Abstract
At indtaste sin humane vært, skal herpes simplex virus type 1 (HSV-1) overvinde barrieren af slimhindeinfektioner, hud, eller hornhinde. HSV-1 mål keratinocytter under den indledende post og etablerer en primær infektion i epithelet, som efterfølges af latent infektion af neuroner. Efter reaktivering, kan virus blive tydelig ved mucokutane websteder, der vises som hud vesikler eller slimhinder sår. Hvor HSV-1 invaderer hud eller slimhinde, og når dets receptorer er dårligt forstået. For at undersøge invasionen rute HSV-1 i overhudsvæv på celleniveau, etablerede vi et ex vivo infektion af murine model epidermis, hvilket repræsenterer stedet for primære og tilbagevendende infektion i huden. Assayet omfatter udarbejdelse af murine hud. Epidermis er adskilt fra dermis ved dispase II behandling. Efter flydende de epidermale ark på virusholdige medium, vævet er fast og infektion kan visualiseres på forskellige tidspunkter efter infektion affarvning inficerede celler med et antistof mod HSV-1 immediate early protein ICP0. ICP0-udtrykkende celler kan observeres i den basale keratinocytlag allerede ved 1,5 timer efter infektion. Med længere infektion gange, er inficerede celler påvises i suprabasallagene, hvilket indikerer, at infektion ikke er begrænset til de basale keratinocytter, men virus spreder sig til andre lag i vævet. Brug af epidermale ark af forskellige musemodeller, infektionen protokollen tillader bestemmelse inddragelse af cellulære komponenter, der bidrager til HSV-1 invasion i væv. Desuden er assayet egnet til at teste inhibitorer i væv, der interfererer med de indledende post trin, celle-til-celle-spredning og virusproduktion. Her beskriver vi den ex vivo infektion protokol i detaljer og præsentere vores resultater ved hjælp nectin-1- eller Hvem-mangel mus.
Introduction
Herpes simplex virus (HSV) kan forårsage en række sygdomme hos mennesker fra mild ukomplicerede mucokutane læsioner til livstruende infektioner. HSV type 1 (HSV-1) er overvejende forbundet med orofaciale infektioner og encephalitis, mens HSV type 2 (HSV-2) mere sandsynligt forårsager genitale infektioner 1. Mens der er betydelige fremskridt med at forstå, hvordan HSV indtaster celler i kultur, initierer infektion og producerer virale afkom, vi ved lidt om den virale invasion vejen (er) i væv på celleniveau 2. Til undersøgelser af HSV hud eller mucosale infektioner, mus, har kaniner og marsvin blevet anvendt som dyremodeller. Hudinfektion blev etableret ved intradermal injektion eller ved at skrabe huden i nærvær af virus og sygdomsudvikling blev korreleret med virusproduktion. Disse metoder bidrog til at forstå forskellige aspekter af sygdommen patogenese og anvendes til at evaluere antivirale lægemidler. At studere HSV infektion på tissue niveau, er blevet anvendt organotypiske hudmodeller menneskelige. Som satsen for infektion er begrænset i disse tømmerflåde kulturer, har kun et begrænset antal studier der undersøger infektion, viral spredning og virkningerne af antivirale komponenter blevet offentliggjort 3-6.
For at karakterisere cellulære determinanter, der spiller en rolle under HSV-1 infektion i intakt epitel, vi etableret en protokol for ex vivo infektion studier af murine epidermis 7. Hud blev fremstillet ud fra nyfødte eller fra halerne af voksne mus. Da HSV-1 ikke kunne inficere komplette hudprøver, som blev nedsænket i virusholdige medium, vi adskilt epidermis fra dermis ved dispase II behandling. Efter optagelsen af de epidermale ark på virusholdige medium, kan inficerede celler visualiseres i epidermal basale lag på forskellige tidspunkter efter infektion (pi) 7. For at visualisere indledningen af infektion i individuelle celler forud for virusreplikation ennd virusproduktion, vi farvet med et antistof mod inficerede-celleprotein 0 (ICP0), som er en af de første proteiner, der udtrykkes i HSV-1-infektion. Den cellulære lokalisering af ICP0 passerer gennem særskilte faser i den tidlige infektion. Mens ICP0 er til stede i nuklear foci i en tidlig fase af viral genekspression, relocalization af ICP0 til cytoplasmaet angiver en efterfølgende fase af infektion 8.
