Abstract
Pour entrer dans son hôte humain, le type de virus de l'herpès simplex de type 1 (HSV-1) doit surmonter la barrière de la muqueuse des surfaces, la peau ou cornée. HSV-1 cibles kératinocytes au cours de l'entrée initiale et établit une infection primaire dans l'épithélium, qui est suivie par une infection latente de neurones. Après la réactivation, les virus peuvent devenir évident dans les établissements cutanéo-muqueuses qui apparaissent sous forme de vésicules cutanées ou des ulcères des muqueuses. Comment HSV-1 envahit peau ou les muqueuses et atteint ses récepteurs est mal comprise. Pour enquêter sur la route d'invasion du HSV-1 dans le tissu épidermique au niveau cellulaire, nous avons établi un modèle ex vivo de l'infection de l'épiderme murins, qui représente le site de l'infection primaire et récurrent dans la peau. L'essai comprend la préparation de la peau de souris. L'épiderme est séparé du derme par traitement dispase II. Après flottant feuilles épidermiques sur un milieu contenant le virus, le tissu est fixe et l'infection peut être visualisée à différents moments après l'infection parla coloration des cellules infectées avec un anticorps contre le HSV-1 précoce immédiat de protéine ICP0. ICP0 cellules exprimant peut être observé dans la couche basale de kératinocytes déjà à 1,5 heures après l'infection. Avec de plus longs temps d'infection, les cellules infectées sont détectés dans les couches suprabasales, ce qui indique que l'infection ne se limite pas aux kératinocytes basaux, mais le virus se propage à d'autres couches dans le tissu. Utilisation de feuilles épidermiques de différents modèles de souris, le protocole d'infection permet de déterminer l'implication des constituants cellulaires qui contribuent à l'invasion de HSV-1 dans le tissu. En outre, le dosage est adapté pour tester des inhibiteurs dans les tissus qui interfèrent avec les étapes initiales d'entrée, la propagation de cellule à cellule et la production de virus. Ici, nous décrivons l'ex vivo protocole d'infection en détail et présentons nos résultats en utilisant des souris de Nectin-1- ou HVEM déficient.
Introduction
Herpes simplex virus (HSV) peut provoquer une série de maladies chez l'homme des lésions cutanéo-muqueuses de simples doux aux infections mortelles. HSV de type 1 (HSV-1) est dominante associée à des infections oro-faciales et l'encéphalite, tandis que le HSV de type 2 (HSV-2) provoque plus susceptibles infections génitales 1. Bien qu'il y ait des progrès significatifs dans la compréhension comment HSV pénètre dans les cellules en culture, déclenche l'infection et produit descendance virale, nous savons peu de choses sur la voie d'invasion virale (s) dans les tissus au niveau cellulaire 2. Pour les études de HSV peau ou des infections des muqueuses, les souris, les lapins et les cochons d'Inde ont été utilisés comme modèles animaux. Infection de la peau a été établie par une injection intradermique ou par grattage de la peau en la présence du virus, et développement de la maladie a été corrélée avec la production de virus. Ces méthodes ont permis de comprendre les différents aspects de la pathogenèse de la maladie, et sont utilisés pour évaluer les médicaments antiviraux. Pour étudier l'infection HSV au tissue niveau, les modèles organotypiques de peau humaine ont été appliquées. Comme le taux d'infection est limité dans ces cultures en radeau, seul un nombre limité d'études portant sur l'infection, la propagation virale et les effets des composants antiviraux ont été publiées 3-6.
Afin de caractériser les déterminants cellulaires qui jouent un rôle lors de HSV-1 infection dans l'épithélium intact, nous avons établi un protocole pour les ex vivo des études d'infection de l'épiderme murins 7. Peau été préparé à partir des nouveau-nés ou des queues de souris adultes. Depuis HSV-1 n'a pas pu infecter des échantillons de peau qui ont été effectués, dans un milieu submergées contenant le virus, nous avons séparé l'épiderme du derme par la dispase II traitement. Après flottant des feuilles épidermiques sur un milieu contenant le virus, les cellules infectées peuvent être visualisés dans la couche épidermique de base à différents moments après l'infection (pi) 7. Pour visualiser le début de l'infection dans des cellules individuelles avant une réplication viralend production de virus, nous avons coloré avec un anticorps dirigé contre la protéine de cellule infectée 0 (ICP0), qui est l'une des premières protéines exprimées au cours de l'infection par HSV-1. La localisation cellulaire de ICP0 passe par des phases distinctes lors d'une infection précoce. Bien que ICP0 est présent dans des foyers nucléaires pendant un stade précoce de l'expression virale de gènes, de relocalisation ICP0 vers le cytoplasme indique une phase ultérieure de l'infection 8.
