Abstract
そのヒト宿主を入力するには、単純ヘルペスウイルス1型（HSV-1）は、粘膜表面、皮膚、または角膜の障壁を克服しなければなりません。 HSV-1の目標は、最初の入力時にケラチノサイトおよび神経細胞の潜伏感染が続いている上皮における一次感染を確立します。再活性化した後、ウイルスは皮膚の小胞または粘膜潰瘍として現れる皮膚粘膜のサイトで明らかになることができます。 HSV-1は、皮膚や粘膜に侵入し、到達したか、その受容体は、あまり理解されていません。細胞レベルでの上皮組織へのHSV-1の侵入経路を調べるために、我々は、皮膚中の原発性および再発性感染症の部位を表すマウス表皮の ex vivo感染モデルを、確立しました。アッセイは、マウスの皮膚の準備が含まれています。表皮は、ディスパーゼII処理により真皮から分離されています。ウイルス含有培地に表皮シートを浮遊した後、組織が固定され、感染による種々の時間の感染後に視覚化することができますHSV-1前初期タンパク質ICP0に対する抗体を感染させた細胞を染色します。 ICP0発現細胞は、1.5時間の感染後に既に基底ケラチノサイト層で観察することができます。より長い感染時間で、感染した細胞は、感染は、基底ケラチノサイトに限定されないことを示す、基底上層において検出されるが、ウイルスが組織内の他の層に広がります。様々なマウスモデルの表皮シートを使用して、感染のプロトコールは、組織内へのHSV-1の侵入に寄与する細胞成分の関与を決定することができます。さらに、アッセイは、初期エントリ段階、細胞から細胞への広がりおよびウイルス産生を妨害する組織で阻害剤を試験するのに適しています。ここでは、詳細にex vivoでの感染プロトコルを記述し、ネクチン1またはHVEM欠損マウスを用いて、我々の結果を提示します。
Introduction
単純ヘルペスウイルス（HSV）は、生命を脅かす感染症に軽度の合併症のない皮膚粘膜病変から、ヒトでの疾患の範囲を引き起こす可能性があります。 HSV 1型（HSV-1）が支配的に可能性が高い生殖器感染症を引き起こす1 HSV 2型（HSV-2）、一方、口腔顔面感染症および脳炎に関連しています。 HSVは、培養中の細胞に入り、感染を開始し、ウイルス子孫を生産する方法を理解する上で重要な進展があるが、我々は細胞レベル2での組織へのウイルスの侵入経路（複数可）について少し知っています。 HSV皮膚または感染、マウス、ウサギ、モルモット、粘膜の研究のための動物モデルとして使用されています。皮膚感染は皮内注射によって、またはウイルスの存在下で肌を掻くことによって設立され、病気の発症は、ウイルス産生と相関していました。これらの方法は、疾患の病因の様々な側面を理解することを助け、及び抗ウイルス薬を評価するために使用されます。 TISSUでHSV感染を研究するために、Eレベルは、器官型ヒト皮膚モデルが適用されています。感染率は、これらのいかだ培養で制限されているように、感染症、ウイルスの拡散および抗ウイルス成分の影響を調査した研究の限られた数しか3-6を公開されています。
無傷の上皮におけるHSV-1感染の間に役割を果たしている細胞の決定を特徴づけるために、我々は、マウスの表皮7のex vivo感染研究のためのプロトコルを確立しました。皮膚は、新生児からか、成体マウスの尾から調製しました。 HSV-1は、ウイルス含有培地中に浸漬した完全な皮膚サンプルを、感染することができませんでしたので、私たちは、ディスパーゼII処理によって真皮から表皮を分離しました。ウイルス含有培地上で表皮シートの浮上した後、感染した細胞を様々な時間感染後（PI）7に表皮基底層に可視化することができます。ウイルス複製Aの前に、個々の細胞における感染の開始を可視化しますNDウイルス産生は、我々は、HSV-1感染中に発現最初のタンパク質のうちの1つである感染した細胞の蛋白質0（ICP0）に対する抗体で染色しました。 ICP0の細胞内局在は、初期感染時に明確な相を通過します。 ICP0は、ウイルス遺伝子発現の初期段階の間に、核病巣に存在するが、細胞質へのICP0の再局在は、感染8の次の段階を示しています。
我々は、感染の間に、様々な細胞因子の潜在的な役割をテストするために別のマウスモデルから表皮シートの ex vivo感染アッセイを使用していました。アクチンダイナミクスの重要な調節因子としてのRac1の影響に対処するために、我々は、RAC1遺伝子9のケラチノサイト特異的欠失を有するマウスの表皮を感染させました。このモデルは、表皮角化細胞層におけるHSV-1感染の効率に欠損のRac1の影響を研究するために私達を可能にしました。再対照同腹子の感染表皮との比較Rac1の不在は、表皮の基底層7における感染の開始に影響を及ぼさないことを示し、有意差はvealedありません。さらに、マウスモデルの使用は、私たちは細胞の受容体は、表皮内への進入を媒介する対処することができました。 HSV-1とネクチン1またはHVEM欠損マウスのいずれかから感染表皮シートは、組織への最初のウイルスの侵入を強くネクチン1 10の存在に依存することを明らかにしました。さらに、我々の結果は、HVEMはまた、ネクチン1 10未満の効率が、マウスの表皮における受容体として働くことができることを実証しています。
