Abstract
Preparación de los montajes enteros del intestino delgado y el colon de ratón para el análisis o cuantificación posterior puede ser lento y difícil. Se describe el uso de un dispositivo fácil de cortar y los intestinos 'roll' ratón para preparar rápidamente los preparativos completos de montaje de calidad superior y uniforme a lo que se puede lograr con la mano. El dispositivo comprende una base que tiene 4 varillas de acero inoxidable y una parte superior, que actúa una guía de corte. Las varillas se insertan en el lumen del intestino delgado [dividido en tercios] y el colon. Las barras y las muestras se colocan entonces sobre un trozo de papel de filtro o de la tarjeta en las ranuras de retención en la base del dispositivo. La parte superior del dispositivo se coloca a continuación y sirve como una guía de corte. Las dos secciones en ángulo en el centro de la pieza superior se utilizan para guiar un cuchillo o bisturí y cortar los intestinos longitudinalmente en la parte superior de las barras. Una vez que las secciones intestinales han sido cortadas, la parte superior se elimina y la tarjeta, TISSue y varillas retira suavemente desde el dispositivo y se coloca en el banco. Las barras son entonces rodó suavemente hacia los lados para aplanar y se adhieren los segmentos intestinales en la pieza fundamental de un papel de filtro o de la tarjeta. La preparación final puede entonces ser examinado o fija y se almacena para su posterior análisis. Los preparativos son de gran valor para el estudio de los cambios intestinales en los modelos normales o modificados genéticamente ratón. Las preparaciones se han utilizado para el estudio y cuantificación de los efectos de la inflamación (colitis), daños, lesiones pre-cancerosas (focos de criptas aberrantes (FCA) y mucina focos (MDF) empobrecido) y los pólipos o tumores.
Introduction
El ratón y el ratón modificado genéticamente 1-3 son un modelo de gran valor para el estudio de diversas patologías, especialmente de cáncer y su relación con la inflamación en el tracto gastrointestinal. Esto a menudo requiere la preparación de preparaciones completas del intestino delgado y / o colon.
La preparación de los montajes enteros se puede hacer con un par de tijeras de precisión de desplazamiento, pero puede tomar alrededor de 20 minutos por ratón 4. Esto no es muy práctico para estudios comparativos, que requieren una cantidad significativa de los ratones (10 por grupo decir sujetas a análisis estadístico). Además, la longitud de tiempo que se tarda aumenta el riesgo de la degradación del tejido. Un intento de aliviar este problema llevó al juicio de varias ayudas de preparación de corte. El primero se basa en una serie de placas de metal, con arboledas de corte, pero las placas oscurecido el tejido y el corte fue por lo tanto difícil de controlar.
Un conventional lápiz de seis lados, finalmente sirvió de inspiración para el dispositivo de corte, ya que entonces podríamos ver como una forma de media lápiz haría una buena guía para un bisturí (Figura 1). Esto dio lugar a un diseño para un marco con cuatro guías de corte 5. La eficacia de este dispositivo era dramático como las preparaciones en la Figura 4 demuestran la diferencia entre la preparación de tijera y la preparación dispositivo.
Las copas de los dispositivos originales se construyen a partir de varias piezas de metal, pero los posteriores, y el modelo actual se mecanizan de una pieza sólida de duraluminio. La base se mecanizó en resina de alta densidad más alta calidad.
El dispositivo ha demostrado ser de gran utilidad para la preparación de los montajes enteros de intestino del ratón, ya que acelera en gran medida y mejora la calidad y la consistencia de los preparados, que tienen una amplia gama de aplicaciones.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Los diferentes procedimientos experimentales y la eutanasia humanitaria son aprobados por el comité de ética instituciones de acogida y por los órganos de control pertinentes. La eutanasia se logra normalmente mediante asfixia con CO2, seguido por dislocación cervical.
1. Dispositivo
- Máquina de la porción principal de la base del dispositivo desde fuera de un bloque sólido de resina de acetilo de alta densidad, como se describe en este manuscrito. En cada extremo crear tiras de alto elevado 3 mm, y parte de la máquina fuera de estos campos de 2,5 mm para tomar las varillas (véase la Figura 2 y la Figura 3).
- Hacer varillas de acero inoxidable de 2,4 mm de diámetro con extremos redondeados-off.
NOTA: El marco principal de la tapa se mecanizó de placa de duraluminio. Un número limitado de dispositivos acabados están disponibles en Dr. Goodlad.