Vi brugte ex vivo infektion assay af epidermale ark fra forskellige musemodeller for at afprøve den potentielle rolle af forskellige cellulære faktorer under infektion. For at løse virkningen af Rac1 som et centralt regulator af actin dynamik, vi smittet epidermis af mus med en keratinocyt-specifik sletning af Rac1 gen 9. Denne model tillod os at undersøge konsekvenserne af mangelfuld Rac1 på effektiviteten af HSV-1-infektion i epidermal keratinocyt lag. Sammenligningen med inficerede epidermis af kontroldyr fra samme kuld reafslørede ingen signifikant forskel, hvilket indikerer, at der ikke findes Rac1 havde ingen effekt på indledningen af infektion i det basale lag af epidermis 7. Brugen af yderligere musemodeller tilladt os at tage fat på hvilke cellulære receptorer mægle indrejse i epidermis. Inficerer epidermisark fra enten nectin-1- eller HVEM-deficiente mus med HSV-1 viste, at den oprindelige viral indtrængen i væv afhænger i høj grad af tilstedeværelsen af nectin-1 10. Desuden er vores resultater viser, at HVEM også kan tjene som receptor i murine epidermis, dog mindre effektivt end nectin-1 10.
For at løse den rumlige fordeling af inficerede celler i epidermale lag, vi visualisere ICP0 ekspression i vævssektioner og epidermale hele underlag (figur 1). I snit af komplette hud, er ingen ICP0-udtrykkende celler detekteres (figur 1). I modsætning hertil snit af epidermale ark påvise cytoplasmatiskICP0 ekspression i det basale lag allerede på 3 timer pi (figur 1). På senere tidspunkter, viral spredning til suprabasale lag kan visualiseres. Den rumlige fordeling af inficerede celler i det basale lag kan let følges i epidermale hele underlag (figur 1). Efter infektion med HSV-1 ved 100 PFU / celle, ca. 50% af basalkeratinocytter i interfollicular epidermis viser ICP0 ekspression på 1,5 timer pi På dette tidspunkt mest inficerede celler udtrykker nukleare ICP0. Den relocalization af ICP0 til cytoplasmaet indikerer et senere stadium af tidlig genekspression er til stede i næsten alle celler på 3 timer pi (figur 1). Disse former for visualisering inficerede celler efter ex vivo HSV-1-infektion er et effektivt assay at undersøge virkningen af inhibitorer eller slettede / muterede cellulære komponenter på viral indtrængen og udbredelse i væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik erklæring.
Udarbejdelsen af epidermale ark fra aflivede dyr udføres i nøje overensstemmelse med anbefalingerne fra vejledning af Landesamt für Natur, Umwelt og Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen (Tyskland). Undersøgelsen blev godkendt af LANUV NRW (Nummer 8.84-02.05.20.13.018).
1. Fremstilling af instrumenter og kultur medier
- Dyrk epidermisark i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) / høj glucose indeholdende glutamin dipeptid, 10% FCS, 100 IU / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin (i det følgende benævnt "DMEM").
- Til fremstilling af epidermale ark, omhyggeligt opløses dispase II pulver (5 mg / ml) i PBS opvarmet (op til 37 ° C). Opløsningen filtreres gennem et 0,22 um filter og bruge det direkte til behandling.
- Til fremstillingen af epidermal hele mounts 13, forberede blokere buffER med 0,5% mælkepulver, 0,25% gelatine fra koldt vand fiskeskind og 0,5% Triton X-100 i TBS. Tillad stoffer opløses ved inkubering af blandingen i mindst 2 timer ved stuetemperatur på en roterende blander. Også forberede 0,2% Tween 20 i PBS som vaskebuffer. Til fiksering, forbereder 3,4% og 4% formaldehyd i PBS.
- For immunfarvning af kryosektioner, forberede blokeringsbuffer med 5% normalt gedeserum og 0,2% Tween 20 i PBS. Til fiksering, udarbejde 0,5% formaldehyd i PBS.
2. Udarbejdelse af epidermisark fra murine hud
- Fremstilling af epidermis fra nyfødte rygskind for infektionsstudier
- Placer en halshugget mus (1 til 3 dage efter fødslen) i en dissektion skål og afbrød ekstremiteter og halen tæt på torso at tillade effektiv fjernelse af skindet fra komplette torso. Under fjernelsen af ekstremiteterne, forsøge at holde snittene så lille som muligt i diameter.
- Fastgør torso med buet fine pincet ennd forsigtigt flytte stump spids saks under huden fra kraniale til caudale langs ryggen for at adskille huden fra kroppen. Slids huden langs ryggen.
