцина обедненный очаги (кросса) 9 освещением сверху или транс освещения (Рисунок 5).
Расположение поражений могут быть также забил на позиционной основе 8. Для этого одна первая должна подготовить сетку 10 площади компьютерной графики пакета, скопируйте это несколько раз, а затем растянуть несколько сеток на различных известных размеров и печати на ацетат лист (рисунок 6) [Глубокая является полезным и относительно простая программа для этого]. Тогда можно найти сетку, которая соответствует L ength секции и использовать его, чтобы набрать нужные события.
После того, как забил, часть или все ткани могут быть удалены для дальнейшего анализа или целые разделы могут быть свернуты в в 'рулет "для гистологического срезов. Хотя эта процедура была описана как технически сложный 10, плоской и ровной характер препаратов делает эту процедуру гораздо проще. Макрос препарат может быть использован, чтобы выиграть "макро" полипы и рулетов, используемые, чтобы выиграть "микрофинансовых полипы" 11,12 (рисунок 7).
Рисунок 1. Как вдохновение устройства пришли от карандаша. Обсуждения в единицу свинца Биологическая службы к идее использования половину форму карандаша, чтобы действовать в качестве режущего руководства.53042 / 53042fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Фотографии оригинального устройства. Оригинальный устройства была построена из нескольких кусков металла, приготовленных вручную. (А) Устройство в сборе. (Б) В верхней части устройства была удалена, чтобы показать стержни в положении. Пожалуйста, Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Фотографии переработан устройства. (A) Основной каркас крышки обрабатывается из дюралюминия пластины. (B) Базовые (видел в черном)изготовлена из твердого блока высокой плотности ацетил смолы, имеющий 4 съемные стержней сидят в канале. Показана фильтровальная бумага (белый) размещены на верхней части основания (черный) (С) Конечный вид устройства:. Крышка (А) находится в верхней части бассейна (B). Размеры в см показаны. Стержни были 2,4 мм в диаметре с закругленными концами, с. См ссылку 5 для более подробной информации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Препарат Gut сделал со смещением ножницами и с помощью устройства. (А) Кишечник получены с использованием смещения ножницы. (Б) кишечник, приготовленные с резак кишки, показывающий еще ширина всей кишке и лучше презентация ткани, что делает подсчет и наблюдения полипов гораздо проще. Измененный рисунке 3 в клеточной пролиферации 6. Масштабная линейка с блоком указывается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Аберрантные очагов крипт видел во всей горе толстой кишки, окрашенных метиленовым синим. Вся крепление толстой кишки был основная окрашивали метиленовым синим для выявления аномальным очагов крипт, показаны стрелками. Масштабная линейка с блоком указывается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Файлы / ftp_upload / 53042 / 53042fig6.jpg "/>
Рисунок 6. Шаблон для ацетатные листы для позиционной скоринга. Различные размеры сетки 10 квадратов печатаются на листах ацетат. Разрез заложен кишечник на сетке, которая соответствует длине секции, и события, представляющие интерес, такие как забил подсчета количества поражений в каждом квадрате. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7. рулет из Н & Е окрашенных мыши тонком кишечнике. Тонкий кишечник рулет показана с компанией APC (Min / +) мыши, хорошо характеризуется в естественных условиях модели опухоли кишечника-генеза. Стрелки указывают представительства аденомы. Масштабная линейка с блоком показано.42 / 53042fig7large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Устройство значительно ускоряет процесс, так что два оператора могут в полной мере вскрытие мыши в 6 мин. Это будет включать в себя визуальную проверку по понятным грубых поражений и взвешивания и фиксации основные органы. Это также позволит операторам промыть, промокнуть и взвесить желудка, слепой кишки, тонкого и толстого кишечника и подготовки тотальных. Сглаженный ткани может быть исправлена очень быстро и при этом избежать артефактов деградации.