2. El uso del dispositivo
- Diseccionar el intestino delgado y el colon de la cavidad abdominal con tijerasy los dedos enguantados. Retire el mesenterio sujetándolo con pinzas curvas y suavemente tirando de él lejos del intestino.
- Enjuagar los intestinos con fosfato fría solución salina tamponada (PBS, pH 7,4) usando una punta de pipeta de tipo Gilson, que había sido cortado hacia abajo en su extremo más ancho de modo que pueda caber en un 10 o 20 ml luer de la jeringa de plástico.
- Coloque el intestino delgado (SB) en una hoja de papel de cocina y se divide en tres secciones iguales en longitud (proximal, medio y distal - SB1, SB2 y SB3) con unas tijeras. Retire el ciego y diseñar el colon.
- Hacer varios cortes muy pequeños en los segmentos intestinales con unas tijeras para permitir que el fluido se escape y coloque una hoja de papel de cocina sobre los intestinos y suavemente ejecutar un dedo sobre los preparativos para exprimir el líquido y secar.
- Levante las secciones e insertar las varillas de acero inoxidable que se humedecieron previamente por inmersión en un vaso de precipitados de solución salina tamponada con fosfato.
NOTA: El intestino puede estar enverted si así se desea (vuelto del revés). - Etiquetar un trozo de cartón o un filtro de corte de papel de tamaño para encajar en la base del dispositivo. Pencil es mejor, ya que no se ve afectada por prácticamente todas las soluciones. Fecha de la autopsia, el código experimental y el número de identificación de los animales se sugieren.
- Coloque la tarjeta o papel de filtro en la base del dispositivo. Inserte las varillas y los intestinos en las ranuras de la base del dispositivo. Asegúrese de que el extremo proximal de los segmentos se posiciona de una manera estandarizada. Los extremos proximales deben estar cerca de las etiquetas de la tarjeta.
- Coloque la pieza superior del dispositivo a través de la base. Utilice las barras en ángulo para guiar una hoja de bisturí para cortar longitudinalmente las secciones.
NOTA: Ayuda si el tejido es suave y cuidadosamente celebró con un dedo para garantizar que no se mueve con el cuchillo. - Retire la pieza superior del dispositivo. Retire con cuidado el papel y tejidos de filtro (todavía en sus barras).
NOTA: Un trozo de cartón rígido colocado debajo de la filpapel ter ayudará elevación. - Ligeramente húmedo (con un dedo enguantado sumergido en PBS) los segmentos. Estirar la varilla, de lado a lado para abrir el intestino y difundirlo plana. El tejido entonces se adhieren al papel de filtro.
- Examinar visualmente los preparativos de las lesiones macroscópicas.
- Transferir el tejido adherido al papel de filtro en un baño poco profundo (o caja de sándwich) que contiene fijador.
NOTA: Después de que el tejido se adhiere al papel de filtro o en la tarjeta se mantendrá firmemente unida. Una amplia gama de fijadores se puede utilizar para preservar la preparación. Se recomienda que el fluido de Carnoy se debe utilizar para el estudio de las proliferaciones de células intestinales 6, que es ideal para la fijación de los mejores métodos de proliferación celular; Sin embargo formalina o muchos otros fijadores también se pueden utilizar si se requieren otros criterios de valoración. - Después de la fijación (por lo general de 3 horas), la transferencia de los preparativos en etanol al 70%. Las muestras se pueden almacenar hasta que sea necesario. Las preparaciones cun ser estudiados en face y / o utilizados para la preparación de muestras histológicas para H & E u otras técnicas de tinción histológica, inmunohistoquímica y / o hibridación in situ.
NOTA: La prolongada fijación puede reducir la reactividad inmunohistoquímica y / o en la reactividad hibridación in situ. Cajas de sándwich de polipropileno son ideales para almacenar un gran número de las preparaciones. - Si es necesario los tejidos fijos de los diversos segmentos de intestino puede convertirse en 'brazos de gitano' y teñidas con toda la gama de métodos histológicos 6 incluyendo los descritos anteriormente. Para hacer un "brazo de gitano" los segmentos intestinales se retiran del papel de filtro, enrollado alrededor de un palillo o un palillo de dientes, se sujeta con un pasador entomológica y procesados para la cera de incrustación de 6.
- Si es necesario, manchar el tejido grueso con azul de metileno para visualizar aberrante focos de criptas 7.