Nous avons utilisé le test infection ex vivo de feuilles épidermiques à partir de différents modèles de souris pour tester le rôle potentiel de divers facteurs cellulaires lors de l'infection. Pour faire face à l'impact de Rac1 comme un régulateur clé de la dynamique de l'actine, nous avons infecté des souris de l'épiderme avec une deletion spécifique de kératinocyte du gène 9 Rac1. Ce modèle nous a permis d'étudier les conséquences de Rac1 déficiente sur l'efficacité du HSV-1 chez les couches de kératinocytes épidermiques. La comparaison de l'épiderme infectées de la même portée de contrôle rémis au jour de pas de différence significative, ce qui indique que l'absence de Rac1 n'a eu aucun effet sur l'initiation de l'infection dans la couche basale de l'épiderme 7. L'utilisation de modèles supplémentaires de souris nous a permis d'aborder des récepteurs cellulaires qui médiatisent l'entrée dans l'épiderme. Infecter les feuilles épidermiques à partir de soit nectin-1 ou des souris déficientes en HVEM avec HSV-1 a révélé que la première entrée du virus dans les tissus dépend fortement de la présence d'une 10-nectine. De plus, nos résultats démontrent que HVEM peut également servir de récepteur dans l'épiderme de souris, bien que moins efficacement que nectin-1 10.
Pour répondre à la répartition spatiale des cellules infectées dans les couches épidermiques, on visualise de ICP0 expression dans des coupes de tissus épidermiques et montures entières (figure 1). Dans cryocoupes de peau complet, pas de cellules exprimant ICP0 sont détectés (figure 1). En revanche, les cryosections de feuilles épidermiques démontrent cytoplasmiqueICP0 expression dans la couche basale déjà à trois heures pi (Figure 1). Au temps plus tard, la propagation virale à suprabasale couches peuvent être visualisés. La répartition spatiale des cellules infectées dans la couche basale peut être facilement suivie dans épidermiques montures entières (Figure 1). Lors de l'infection par le HSV-1 à 100 PFU / cellule, environ 50% des kératinocytes basales de l'épiderme interfolliculaires montrer expression ICP0 à 1,5 h pi A ce point de temps la plupart des cellules infectées expriment ICP0 nucléaire. La relocalisation de ICP0 vers le cytoplasme indiquant un stade ultérieur de l'expression du gène précoce est présente dans presque toutes les cellules à 3 h pi (Figure 1). Ces modes de visualisation de cellules infectées ex vivo sur HSV-1 infection fournissent un test puissant pour étudier l'effet des inhibiteurs ou des composants cellulaires mutées supprimés / sur l'entrée virale et la propagation dans le tissu.
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Protocol
Déclaration éthique.
La préparation de feuilles épidermiques à partir d'animaux sacrifiés est effectuée en stricte conformité avec les recommandations du Guide de Landesamt für Natur, Umwelt et Verbraucherschutz, Rhénanie du Nord-Westphalie (Allemagne). L'étude a été approuvée par LANUV NRW (Nombre 8.84-02.05.20.13.018).
1. Préparation d'instruments et Culture Media
- Cultiver feuilles épidermiques dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) / glucose élevé dipeptide contenant de la glutamine, 10% de FCS, 100 UI / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine (ci-après dénommé "DMEM").
- Pour la préparation de feuilles épidermiques, dissoudre soigneusement dispase II poudre (5 mg / ml) dans du PBS chauffé (jusqu'à 37 ° C). Filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 um et l'utiliser directement pour le traitement.
- Pour la préparation de l'épiderme tout montures 13, préparer blocage chamoiser avec du lait en poudre 0,5%, 0,25% de gélatine à partir de peau de poisson d'eau froide et de 0,5% de Triton X-100 dans du TBS. Permettre aux substances à dissoudre par l'incubation du mélange pendant au moins 2 heures à température ambiante sur un mélangeur rotatif. Préparer également 0,2% de Tween 20 dans du PBS comme tampon de lavage. Pour la fixation, la préparation de 3,4% et 4% de formaldehyde dans du PBS.
- Pour l'immunocoloration de cryosections, préparer le tampon de blocage avec 5% de sérum de chèvre normal et 0,2% de Tween 20 dans du PBS. Pour la fixation, préparer 0,5% de formaldéhyde dans du PBS.
2. Préparation des feuilles de épidermiques de la peau murine
- Préparation de l'épiderme de la peau du nouveau-né de retour pour des études d'infection
- Placez une souris décapitée (1 à 3 jours après la naissance) dans un plat de dissection et couper les extrémités et la queue près du torse pour permettre une élimination efficace de la peau du torse complet. Lors de la dépose des extrémités, essayez de garder les coupes aussi faible que possible de diamètre.