- For FACS-analyse, isolering af keratinocytter eller fremstilling af RNA, skrælle den komplette huden fra kroppen med en pincet til at fastsætte vævet og de stumpe spids saks til at skubbe væk torsoen. Til fremstilling af kryosnit eller hele underlag tager kun stykker af bagsiden hud.
- Hak rygskindet med en skalpel i 1-2 stykker på ca. 10 x 10 mm. Sætte brikkerne i en brønd i en 6-brønds plade med ~ 1 ml sterilt PBS. Sørg for, at den dermale side vender bunden.
- Erstat PBS med 1,5 ml dispase II (5 mg / ml PBS) og inkuberes i enten 30 minutter ved 37 ° C (for hele underlag) eller O / N ved 4 ° C. Vask 3 gange med PBS. Fjern forsigtigt epidermis som en intakt ark ved hjælp af en pincet til at fastsætte de underliggende dermis og de øvrige pincet til at løfte overhuden. Brug en kikkert til at gøre dette trin easy. Overfør epidermisarket i DMEM med sin basale side mod bunden. Brug arkene straks for infektion eksperimenter.
BEMÆRK: Brug udarbejdelsen af epidermis fra nyfødte hud hovedsageligt til FACS-analyse, isolering af keratinocytter eller udarbejdelse af RNA. På grund af sin skrøbelighed, fremstilling af inficerede plader til kryosnit eller hele underlag er mindre egnet.
- Fremstilling af epidermis fra voksne halehud for infektionsstudier
- Aflive musene i en alder fra 1 til 3 måneder ved cervikal dislokation. Tag hale i stedet for rygskind siden længe indlejrede hårsækkene på bagsiden hæmme separation af intakte epidermale ark. Skær halen fra ofrede mus og skar den på langs med en skalpel.
- Skrælle huden fra knoglen og hak det med en skalpel i stykker af ca. 5 x 5 mm. Sætte op til 4 stykker i en godt og fortsætte med inkubering i dispase II som beskrevet under 2.1.5
BEMÆRK: Brug voksne tail huden at forberede kryosnit eller hele underlag. Alternativt til øjeblikkelig brug, kan haler opbevares eller transporteres i ca. 24 timer ved 4 ° C uden at miste væsentlig infektionseffektivitet. Hvis haler holdes op til 48 timer, kunne epidermale ark være næppe inficeret med HSV-1.
- Dissociation af epidermis for FACS-analyse
BEMÆRK: Påvisning af overfladeprotein ekspression ved FACS-analyse kræver passende celledissociering teknikker, der ikke skader celleoverfladen og proteinet af interesse.- Inkuber nyfødte epidermale ark i en 6-brønds plade med den basale side på 1,5 ml / brønd rekombinant trypsin-baserede celledissocieringsopløsningen i 15 minutter ved stuetemperatur og i 15 minutter ved 37 ° C.
- Stop inkuberingen ved tilsætning af 3 ml DMEM. Dissociere keratinocytter ved hjælp af en buet fin pincet til forsigtigt at bevæge epidermis i 6-brønds plade, således at keratinocytterne bliver opløst. Saml cellesuspensionen og gentage dette trin 3 gangealtid bruger frisk DMEM.
BEMÆRK: Denne dissociation procedure er egnet til at detektere nectin-1 på overfladen af keratinocytter. - Alternativt inkuberes epidermale ark på enzymfri celledissocieringsopløsning (CDS) i 15 minutter ved stuetemperatur og 15 minutter ved 37 ° C. Inkuber yderligere 15 minutter ved stuetemperatur for at skylle forsigtigt ud keratinocytterne ved pipettering CDS op og ned.
- Saml cellesuspensionen og gentag rødmen trin 3 gange med friske DMEM.
BEMÆRK: Denne dissociation er egnet til at detektere overfladen udtryk for HVEM. Ulempen ved den CDS løsning er, at færre celler dissocieres end med rekombinant trypsin-baserede celledissocieringsopløsning. Ud over overfladeekspression kan nukleare eller cytoplasmatisk udtryk såsom ICP0 ekspression analyseres ved FACS efter dissociation af de inficerede epidermale ark med rekombinant trypsin-baserede celledissocieringsopløsning.
- Dissociation af epidermis at isolere keratinocytter eller extarmkanalen RNA
- Sæt nyfødte epidermisark i en 6-brønds plade med den basale side mod bunden af skålen, som indeholder 1,5 ml / brønd rekombinant trypsin-baserede celledissocieringsopløsning. Der inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur. Tilsæt 3 ml DMEM og dissociere keratinocytter ved hjælp af en buet fin pincet til forsigtigt at bevæge epidermis i skålen.