Одним из главных достоинств устройства (кроме скорости) является то, что устройство может генерировать производство гораздо лучше препаратов качества, которые затем делает последующий анализ и количественное намного легче. Анфас скоринга идеально подходит для количественного макроскопические канцерогенные и предварительно канцерогенные повреждения (например, полип числа, диаметра и объема нагрузки). Равномерное характер препаратов делает их идеальными для последующего прокатки в "рулетов" и секционирования так что гистологический анализ "микро рКоличество olyp 'также может быть количественно. Ненормальная склепа очаги и другие пренеопластические поражения также могут быть визуализированы с помощью тотальных.
Воспалительные изменения в различных моделях колит может также наблюдаться с помощью тотальных.
Кроме того, количественное и пространственное расположение этих событий в различных регионах кишечнике может быть определена. Ограничение техники является то, что использование устройства требует ловкости, особенно в выигрыше ткани скальпелем. Большинство операторов могут освоить технику в течение короткого времени после нескольких практике минут. Препараты только через несколько минут, но если требуется мгновенное сохранение небольшие образцы могут быть приняты для фиксации или замороженные, а затем остальную часть ткани, полученного, как обычно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Delrin | Ryan Plastics, Earls Barton, UK | High-density acetal resin similar material would suffice | |
| Duralumin plate | Metal Supplies Ltd, Park Road,Dukinfield. SK16 5LP UK | Aluminium allow dating back to 1909 so alterative suppliers are available | |
| Finished device(s) ready for use | Contact Dr Goodlad r.goodlad@imperial.ac.uk | Contact r.goodlad@imperial.ac.uk for supply details |
References
- Goodlad, R. A. Cancer Handbook. Alison, M. R. , John Wiley and Sons, Ltd. 243-262 (2007).
- Ward, J. M., Treuting, P. M. Rodent intestinal epithelial carcinogenesis: pathology and preclinical models. Toxicol Pathol. 42, 148-161 (2014).
- Sundberg, J. P., Hogenesch, H., Nikitin, A. Y., Treuting, P. M., Ward, J. M. Training mouse pathologists: ten years of workshops on the Pathology of Mouse Models of Human Disease. Toxicol Pathol. 40, 823-825 (2012).
- Wasan, H. S., Novelli, M., Bee, J., Bodmer, W. F. Dietary fat influences on polyp phenotype in multiple intestinal neoplasia mice. Proc Natl Acade Sci USA. 94, 3308-3313 (1997).
- Rudling, R., Hassan, A. B., Kitau, J., Mandir, N., Goodlad, R. A. A simple device to rapidly prepare whole mounts of murine intestine. Cell Prolif. 39, 415-420 (2006).
- Alferez, D., Goodlad, R. A. To best measure cell proliferation in samples from the intestine. Cell Prolif. 40, 231-240 (2007).
- Park, H. S., Goodlad, R. A., Wright, N. A. The incidence of aberrant crypt foci and colonic carcinoma in dimethylhydrazine-treated rats varies in a site-specific manner and depends on tumor histology. Cancer Res. 57, 4507-4510 (1997).
- Park, H. S., et al. Effects of epidermal growth factor and dimethylhydrazine on crypt size, cell proliferation, and crypt fission in the rat colon. Cell proliferation and crypt fission are controlled independently. Am J Pathol. 151, 843-852 (1997).
- Femia, A. P., Dolara, P., Caderni, G. Mucin-depleted foci (MDF) in the colon of rats treated with azoxymethane (AOM) are useful biomarkers for colon carcinogenesis. Carcinogenesis. 25, 277-281 (2004).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
- Goodlad, R. A., et al. Inhibiting vascular endothelial growth factor receptor-2 signaling reduces tumor burden in the ApcMin/+ mouse model of early intestinal cancer. Carcinogenesis. 27, 2133-2139 (2006).
- Mandir, N., Englyst, H., Goodlad, R. A. Resistant carbohydrates stimulate cell proliferation and crypt fission in wild-type mice and in the Apc(Min/+) mouse model of intestinal cancer, association with enhanced polyp development. Br J Nutr. 100, 711-721 (2008).