- Fixer le torse avec une pince fine une courbend déplacez doucement ciseaux à embout arrondi sous la peau du crâne caudal le long du dos de séparer la peau du torse. Fendez la peau le long du dos.
- Pour l'analyse FACS, l'isolement des kératinocytes ou la préparation de l'ARN, décoller la peau complète du torse en utilisant une pince pour fixer le tissu et les ciseaux à embout arrondi pour pousser le torse. Pour la préparation de cryocoupes ou montures entières ne prendre que des morceaux de la peau du dos.
- Hacher la peau du dos avec un scalpel dans 1-2 pièces d'environ 10 x 10 mm. Mettez les morceaux dans un puits d'une plaque à 6 puits avec ~ 1 ml de PBS stérile. Assurez-vous que le côté dermique face au fond.
- Remplacer PBS par 1,5 ml dispase II (5 mg / ml de PBS) et incuber pendant soit 30 min à 37 ° C (pour les montages entiers) ou O / N à 4 ° C. Laver 3 fois avec du PBS. Retirez délicatement l'épiderme comme une feuille intacte en utilisant une pince pour fixer les derme sous-jacent et les autres pince pour soulever l'épiderme. Utilisez une paire de jumelles pour faire de cette étape EASy. Transférer la feuille épidermique dans du DMEM avec sa face basale vers le bas. Utilisez les feuilles immédiatement pour des expériences d'infection.
REMARQUE: Utilisez la préparation de l'épiderme de la peau du nouveau-né principalement pour l'analyse FACS, l'isolement des kératinocytes ou la préparation de l'ARN. En raison de sa fragilité, la préparation de feuilles infectées pour cryocoupes ou montures entières est moins approprié.
- Préparation de l'épiderme de la peau adulte de queue pour des études d'infection
- Euthanasier les souris à l'âge de 1 à 3 mois par dislocation cervicale. Prenez la queue à la place de la peau en arrière depuis les follicules pileux à long embarqués sur le dos entravent séparation des feuilles épidermiques intactes. Coupez la queue de souris sacrifiées et fente en longueur avec un scalpel.
- Décoller la peau de l'os et le hacher avec un scalpel en morceaux d'environ 5 x 5 mm. Mettez jusqu'à 4 pièces dans un puits et procéder à l'incubation dans dispase II tel que décrit à la section 2.1.5
REMARQUE: Utilisez tai adultel peau pour préparer cryocoupes ou montures entières. Alternativement à l'utilisation immédiate, les queues peuvent être stockés ou transportés pendant environ 24 heures à 4 ° C sans perte d'efficacité de l'infection importante. Si les queues sont tenus à 48 h, feuilles épidermiques pourraient difficilement être infectées par le HSV-1.
- La dissociation de l'épiderme pour une analyse FACS
REMARQUE: La détection de l'expression de protéine de surface par analyse FACS nécessite des techniques de dissociation de cellules appropriées qui ne nuisent pas à la surface de la cellule et la protéine d'intérêt.- Incuber feuilles épidermiques nouveau-nés dans une plaque à 6 puits avec la partie basale de 1,5 ml / solution de dissociation cellulaire bien recombinant basé trypsine pendant 15 min à température ambiante et pendant 15 minutes à 37 ° C.
- Arrêtez l'incubation en ajoutant 3 ml de DMEM. Dissocier les kératinocytes en utilisant une pince fine courbes se déplacer doucement l'épiderme dans la plaque de 6 puits de sorte que les kératinocytes se dissout. Recueillir la suspension cellulaire et répétez cette étape 3 foisen utilisant toujours DMEM frais.
Remarque: Cette procédure de dissociation est approprié pour détecter nectin-1 sur la surface des kératinocytes. - En variante, incuber les feuilles épidermiques sur une solution de dissociation cellulaire sans enzyme (CDS) pendant 15 min à la température ambiante et 15 min à 37 ° C. Incuber un autre 15 minutes à température ambiante pour rincer délicatement les kératinocytes par pipetage CDS haut et en bas.
- Recueillir la suspension cellulaire et répétez l'étape de rinçage 3 fois avec des ingrédients frais DMEM.
REMARQUE: Cette dissociation est adapté pour détecter l'expression de surface de HVEM. L'inconvénient de la solution de la CDS est que moins de cellules sont dissociées avec une solution de dissociation cellulaire basé trypsine recombinante. En plus de l'expression de surface, l'expression cytoplasmique ou nucléaire telle que ICP0 expression peut être analysée par FACS après dissociation des feuilles infectées avec épidermiques solution de dissociation cellulaire à base de trypsine recombinante.