- Saml cellesuspensionen og gentage dette trin 3 gange med friske DMEM. Denne celle suspension bruge til at udtrække RNA eller til kultur primære murine keratinocytter.
3. Infektion af epidermisark med HSV-1
- Forbered en opløsning af HSV-1 vægt- stammen 17 11 i mindst 500 pi DMEM og erstatte mediet ved virus løsning, hvor epidermale ark er flydende. Denne gang er defineret som tiden 0 12. Udfør infektion af en epidermisarket i en brønd i en plade med 24 brønde ved 37 ° C. Beregningen af virustiteren er baseret på det skønnede antalaf celler i det basale lag pr epidermisarket (ca. 2 x 10 5 celler pr 5 x 5 mm plade).
- Inficeres med HSV-1 på ca. 100 plakdannende enheder (PFU) / celle og erstatte det virusholdige medium ved DMEM efter 1 time pi
BEMÆRK: I tilfælde af epidermale plader fra nyfødte hud, huske på, at ark begynder at tage afstand under inkubation.
4. Visualisering af inficerede celler
- Epidermal Hele Mounts 13
- Fix epidermale ark med 3,4% formaldehyd enten i 2 timer ved stuetemperatur eller O / N ved 4 ° C. Vask to gange med PBS og blokere med 0,5% mælkepulver, 0,25% gelatine fra koldt vand fiskeskind og 0,5% Triton X-100 i TBS i 1 time ved stuetemperatur 14.
- Inkubér pladerne O / N med muse-anti-ICP0 (monoklonalt antistof 11060) 15 fortyndet 1:60 i blokerende buffer ved stuetemperatur. At visualisere det mellemliggende trådnetværket inkuberes samtidigt med kanin polyklonalt anti-muse keratin 14 (100 ng / ml).
- Vask 4 til 5 gange med PBS-0,2% Tween 20 under 4 timer ved stuetemperatur. Inkuber O / N med AF488-konjugeret anti-muse-IgG (1 ug / ml), AF555-konjugeret anti-kanin IgG (1 ug / ml), og DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol) (100 ng / ml) i blokerende buffer ved stuetemperatur.
- Vask med PBS-0,2% Tween 20 i 4 timer ved stuetemperatur. Mount epidermale ark med deres basale side på toppen af en prøve dias, integrere i fluorescerende montering medium og dække med dækglas.
- Epidermal kryosnit
- Voksne epidermale ark blev fikseret i 4% formaldehyd i PBS i 20 minutter ved stuetemperatur og vasket 2 gange med PBS. Indlejre faste ark i væv frysning medium og fryse i flydende nitrogen. Skær 8-10 um sektioner med en cryomicrotome.
- Fastgør sektionerne igen med 0,5% formaldehyd i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur, vaskes 2 gange med PBS, blokeret med 5% normalt gedeserum og 0,2% Tween 20 i PBS i 30 minutter ved stuetemperatur, og derefter farves i 60 minutter med mOuse anti-ICP0 (monoklonalt antistof 11060) 15 fortyndet 1:60 i blokerende buffer, efterfulgt af 3 gange vask med blokeringsbuffer.
- Derefter inkuberes med AF488-konjugeret anti-muse-IgG (1 ug / ml) og DAPI (100 ng / ml) i blokerende buffer i 45 minutter ved stuetemperatur og vaskes 3 gange. Integrer sektioner i fluorescerende montering medium og dække med dækglas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Udfordringen for fremgangsmåden er at forberede epidermisark, hvori HSV-1 kan trænge fra det basale lag. Det kritiske trin er adskillelsen af epidermis fra dermis efter dispase II behandling, som, afhængigt af musestamme, skal tilpasses. Koncentrationen af dispase II kan variere fra 2.5 til 5 mg / ml, og inkubationstid 20-45 min. Farvningen af den mellemliggende filamentprotein keratin 14 let tillader forudsige, om det basale epidermal lag kan være inficeret, eller om det vil vise kun et meget begrænset antal inficerede celler (figur 2). Ideelt set bør keratin 14 farvning af epidermale hele underlag indikerer en intakt lag af basale celler (figur 2A). I værste fald, dispase II behandlingen afbrudt det basale lag, og der er ingen celler farvet i interfollicular epidermis indikerer, at keratin 14-udtrykkende basalkeratinocytter der dissocieres (figur 2B 16 (figur 2B) . Kun efter reduktion af dispase II til 2,5 mg / ml i 30 minutter blev et intakt basale lag opnået som visualiseret med keratin 14-farvning (figur 2C).