- Puntuación de los preparativos fijos enocio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Los pólipos son fáciles de identificar en un estereomicroscopio con una fuente de luz fría a lado iluminar el tejido (Figura 4). Es útil para marcar la tarjeta con marcas de lápiz cuando se observa un pólipo con el fin de que la puntuación se puede discutir más tarde y diferentes operadores pueden llegar a un acuerdo. El tejido también puede ser mayor manchado [con azul de metileno] para identificar focos de criptas aberrantes 8 o mucina focos empobrecido (MDF) 9 por la iluminación desde arriba o por iluminación trans (Figura 5).
La localización de las lesiones también se puede marcar de forma posicional 8. Para ello se necesita primero preparar una cuadrícula de 10 cuadrados en un paquete de dibujo ordenador, copiar esto varias veces y luego estirar las varias redes a diferentes tamaños conocidos e imprimir en una hoja de etilo (ver Figura 6) [Intaglio es una útil y programa relativamente simple para hacer esto]. Entonces se puede encontrar una cuadrícula que se ajusta a la l ength de la sección y lo utilizan para marcar los eventos de interés.
Una vez que obtuvieron, parte o la totalidad del tejido puede ser removido para su posterior análisis o secciones enteras se puede enrollar en un "brazo de gitano" para seccionamiento histológico. Si bien este procedimiento ha sido descrito como un desafío técnico 10 la naturaleza plana y uniforme de las preparaciones hace que este procedimiento mucho más sencillo. La preparación macro se puede utilizar para anotar 'pólipos macro y de los brazos de gitano utilizados para anotar' micro 'pólipos 11,12 (Figura 7).
Figura 1. Cómo la inspiración del dispositivo de vino de un lápiz. Los debates en el plomo unidad de servicio Biológica a la idea de usar una forma media lápiz para actuar como una guía de corte.53042 / 53042fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Fotos del dispositivo original. El dispositivo original fue construida a partir de varias piezas de metal, elaboradas a mano. (A) El dispositivo montado. (B) La parte superior del dispositivo ha sido retirada para mostrar las barras en posición. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Fotos de dispositivo rediseñado. (A) El marco principal de la tapa está mecanizada de placa de duraluminio. (B) la base (se ve en negro)está hecho de un bloque sólido de resina de acetilo de alta densidad, que tiene 4 barras extraíbles que se sientan en un canal. Se muestra un papel de filtro (blanco) colocado en la parte superior de la base (negro) (C) La vista final del dispositivo:. La tapa (A) se coloca en la parte superior de la cuenca (B). Se muestran Dimensiones en centímetros. Las barras fueron de 2,4 mm de diámetro con extremos redondeados-off. Véase la referencia 5 para más detalles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Gut preparación hecha con compensado tijera y usar el dispositivo. (A) Los intestinos prepararon utilizando tijeras offset. (B) los intestinos preparados con el cortador de intestino que muestra la anchura incluso en todo el intestino y la mejor presentación del tejido, lo que hace el recuento, y la observación de pólipos mucho más fácil. Modificado de la Figura 3 en la proliferación celular 6. Barra de escala con la unidad se indica. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. focos de criptas aberrantes vistos en todo el montaje de dos puntos teñidos con azul de metileno. El conjunto de montaje de colon fue mayor tiñó con azul de metileno para identificar focos de criptas aberrantes, que se muestra por las flechas. Barra de escala con la unidad se indica. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
archivos / ftp_upload / 53042 / 53042fig6.jpg "/>
Figura 6. Plantilla para hojas de acetato para la puntuación posicional Varios tamaños de cuadrícula de 10 cuadrados. Se imprimen en hojas de acetato. El intestino corte se coloca en la parrilla que se ajuste a la longitud de la sección, y los eventos de interés se anotó como el número de recuento de las lesiones en cada cuadrado. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. brazo de gitano de un intestino delgado de ratón H & E manchadas. El pequeño rollo suizo delgado muestra es de una (/ + Min) ratón Apc, un bien caracterizado modelo in vivo de tumores intestinales génesis en. Las flechas indican adenomas representativos. Se muestra la barra de escala con la unidad.42 / 53042fig7large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El dispositivo acelera en gran medida el proceso para que dos operadores pueden autopsia plenamente un ratón dentro de 6 min. Esto incluirá una comprobación visual para las lesiones macroscópicas evidentes y el pesaje y la fijación de los órganos principales. También permitirá a los operadores para enjuagar, secar y pesar el estómago, intestino ciego, intestino delgado y el colon y se preparan todo el monturas. El tejido aplanado puede fijarse muy rápidamente y por lo tanto evitar los artefactos de degradación.