- La dissociation de l'épiderme pour isoler les kératinocytes ou exARN tractus
- Mettre feuilles épidermiques nouveau-nés dans une plaque à 6 puits avec la face basale vers le fond de la boîte qui contient de 1,5 ml / solution de dissociation cellulaire à base de trypsine et recombinant. Incuber pendant 30 min à température ambiante. Ajouter 3 ml de DMEM et de dissocier les kératinocytes en utilisant une pince fine courbes se déplacer doucement l'épiderme dans le plat.
- Recueillir la suspension cellulaire et répétez cette étape 3 fois avec des ingrédients frais DMEM. Utiliser cette suspension de cellules à extraire l'ARN ou à la culture des kératinocytes primaires murins.
3. L'infection des feuilles épidermiques avec HSV-1
- Préparer une solution de souche HSV-1 17 en poids de 11 à au moins 500 ul de DMEM et remplacer le milieu par la solution de virus à laquelle les feuilles épidermiques sont flottantes. Ce point de temps est défini comme le temps 0 12. Effectuer l'infection d'une feuille épidermique dans un puits d'une plaque de 24 puits à 37 ° C. Le calcul du titre de virus est basé sur le nombre estiméde cellules dans la couche basale de l'épiderme par feuille (environ 2 x 10 5 cellules par feuille 5 x 5 mm).
- Infect avec HSV-1 à environ 100 unités formant des plages (PFU) / cellule et remplacer le milieu contenant le virus par du milieu DMEM à 1 h pi
NOTE: En cas de feuilles épidermiques de la peau du nouveau-né, gardez à l'esprit que les feuilles commencent à se dissocier pendant l'incubation.
4. Visualisation des cellules infectées
- Épidermique entier Mounts 13
- Fixer feuilles épidermiques avec 3,4% de formaldéhyde, soit pendant 2 heures à la température ambiante ou O / N à 4 ° C. Laver deux fois avec du PBS et bloquer avec du lait en poudre 0,5%, 0,25% de gélatine à partir de peau de poisson d'eau froide et de 0,5% de Triton X-100 dans du TBS pendant 1 heure à température ambiante 14.
- Incuber les feuilles O / N avec la souris anti-ICP0 (anticorps monoclonal 11060) 15 dilué 1:60 dans un tampon de blocage à la température ambiante. Pour visualiser le réseau de filaments intermédiaires incuber simultanément avec polyclonaux de lapin anti-kératine souris 14 (100 ng / ml).
- Laver 4 à 5 fois avec du PBS-0,2% de Tween 20 pendant 4 heures à température ambiante. Incuber O / N avec AF488 conjugué anti-IgG de souris (1 ug / ml), anti-IgG de lapin de AF555-conjugué (1 ug / ml), et le DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole) (100 ng / ml) dans du tampon de blocage à température ambiante.
- Laver avec du PBS-0,2% de Tween 20 pendant 4 heures à température ambiante. Monter épidermiques feuilles avec leur côté basale sur une lame d'échantillon, intégrer dans un milieu de montage fluorescent et couvrent avec des lamelles.
- Épidermique cryosections
- Feuilles épidermiques adultes ont été fixées dans du formaldehyde à 4% dans du PBS pendant 20 min à température ambiante et on les lave 2 fois avec du PBS. Feuilles fixes Intégrer dans le tissu milieu de congélation et de gel dans de l'azote liquide. Couper 8-10 um sections avec un cryomicrotome.
- Fixer les sections à nouveau avec 0,5% de formaldehyde dans du PBS pendant 10 min à température ambiante, laver 2 fois avec du PBS, bloc avec 5% de sérum de chèvre normal et 0,2% de Tween 20 dans du PBS pendant 30 min à température ambiante, puis la coloration pendant 60 min avec mouse anti-ICP0 (anticorps monoclonal 11060) 15 dilué 1:60 dans du tampon de blocage, puis 3 fois avec le tampon de lavage de blocage.
- Puis incuber avec AF488 conjugué IgG anti-souris (1 pg / ml) et DAPI (100 ng / ml) dans du tampon de blocage pendant 45 min à température ambiante et laver 3 fois. Incluez sections en milieu de montage fluorescent et couvrir avec des lamelles.
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Representative Results
La difficulté de la méthode consiste à préparer des feuilles épidermiques dans lequel HSV-1 peut pénétrer à partir de la couche basale. L'étape critique est la séparation de l'épiderme du derme par traitement dispase II, qui, en fonction de la souche de souris, doit être adaptée. La concentration de dispase II peut varier de 2,5 à 5 mg / ml, et le temps d'incubation de 20 à 45 min. La coloration du filament intermédiaire protéines de kératine 14 permet facilement prédire si la couche basale de l'épiderme peut être infecté ou si elle va montrer qu'un nombre très limité de cellules infectées (Figure 2). Idéalement, la kératine 14 coloration de l'épiderme montures entières devrait indiquer une couche intacte de cellules basales (figure 2A). Dans le pire des cas, le traitement dispase II perturbé la couche basale et il n'y a pas de cellules colorées dans l'épiderme interfolliculaires indiquant que la kératine 14 exprimant kératinocytes basales sont dissociées (figure 2B 16 (figure 2B) . Seulement après réduction de dispase II à 2,5 mg / ml pendant 30 min, une couche basale intact a été obtenu comme visualisé par coloration kératine 14 (figure 2C).