På grund af de tætte hårsækkene som vedhæng i epidermis, adskillelse af epidermis fra dermis er mest praktisk, når huden er taget fra haler af voksne mus. Alternativt kan bagsiden huden på nyfødte mus med udvikling af hårsækkene anvendes, selv skrøbelighed arkene efter inkubation begrænser størrelsen af analyserbare områder. Hidtil var der ingen forskel i effektiviteten af HSV-1-infektion bemærket alt efter om epidermis blev taget fra nyfødte eller voksne mus (figur 3). Hele mounts af newborn epidermis visualisere effektiv infektion af interfollicular epidermis samt af de tætpakkede celler foring udviklingslandene hårsækkene (figur 3). Mens interfollicular epidermis af voksent epidermis effektivt er inficeret, er hår bakterier og kun dele af de ydre rod hylstre af hårsækkene inficeret (figur 3). Talgkirtlerne nedenunder håret er altid farves, som imidlertid på grund af ikke-specifik farvning af det sekundære antistof, som vist i inficerede kontroller (figur 3).
Brug inhibitor studier undersøgte vi, om kolesterol spiller en rolle for HSV-1 indrejse i epidermis. Epidermisark af voksne mus blev forbehandlet med methyl-β-cyclodextrin (MβCD), der udtømmer cholesterol fra plasmamembranen 17-19. Før infektion blev MβCD fjernet ved flere vasketrin til at undgå nedbrydende virkning på cholesterol i det virale envelope. Ved forbehandling med 20 mM MβCD næsten ingen inficerede celler sås i enten interfollicular epidermis eller hår bakterier, men kun den ikke-specifikke farvning af talgkirtler var synlig (figur 4A). Som en kontrol, at vævet ikke blev beskadiget af inhibitor behandling, har vi tilføjet 500 ug / ml cholesterol at genopbygge MβCD-behandlede epidermisark (figur 4A). Denne behandling helt genoprettet infektivitet som viser, at forbehandling med inhibitoren ikke forstyrre vævets levedygtighed.
Brug musemodeller vi rettet inddragelse af nectin-1 og herpesvirus post mediator (HVEM) som cellulære receptorer for HSV-1 i overhuden 10. Begge proteiner er kendt for at virke som effektive receptorer for HSV i forskellige cellelinier 20,21, og de er tilstrækkelige for udvikling af sygdom i mus 22. Vi bestemt epidermis-specifikke roller nectin-1 og HVEM som HSV1-receptorer 10. Efter flydende epidermisark fra vildtype, nectin-1- eller HVEM-deficiente mus på virusholdige medium, blev hele underlag fremstillet på 3 timer pi at visualisere antallet af inficerede celler. Sammenligningen af interfollicular epidermises viser, at kun nectin-1-mangel drastisk reduceret antallet af ICP0-udtrykkende celler (figur 4B). Desuden viral spredning var temmelig begrænset i fravær af nectin-1 som vist i kryosektioner på 18 timer pi (Figur 4C). Til kvantificering af de inficerede celler, er det vigtigt at kontrollere, om antallet af inficerede celler er ligeligt fordelt på tværs af interfollicular epidermis eller om klynger af inficerede celler observeres. I nectin-1-deficiente epidermis for eksempel infektionseffektivitet varieret med ca. 10% infektion i nogle områder og ca. 30% i andre områder af interfollicular epidermis 10. Således besluttede vi to giver ingen numre af inficerede celler til at demonstrere faldet for infektion, men de nuværende hele mounts som kvalitative data.
Figur 1:. Visualisering af inficerede celler i epidermale sektioner eller hele mounts Klik her for at se en større version af dette tal.
Øverst er en skema, der illustrerer fuldstændige voksne hudprøver, epidermale sektioner efter adskillelsen fra dermis, og epidermale hele underlag med den synlige overflade af det basale keratinocytlag. Pilen peger på en hårsæk og stjernen angiver interfollicular epidermis. Hudprøver og epidermisark fremstillet ud fra 3 uger gamle mus blev inficeret med HSV-1 ved omtrent 100 PFU / celle og fastsat til 1,5 eller 3 timer pi Prøver blev stained med anti-ICP0 (grøn) efter mock-infektion eller ved 1,5 eller 3 timer pi at visualisere inficerede celler, og kontrastfarvning af kernerne med DAPI (blå) viser alle celler i de forskellige lag. Som en kontrol er på skrømt inficerede komplette hudprøver vist i sammenligning med inficerede prøver ved 3 timer pi demonstrerer nr ICP0 farvning (venstre del). På skrømt inficerede eller inficerede epidermale ark fremstillet som kryosektioner er vist i den midterste del. Epidermale hele underlag inficeret i 1,5 eller 3 timer er vist på højre side. Bar, 25 um (kryosnit) og 40 um (hele underlag).