Una de las principales ventajas del dispositivo (aparte de velocidad) es que el dispositivo puede generar la producción de preparaciones calidad mucho mejor, que entonces hace que el posterior análisis y cuantificación mucho más fácil. En la puntuación cara es ideal para la cuantificación de las lesiones cancerígenas y pre-cancerígenos macroscópicas (como el número de pólipos, diámetro y volumen de carga). La naturaleza, incluso de los preparativos hace ideales para después rodar en 'brazos de gitano "y el corte de manera que el análisis histológico de' micro pnúmero olyp también se puede cuantificar. Focos de criptas aberrantes y otras lesiones pre-neoplásicas también se pueden visualizar utilizando los montajes enteros.
Los cambios inflamatorios en diversos modelos de colitis también pueden ser observados utilizando los montajes enteros.
Además, la ubicación cuantitativa y espacial de estos eventos en diferentes regiones del intestino se puede determinar. Limitación de la técnica es que el uso del dispositivo requiere cierta destreza, especialmente en el marcador del tejido con el bisturí. La mayoría de los operadores pueden dominar la técnica en un corto tiempo después de unos pocos minutos de práctica. Los preparativos sólo toman unos pocos minutos, pero las muestras pequeñas, si se requiere la preservación instantánea pueden ser tomadas para la fijación o congelada y luego el resto del tejido preparado como de costumbre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Delrin | Ryan Plastics, Earls Barton, UK | High-density acetal resin similar material would suffice | |
| Duralumin plate | Metal Supplies Ltd, Park Road,Dukinfield. SK16 5LP UK | Aluminium allow dating back to 1909 so alterative suppliers are available | |
| Finished device(s) ready for use | Contact Dr Goodlad r.goodlad@imperial.ac.uk | Contact r.goodlad@imperial.ac.uk for supply details |
References
- Goodlad, R. A. Cancer Handbook. Alison, M. R. , John Wiley and Sons, Ltd. 243-262 (2007).
- Ward, J. M., Treuting, P. M. Rodent intestinal epithelial carcinogenesis: pathology and preclinical models. Toxicol Pathol. 42, 148-161 (2014).
- Sundberg, J. P., Hogenesch, H., Nikitin, A. Y., Treuting, P. M., Ward, J. M. Training mouse pathologists: ten years of workshops on the Pathology of Mouse Models of Human Disease. Toxicol Pathol. 40, 823-825 (2012).
- Wasan, H. S., Novelli, M., Bee, J., Bodmer, W. F. Dietary fat influences on polyp phenotype in multiple intestinal neoplasia mice. Proc Natl Acade Sci USA. 94, 3308-3313 (1997).
- Rudling, R., Hassan, A. B., Kitau, J., Mandir, N., Goodlad, R. A. A simple device to rapidly prepare whole mounts of murine intestine. Cell Prolif. 39, 415-420 (2006).
- Alferez, D., Goodlad, R. A. To best measure cell proliferation in samples from the intestine. Cell Prolif. 40, 231-240 (2007).
- Park, H. S., Goodlad, R. A., Wright, N. A. The incidence of aberrant crypt foci and colonic carcinoma in dimethylhydrazine-treated rats varies in a site-specific manner and depends on tumor histology. Cancer Res. 57, 4507-4510 (1997).
- Park, H. S., et al. Effects of epidermal growth factor and dimethylhydrazine on crypt size, cell proliferation, and crypt fission in the rat colon. Cell proliferation and crypt fission are controlled independently. Am J Pathol. 151, 843-852 (1997).
- Femia, A. P., Dolara, P., Caderni, G. Mucin-depleted foci (MDF) in the colon of rats treated with azoxymethane (AOM) are useful biomarkers for colon carcinogenesis. Carcinogenesis. 25, 277-281 (2004).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
- Goodlad, R. A., et al. Inhibiting vascular endothelial growth factor receptor-2 signaling reduces tumor burden in the ApcMin/+ mouse model of early intestinal cancer. Carcinogenesis. 27, 2133-2139 (2006).
- Mandir, N., Englyst, H., Goodlad, R. A. Resistant carbohydrates stimulate cell proliferation and crypt fission in wild-type mice and in the Apc(Min/+) mouse model of intestinal cancer, association with enhanced polyp development. Br J Nutr. 100, 711-721 (2008).