En raison des follicules pileux denses que les appendices de l'épiderme, la séparation de l'épiderme du derme est plus commode lorsque la peau est tirée de la queue des souris adultes. Alternativement, le dos peau de souris nouveau-né avec le développement de follicules pileux peut être utilisé, bien que la fragilité des feuilles après incubation limite la taille des zones analysables. Jusqu'à présent, aucune différence dans l'efficacité de l'infection par le HSV-1 a été constaté, selon que l'épiderme a été prise à partir de souris nouveau-nés ou les adultes (figure 3). Montures entières de newboépiderme rn visualiser infection efficace de l'épiderme interfolliculaires ainsi que des cellules denses qui bordent les follicules pileux en développement (Figure 3). Alors que l'épiderme interfolliculaires de l'épiderme adultes infectés est efficace, les germes de cheveux et seules des parties des gaines des racines extérieures de follicules pileux sont infectées (Figure 3). Les glandes sébacées en dessous de la tige du cheveu sont toujours colorées, ce qui est, toutefois, en raison de la coloration non-spécifique de l'anticorps secondaire comme représenté sur la témoins non infectés (figure 3).
Utilisation inhibiteurs études que nous avons étudié, que le cholestérol joue un rôle pour le HSV-1 entrée dans l'épiderme. Feuilles épidermiques de souris adultes ont été prétraitées avec du méthyl-β-cyclodextrine (MβCD), qui épuise le cholestérol de la membrane de plasma de 17 à 19. Avant l'infection, MβCD a été éliminé par plusieurs étapes de lavage pour éviter tout effet d'appauvrissement de cholestérol dans le Envel viraleOPE. Lors de pré-traitement avec 20 mM MβCD presque pas de cellules infectées ont été observés dans l'épiderme interfolliculaire soit des germes ou des cheveux, mais seulement la coloration non spécifique des glandes sébacées est visible (figure 4A). A titre de témoin que le tissu n'a pas été endommagé par un traitement inhibiteur, on a ajouté 500 ug / ml de cholestérol pour reconstituer les feuilles épidermiques MβCD-traités (figure 4A). Ce traitement entièrement restauré infectivité démontrant que le prétraitement avec l'inhibiteur n'a pas interféré avec la viabilité du tissu.
En utilisant des modèles de souris nous avons abordé l'implication des nectin-1 et l'entrée de l'herpèsvirus médiateur (HVEM) que les récepteurs cellulaires pour le HSV-1 dans l'épiderme 10. Les deux protéines sont connus pour agir comme des récepteurs pour le HSV efficaces dans diverses lignées de cellules 20,21, et elles sont suffisantes pour le développement de la maladie chez les souris 22. Nous avons déterminé les rôles spécifiques à l'épiderme de nectin-1 et HSV comme HVEM1 10 récepteurs. Après flottant feuilles épidermiques de type sauvage, nectin-1 ou HVEM sur des souris déficientes en milieu contenant le virus, montures entières ont été préparées à 3 heures pi de visualiser le nombre de cellules infectées. La comparaison des épidermes interfolliculaires indique que seule une carence nectine-considérablement réduit le nombre de cellules exprimant ICP0 (figure 4B). En outre, la propagation virale était plutôt limitée en l'absence de nectin-1 comme indiqué dans cryocoupes à 18 h pi (Figure 4C). Pour la quantification des cellules infectées, il est important de vérifier si le nombre de cellules infectées est également répartie à travers l'épiderme interfolliculaire ou si des grappes de cellules infectées sont observées. Dans épiderme Nectin-1-deficient par exemple, l'efficacité d'infection modifié à environ 10% de l'infection dans certaines zones et environ 30% dans les autres zones de l'épiderme interfolliculaire 10. Ainsi, nous avons décidé to donner aucun nombre de cellules infectées afin de démontrer la diminution de l'infection, mais présents montures entières que des données qualitatives.