Figur 2:. Keratin 14 farvning af epidermale hele underlag efter inkubation med forskellige koncentrationer af dispase II epidermis fra C57BL / 6 eller B6.A2G-Mx1 mus blev separeret fra dermis med dispase II. Epidermale hele underlag blev farvet med anti-keratin 14 (rød) og med DAPI (blå). Epidermisark blev inkuberet med 5 mg / ml (A, B) eller 2,5 mg / ml (C) dispase II i 30 minutter ved 37 ° C. Bar, 25 um. Forkortelser:. Hårsækken (HF), interfollicular epidermis (IFE), Talgkirtel (SG) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Visualisering af ICP0 udtryk i hele underlag af nyfødte eller voksne epidermis Ordninger illustrerer epidermale hele underlag med hårsække eller udviklingslande hårsækkene, der viser den synlige overflade af det basale lag fra voksne og nyfødte epidermises hhv. Epidermisark blev inficeret med HSV-1 ved omtrent 100 PFU / celle og hele underlag blev farvet medanti-ICP0 (grøn) og med DAPI (blå) ved 3 timer pi Som kontrol blev ikke-inficerede epidermale hele underlag fra voksne halehud kun farves med sekundært antistof viser den ikke-specifikke farvning af talgkirtler. Bar, 25 um. Forkortelser: udvikling af hårsækken (DHF), hårsækken (HF), interfollicular epidermis (IFE), Talgkirtel (SG). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Vurdering af virkningen af cellulære faktorer ved hjælp af enten hæmmeren MβCD eller nectin-1- eller HVEM-mangelfulde epidermises (A) epidermisark fra voksne hale huden på 3 uger gamle wt mus (C57BL / 6) blev forbehandlet med MβCD (20 mM) og inficeret med HSV-1 ved indbyrdesende 100 PFU / celle. Som kontrol blev ubehandlede epidermisark inficeret, og epidermisark forbehandlet med 35 mM MβCD blev behandlet med 500 ug / ml kolesterol før infektion. Epidermale hele underlag blev farvet med anti-ICP0 (grøn) og med DAPI (blå) ved 3 timer pi at påvise antallet af inficerede celler efter udtømning af kolesterol med MβCD behandling. Som vist i figur 3, farvning af talgkirtler (SG) er uspecifik. Forkortelser: HF (hårsækken), IFE (interfollicular epidermis), SG (talgkirtelaktivitet). Bar, 150 pm. (B) Voksen hale epidermises af vægt (C57BL / 6), nectin-1- 23, eller HVEM-deficiente mus 24 (1 måned gamle) blev inficeret ved ca. 100 PFU / celle. Epidermale hele underlag blev farvet med anti-ICP0 (grøn) og med DAPI (blå) ved 3 timer pi (C) snit af epidermale ark fra vægt (C57BL / 6) eller nectin-1-deficiente mus 23 blev farvet ved 18 timer pi ResÜLTS er vist i (B) og (C) er modificeret fra henvisningen 10. I A, B og C konfokale fremspring og fusionerede billeder vises. Bar, 150 um (A), og 25 um (B, C). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Når epidermale ark voksne hud fra C57BL / 6 er inficeret med HSV-1 ved omtrent 100 PFU / celle, observerer vi infektion i næsten alle celler i det basale lag i interfollicular epidermis, mens lavere doser virus korrelerer med mindre inficerede celler og en langsommere udvikling af infektion. Generelt hårsækkene viser et variabelt antal inficerede celler; mens de fleste af de ret små keratinocytter foring udviklingslandene hårsækkene er smittet, er det kun hår kim af den voksne hårsækken helt inficeret. Afhængigt af hvor blid adskillelse af epidermis ved dispase II behandlingen skrider frem, dele af hårsækkene gå tabt. I de fleste tilfælde er keratinocyt lag mellem talgkirtlerne og interfollicular epidermis mangler og laget foring de ydre kapper roden kan blive afbrudt. Under alle omstændigheder kan fremgangsmåden til separering af epidermis fra dermis og infektionseffektivitet variere fra en musestamme til en anden ( Tilsammen udfordringen med den ex vivo infektion analysen er udarbejdelse og vedligeholdelse af epidermale ark. Den skrøbelige væv kræver meget omhyggelig håndtering og styrer hvor godt vævet er bevaret efter adskillelse fra dermis. Et andet problem er den begrænsede levedygtighed af arkene i kultur. Da cellernes levedygtighed falder med tiden, bør infektion eksperimenter udføres straks eller senest 3 timer efter fremstilling af arkene. Ud over den murine hud, kan epidermisark også fremstilles fra humane hud eller slimhinde