Figure 1:. Visualisation des cellules infectées dans les sections épidermiques ou montures entières S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Au sommet se trouve un schéma illustrant des échantillons complets de la peau des adultes, sections épidermiques après la séparation du derme et l'épiderme montures entières avec la surface visible de la couche basale de kératinocytes. Les points de flèche à un follicule pileux et l'étoile indique l'épiderme interfolliculaires. Des échantillons de peau et de feuilles épidermiques préparées à partir de souris âgées de 3 semaines ont été infectées par le HSV-1 à environ 100 PFU / cellule et fixés à 1,5 ou 3 échantillons h pi étaient de StaineD avec anti-ICP0 (vert) après maquette infection ou à 1,5 ou 3 h pi de visualiser les cellules infectées, et contre-coloration des noyaux au DAPI (bleu) démontre toutes les cellules dans les différentes couches. Comme contrôle, des échantillons de peau complets pseudo-infectées sont présentés en comparaison à des échantillons infectés à 3 h pi démontrant aucune coloration de ICP0 (partie gauche). Feuilles épidermiques maquette infectés ou infectés préparés comme cryocoupes sont présentés dans la partie médiane. Épidermiques montures entières infectées pour 1,5 ou 3 heures sont indiquées sur la partie droite. Bar, 25 pm (cryocoupes), et 40 um (montures entières).
Figure 2:. Kératine 14 coloration de l'épiderme montages entiers après incubation avec différentes concentrations de dispase II épiderme de souris C57BL / 6 ou des souris B6.A2G-MX1 a été séparé de derme avec dispase II. Épidermiques montures entières ont été colorées avec anti-Keratin 14 (rouge) et avec du DAPI (bleu). Feuilles épidermiques ont été incubées avec 5 mg / ml (A, B) ou 2,5 mg / ml (C) dispase II pendant 30 min à 37 ° C. Bar, 25 um. Abréviations:. Follicule pileux (HF), l'épiderme interfolliculaires (IFE), glande sébacée (SG) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Visualisation de l'expression ICP0 dans les montagnes entières de l'épiderme nouveau-nés ou adultes schémas illustrant épidermiques montures entières à des follicules pileux ou développement des follicules pileux, montrant la surface visible de la couche basale de l'adulte et nouveau-nés épidermes, respectivement. Feuilles épidermiques ont été infectées par le HSV-1 à environ 100 PFU / cellule et montures entières ont été colorées avecanti-ICP0 (vert) et avec du DAPI (bleu) à 3 h pi Comme un contrôle, non infectées épidermiques entiers montures de peau de la queue des adultes ont été colorées uniquement avec anticorps secondaire démontrant la coloration non spécifique des glandes sébacées. Bar, 25 um. Abréviations: développer follicule pileux (DHF), follicule pileux (HF), l'épiderme interfolliculaires (IFE), glande sébacée (SG). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4:. Evaluer l'impact des facteurs cellulaires en utilisant soit le MβCD inhibiteur ou nectin-1- ou épidermes HVEM déficientes (A) épidermiques feuilles de queue adulte peau du 3 semaine vieilles souris WT (C57BL / 6) ont été prétraités avec MβCD (20 mM) et infectées par le HSV-1 à environ 100 PFU / cellule. A titre de témoin, des feuilles épidermiques ont été infectées non traitées, et les feuilles épidermiques prétraités avec 35 mM MβCD ont été traités avec 500 pg / ml de cholestérol avant l'infection. Épidermiques montures entières ont été colorées avec anti-ICP0 (vert) et avec du DAPI (bleu) à 3 h pi pour démontrer le nombre de cellules infectées après l'épuisement du cholestérol par traitement MβCD. Comme le montre la Figure 3, la coloration des glandes sébacées (SG) est non spécifique. Abréviations: HF (du follicule pileux), IFE (épiderme interfolliculaires), SG (de glande sébacée). Bar, 150 um. (B) de queue des adultes épidermes de poids (C57BL / 6), nectin-1- 23, ou HVEM-souris déficientes 24 (1 month-old) ont été infectées à environ 100 PFU / cellule. Épidermiques montures entières ont été colorées avec anti-ICP0 (vert) et avec du DAPI (bleu) à 3 h pi (C) cryosections de feuilles épidermiques de poids (C57BL / 6) ou nectin-1-souris déficientes 23 ont été colorées à 18 h pi ResULTS indiquées dans (B) et (C) sont modifiés de la référence 10. En A, B et C projections confocale et fusionnées images sont affichées. Bar, 150 um (A), et 25 um (B, C). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Lorsque des feuilles épidermiques de la peau des adultes à partir de souris C57BL / 6 sont infectées par le HSV-1 à environ 100 PFU / cellule, on observe infection dans presque toutes les cellules de la couche basale de l'épiderme interfolliculaire tandis que des doses de virus plus bas en corrélation avec les cellules moins infectée, et une plus lente progression de l'infection. En général, les follicules pileux présentent un nombre variable de cellules infectées; alors que la plupart des petits plutôt kératinocytes qui tapissent les follicules pileux en développement sont infectés, seulement le germe de cheveux de la follicule pileux adulte est complètement infecté. Selon la façon dont la séparation en douceur de l'épiderme par traitement dispase II produit, parties des follicules pileux se perdre. Dans la plupart des cas, les couches de kératinocytes entre les glandes sébacées et l'épiderme interfolliculaires sont absents et la couche qui tapisse les gaines des racines extérieures pourraient être perturbés. Dans tous les cas, la procédure consistant à séparer l'épiderme du derme et de l'efficacité de l'infection peut varier d'une souche de souris à l'autre ( Pris ensemble, le défi de l'essai de l'infection ex vivo est la préparation et l'entretien des feuilles épidermiques. La fragilité du tissu nécessite une manipulation très prudent et contrôle la façon dont le tissu est conservée après la séparation du derme. Un autre problème est la viabilité limitée des feuilles de la culture. Depuis la viabilité cellulaire diminue au fil du temps, des expériences d'infection devraient être réalisées immédiatement ou à moins de 3 heures après la préparation des feuilles. En plus de la peau murine, feuilles épidermiques peuvent être également préparés à partir d'échantillons de peau ou les muqueuses humaines. Selon la nature et l'épaisseur de l'épiderme, la dispase traitement doit être adapté. Pour suivre l'évolution de l'infection, il est plus approprié pour visualiser les cellules infectées dans cryocoupes. Il faut garder à l'esprit que, avec haute PFU / cellule et de plus longues durées d'infection, les feuilles épidermiques commencent une sorte de disintegration. Basé sur l'effet cytopathique, cellules rondes et contacts cellule-cellule se perturbées. En 24 heures pi avec 100 PFU / cellule, quelques cellules basales infectés pourraient se perdre, qui peut également compter sur le traitement dispase II. Avec inférieure PFU / cellule, les temps d'infection peuvent être étendues sans entraîner de graves lésions tissulaires. En variante, l'étendue des dommages peut être utilisé comme marqueur de la façon dont diverses souches de virus pathogènes sont. Nous préférons de visualiser les cellules infectées par coloration expression ICP0. L'avantage est une détection très tôt des cellules infectées, et, sur la base du modèle ICP0 de coloration, les cellules à un stade précoce lors de l'infection peut être distingué de ceux à un stade avancé. En variante, les cellules infectées peuvent être visualisées par coloration expression d'autres gènes précoces tels que le virus VP5 de protéine de capside virale gD et la protéine d'enveloppe. Nous avons aussi essayé de visualiser des particules de virus entrants avant expression des gènes viraux, soit par infection avec GFP-tagged HSV-1 ou par coloration capsides dans des échantillons fixes. Selon notre expérience, le motif de la GFP-fluorescence ou le schéma de coloration dans des coupes tissulaires sont trop complexes pour démontrer clairement la présence de particules virales intériorisées. En variante, les particules virales peuvent être visualisées par microscopie électronique, lorsque les titres de virus élevé de ~ 1000 - 1500 PFU / cellule sont utilisées. Dans le cas de la dose de virus plus faible, les particules virales peuvent être détectées à peine. Au lieu de visualiser les cellules infectées dans des feuilles épidermiques intactes, l'épiderme peuvent être dissociées pour analyser les taux d'ARN ou de quantifier le nombre de cellules avec une surface, l'expression cytoplasmique ou nucléaire de gènes d'intérêt par analyse FACS. Nous supposons que ce protocole ex vivo de l'infection peut être adapté au moins aux virus qui sont connus pour infecter des kératinocytes basaux.
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Acknowledgments
Nous remercions Peter Staeheli pour fournir souris B6.A2G-MX1 et Semra Özcelik pour avis technique.
Ce travail a été soutenu par la Fondation allemande pour la recherche par le biais SFB829 et KN536 / 16, et le Köln Fortune Programme / Faculté de médecine, Université de Cologne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/high glucose/GlutaMAX | Life Technologies | 31966047 | needed for cultivation of epidermal sheets |
| dispase II powder | Roche | 4942078001 | has to be solved in heated PBS |
| enzyme-free cell dissociation solution | Sigma | C5914 | needed for very gentle dissociation of epidermal sheets |
| TrypLE select cell dissociation solution | Life Technologies | 12563-029 | needed for dissociation of epidermal sheets |
| chelex 100 resin | Bio-Rad | 142-2832 | needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum |
| gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7765 | needed for minimization of non-specific antibody binding |
| Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml) | Covance | PRB-155P | used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis |
| Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml) | Life Technologies | A-11029 | used as secondary antibodies |
| Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml) | Life Technologies | A-21429 | used as secondary antibodies |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride) (conc.: 0.1 mg/ml) | Sigma | 36670 | used to counterstain the nucleus |
References
- Koelle, D. M., Corey, L. Herpes simplex: insights on pathogenesis and possible vaccines. Annu. Rev. Med. 59, 381-395 (2013).
- Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J. Herpes simplex Viruses. Fields Virology. , 6th edition, 1823-1897 (2013).
- Syrjänen, S., Mikola, H., Nykänen, M., Hukkanen, V. In vitro establishment of lytic and nonproductive infection by herpes simplex virus type 1 in three-dimensional keratinocyte culture. J. Virol. 70, 6524-6528 (1996).
- Visalli, R. J., Courtney, R. J., Meyers, C. Infection and replication of herpes simplex virus type 1 in an organotypic epithelial culture system. Virology. 230, 236-243 (1997).
- Hukkanen, V., Mikola, H., Nykänen, M., Syrjänen, S. Herpes simplex virus type 1 infection has two separate modes of spread in three-dimensional keratinocyte culture. J. Gen. Virol. 80, 2149-2155 (1999).
- Gescher, K., et al. Inhibition of viral adsorption and penetration by an aqueous extract from Rhododendron ferrugineum L. as antiviral principle against herpes simplex virus type-1. Antiviral Res. 82, 408-413 (2010).
- Petermann, P., Haase, I., Knebel-Mörsdorf, D. Impact of Rac1 and Cdc42 signaling during early herpes simplex virus type 1 infection of keratinocytes. J. Virol. 83, 9759-9772 (2009).
- Everett, R. D., Maul, G. G. HSV-1 IE protein Vmw110 causes redistribution of PML. EMBO J. 13, 5062-5069 (1994).
- Chrostek, A., et al. Rac1 is crucial for hair follicle integrity but is not essential for maintenance of the epidermis. Mol. Cell. Biol. 26, 6957-6970 (2006).
- Petermann, P., et al. Entry mechanisms of Herpes Simplex Virus Type 1 into murine epidermis: Involvement of nectin-1 and HVEM as cellular receptors. J. Virol. 89, 262-274 (2015).
- McGeoch, D. J., et al. The complete DNA sequence of the long unique region in the genome of herpes simplex virus type 1. J. Gen. Virol. 69, 1531-1574 (1988).
- Schelhaas, M., Jansen, M., Haase, I., Knebel-Mörsdorf, D. Herpes simplex virus type 1 exhibits a tropism for basal entry in polarized epithelial cells. J. Gen. Virol. 84, 2473-2484 (2003).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130, 5241-5255 (2003).
- Rahn, E., Petermann, P., Hsu, M. J., Rixon, F. J., Knebel-Mörsdorf, D. Entry pathways of herpes simplex virus type 1 into human keratinocytes are dynamin- and cholesterol-dependent. PLoS One. 6, e25464 (2011).
- Everett, R. D., Cross, A., Orr, A. A truncated form of herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 is expressed in a cell type dependent manner. Virology. 197, 751-756 (1993).
- Horisberger, M. A., Staeheli, P., Haller, O. Interferon induces a unique protein in mouse cells bearing a gene for resistance to influenza virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 1910-1914 (1983).
- Christian, A. E., Haynes, M. P., Phillips, M. C. Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. J. Lipid Res. 38, 2264-2272 (1997).
- Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. Effects of cholesterol depletion by cyclodextrin on the sphingolipid microdomains of the plasma membrane. Biochem. J. 335, 433-440 (1998).
- Yancey, P. G., et al. Cellular cholesterol efflux mediated by cyclodextrins: Demonstration of kinetic pools and mechanism of efflux. J. Biol. Chem. 271, 16026-16034 (1996).
- Montgomery, R. I., Warner, M. S., Lum, B. J., Spear, P. G. Herpes simplex virus-1 entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family. Cell. 87, 427-436 (1996).
- Geraghty, R. J., Krummenacher, C., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Spear, P. G. Entry of alphaherpesviruses mediated by poliovirus receptor-related protein 1 and poliovirus receptor. Science. 280, 1618-1620 (1998).
- Taylor, J. M., Lin, E., Susmarski, N., Yoon, M., Zago, A., Ware, C. F., Pfeffer, K., Miyoshi, J., Takai, Y., Spear, P. G. Alternative entry receptors for herpes simplex virus and their roles in disease. Cell Host Microbe. 2, 19-28 (2007).
- Barron, M. J., Brookes, S. J., Draper, C. E., Garrod, D., Kirkham, J., Shore, R. C. The cell adhesion molecule nectin-1 is critical for normal enamel formation in mice. Hum. Mol. Genet. 17, 3509-3520 (2008).
- Wang, Y., Subudhi, S. K., Anders, R. A., Lo, J., Sun, Y., Blink, S., Wang, Y., Liu, X., Mink, K., Degrandi, D., Pfeffer, K., Fu, Y. X. The role of herpesvirus entry mediator as a negative regulator of T cell-mediated responses. J. Clin. Invest. 115, 711-717 (2005).