prøver. Afhængigt af arten og tykkelsen af epidermis, har dispase behandling, der skal tilpasses. For at følge forløbet af infektionen, er det mest hensigtsmæssigt at visualisere inficerede celler i kryosektioner. Man skal huske på, at med høj PFU / celle og længere tid på infektion, de epidermale ark starte en slags disintegration. Baseret på den cytopatiske virkning, cellerne runde op og celle-celle-kontakter bliver afbrudt. Ved 24 timers pi med 100 PFU / celle, kan nogle inficerede basale celler gå tabt, hvilket også kan afhænge af dispase II behandling. Med lavere PFU / celle, kan infektion gange udvides uden at føre til alvorlige vævsskader. Alternativt kunne omfanget af skader anvendes som markør for, hvordan patogene forskellige virusstammer er. Vi foretrækker at visualisere inficerede celler ved farvning ICP0 ekspression. Fordelen er en ganske tidlig påvisning af inficerede celler, og baseret på ICP0 farvningsmønster, kan skelnes celler på et tidligt tidspunkt under infektion fra dem på et fremskredent stadium. Alternativt kan inficerede celler visualiseres ved farvning ekspression af andre tidlige gener, såsom det virale capsidprotein VP5 og virale kappeprotein gD. Vi forsøgte også at visualisere indkommende viruspartikler før viral genekspression enten ved inffdeling med GFP-mærkede HSV-1 eller ved farvning capsider i faste prøver. Ifølge vores erfaring, mønstret for GFP-fluorescens eller farvningsmønstret i vævssnit er for komplekse til viser klart tilstedeværelsen af internaliserede viruspartikler. Alternativt kan viruspartikler visualiseres ved elektronmikroskopi, når høje virustitere af ~ 1000 - anvendes 1.500 PFU / celle. I tilfælde af lavere virus dosis, kan viruspartikler næsten ikke detekteres. I stedet for at visualisere inficerede celler i intakte epidermisark, kan epidermis dissocieres til at analysere RNA-niveauer eller kvantificere antallet af celler med overfladen, cytoplasmatisk eller nukleær ekspression af gener af interesse ved FACS-analyse. Vi antager, at denne ex vivo infektion protokol kan tilpasses det mindste for de vira, der vides at inficere basale keratinocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker Peter Staeheli for at levere B6.A2G-MX1 mus og Semra Ozcelik for teknisk rådgivning.
Dette arbejde blev støttet af den tyske Research Foundation gennem SFB829 og KN536 / 16, og Köln Fortune Program / Faculty of Medicine, University of Köln.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/high glucose/GlutaMAX | Life Technologies | 31966047 | needed for cultivation of epidermal sheets |
| dispase II powder | Roche | 4942078001 | has to be solved in heated PBS |
| enzyme-free cell dissociation solution | Sigma | C5914 | needed for very gentle dissociation of epidermal sheets |
| TrypLE select cell dissociation solution | Life Technologies | 12563-029 | needed for dissociation of epidermal sheets |
| chelex 100 resin | Bio-Rad | 142-2832 | needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum |
| gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7765 | needed for minimization of non-specific antibody binding |
| Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml) | Covance | PRB-155P | used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis |
| Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml) | Life Technologies | A-11029 | used as secondary antibodies |
| Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml) | Life Technologies | A-21429 | used as secondary antibodies |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride) (conc.: 0.1 mg/ml) | Sigma | 36670 | used to counterstain the nucleus |
References
- Koelle, D. M., Corey, L. Herpes simplex: insights on pathogenesis and possible vaccines. Annu. Rev. Med. 59, 381-395 (2013).
- Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J. Herpes simplex Viruses. Fields Virology. , 6th edition, 1823-1897 (2013).
- Syrjänen, S., Mikola, H., Nykänen, M., Hukkanen, V. In vitro establishment of lytic and nonproductive infection by herpes simplex virus type 1 in three-dimensional keratinocyte culture. J. Virol. 70, 6524-6528 (1996).
- Visalli, R. J., Courtney, R. J., Meyers, C. Infection and replication of herpes simplex virus type 1 in an organotypic epithelial culture system. Virology. 230, 236-243 (1997).
- Hukkanen, V., Mikola, H., Nykänen, M., Syrjänen, S. Herpes simplex virus type 1 infection has two separate modes of spread in three-dimensional keratinocyte culture. J. Gen. Virol. 80, 2149-2155 (1999).
- Gescher, K., et al. Inhibition of viral adsorption and penetration by an aqueous extract from Rhododendron ferrugineum L. as antiviral principle against herpes simplex virus type-1. Antiviral Res. 82, 408-413 (2010).
- Petermann, P., Haase, I., Knebel-Mörsdorf, D. Impact of Rac1 and Cdc42 signaling during early herpes simplex virus type 1 infection of keratinocytes. J. Virol. 83, 9759-9772 (2009).
- Everett, R. D., Maul, G. G. HSV-1 IE protein Vmw110 causes redistribution of PML. EMBO J. 13, 5062-5069 (1994).
- Chrostek, A., et al. Rac1 is crucial for hair follicle integrity but is not essential for maintenance of the epidermis. Mol. Cell. Biol. 26, 6957-6970 (2006).
- Petermann, P., et al. Entry mechanisms of Herpes Simplex Virus Type 1 into murine epidermis: Involvement of nectin-1 and HVEM as cellular receptors. J. Virol. 89, 262-274 (2015).
- McGeoch, D. J., et al. The complete DNA sequence of the long unique region in the genome of herpes simplex virus type 1. J. Gen. Virol. 69, 1531-1574 (1988).
- Schelhaas, M., Jansen, M., Haase, I., Knebel-Mörsdorf, D. Herpes simplex virus type 1 exhibits a tropism for basal entry in polarized epithelial cells. J. Gen. Virol. 84, 2473-2484 (2003).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130, 5241-5255 (2003).
- Rahn, E., Petermann, P., Hsu, M. J., Rixon, F. J., Knebel-Mörsdorf, D. Entry pathways of herpes simplex virus type 1 into human keratinocytes are dynamin- and cholesterol-dependent. PLoS One. 6, e25464 (2011).
- Everett, R. D., Cross, A., Orr, A. A truncated form of herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 is expressed in a cell type dependent manner. Virology. 197, 751-756 (1993).
- Horisberger, M. A., Staeheli, P., Haller, O. Interferon induces a unique protein in mouse cells bearing a gene for resistance to influenza virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 1910-1914 (1983).
- Christian, A. E., Haynes, M. P., Phillips, M. C. Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. J. Lipid Res. 38, 2264-2272 (1997).
- Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. Effects of cholesterol depletion by cyclodextrin on the sphingolipid microdomains of the plasma membrane. Biochem. J. 335, 433-440 (1998).
- Yancey, P. G., et al. Cellular cholesterol efflux mediated by cyclodextrins: Demonstration of kinetic pools and mechanism of efflux. J. Biol. Chem. 271, 16026-16034 (1996).
- Montgomery, R. I., Warner, M. S., Lum, B. J., Spear, P. G. Herpes simplex virus-1 entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family. Cell. 87, 427-436 (1996).
- Geraghty, R. J., Krummenacher, C., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Spear, P. G. Entry of alphaherpesviruses mediated by poliovirus receptor-related protein 1 and poliovirus receptor. Science. 280, 1618-1620 (1998).
- Taylor, J. M., Lin, E., Susmarski, N., Yoon, M., Zago, A., Ware, C. F., Pfeffer, K., Miyoshi, J., Takai, Y., Spear, P. G. Alternative entry receptors for herpes simplex virus and their roles in disease. Cell Host Microbe. 2, 19-28 (2007).
- Barron, M. J., Brookes, S. J., Draper, C. E., Garrod, D., Kirkham, J., Shore, R. C. The cell adhesion molecule nectin-1 is critical for normal enamel formation in mice. Hum. Mol. Genet. 17, 3509-3520 (2008).
- Wang, Y., Subudhi, S. K., Anders, R. A., Lo, J., Sun, Y., Blink, S., Wang, Y., Liu, X., Mink, K., Degrandi, D., Pfeffer, K., Fu, Y. X. The role of herpesvirus entry mediator as a negative regulator of T cell-mediated responses. J. Clin. Invest. 115, 711-717 (2005).