表皮層における感染細胞の空間分布に対処するために、我々は、組織切片および表皮ホールマウント（ 図1）にICP0発現を可視化します。完全な皮膚の凍結切片では、何のICP0発現細胞は、（ 図1）検出されません。対照的に、表皮シートの凍結切片は、細胞質を実証すでに3時間のPI（ 図1）での基底層でICP0式。後の時点で、基底層直上の層に拡散するウイルスを可視化することができます。基底層中の感染細胞の空間分布は、容易に表皮ホールマウント（ 図1）に従うことができます。 100 PFU /細胞でのHSV-1の感染の際に、毛包間表皮における基底ケラチノサイトの約50％が最も感染した細胞が核ICP0を表現するこの時点で1.5時間のパイでICP0の発現を示します。初期遺伝子発現の後の段階を示す細胞質へICP0の再局在は、3時間のPI（ 図1）で、ほぼすべての細胞に存在します。 ex vivoで HSV-1感染時に感染した細胞を可視化これらのモードは、阻害剤のまたは組織中のウイルスの侵入と拡散上/削除変異した細胞成分の効果を研究するための強力なアッセイを提供します。
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Protocol
倫理ステートメント。
屠殺した動物からの表皮シートの製造はLandesamtエリーゼナチュール、環世界とVerbraucherschutz、ノルトライン=ヴェストファーレン（ドイツ）のガイドの勧告に厳密に従って実施されます。研究はLANUV NRW（番号8.84-02.05.20.13.018）によって承認されました。
楽器と培養培地の調製
- グルタミンジペプチド、10％FCS、100 IU / mlペニシリン、および100μg/ mlストレプトマイシン（以下「DMEM」と称する）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）/高グルコースに表皮シートを養います。
- 表皮シートの製造のために、慎重に加熱したPBSでディスパーゼII粉末（5 mg / mlの）を溶解（最大37℃）。 0.22μmのフィルターを通して溶液を濾過し、治療のためにそれを直接使用しています。
- 表皮全体の製造は13をマウントするために、バフを遮断準備0.5％の粉乳、冷水魚皮から0.25％のゼラチン及びTBS中0.5％のTriton X-100とER。物質は、回転ミキサー上で室温で少なくとも2時間混合物をインキュベートすることによって溶解させます。また、洗浄用緩衝液としてPBS中の0.2％のTween 20を準備します。固定のために、3.4％、PBS中4％ホルムアルデヒドを準備します。
- 凍結切片の免疫染色のために、PBS中の5％正常ヤギ血清および0.2％Tween 20でブロッキングバッファーを準備します。固定のため、PBS中の0.5％ホルムアルデヒドを準備します。
マウスの皮膚から表皮シートの作製
- 感染研究のための新生児背中の皮膚からの表皮の調製
- 解剖皿に断頭マウス（生後1〜3日）を配置し、四肢と完全な胴体から皮膚の効率的な除去を可能にする胴体に近い尾をカット。四肢の除去中に、直径が可能な限り小さくカットを維持しようとします。
- 湾曲した微細な鉗子Aと胴体を修正優しく胴体から皮膚を分離するために、バックに沿って尾側する頭蓋から皮膚の下に鈍い先端のはさみを動かすND。背面に沿って皮膚をスリット。
- FACS分析、ケラチノサイトまたはRNAの準備を単離するために、胴体をオフにプッシュする組織と鈍い先端のはさみを修正するために鉗子を使用して、胴体から完全に皮をはがし。凍結切片またはホールマウントの調製のために背中の皮膚の部分だけを取ります。
- 約10×10mmの1-2個にメスで背部皮膚をみじん切りに。 〜1ミリリットル滅菌PBSで6ウェルプレートの1ウェルに作品を配置。真皮側が下を向いていることを確認します。
- 1.5ミリリットルのディスパーゼIIでPBSを交換してください（5 mg / mlのPBS）と（ホールマウント用）、37℃で、またはO / N 4℃で30分間のいずれかでインキュベートします。 PBSで3回洗浄します。静かに表皮を持ち上げるために、基礎となる真皮および他の鉗子を修正するために、1つの鉗子を使用して、完全なシートとして表皮を除去します。このステップEASを作るために双眼鏡を使用して、Y。下部にその基底側を含むDMEMに表皮シートを転送します。感染実験のためにすぐにシートを使用してください。
注：主にFACS分析、ケラチノサイトまたはRNAの準備を単離するための新生児の皮膚からの表皮の準備を使用してください。理由は、その脆弱性のため、凍結切片またはホールマウントのための感染シートの製造は、あまり適していません。
- 感染研究のための大人の尾の皮膚から表皮の調製
- 頚椎脱臼により1〜3ヶ月の年齢でマウスを安楽死させます。背中の長い埋め込み毛包が無傷の表皮シートの分離を妨げるので、代わりに背中の皮膚の尾を取ります。屠殺したマウスから尾をカットし、メスで長さ方向にスリット。
- 骨から皮をはがしし、約5×5mmの小片にメスでそれを切ります。 1つのウェルに4枚まで入れて、2.1.5で説明したようにディスパーゼII中でのインキュベーションを進めます
注：使用大人太極拳リットルの皮膚は、凍結切片またはホールマウントを調製しました。あるいはすぐに使用する、尾部は、かなりの感染効率を損なうことなく記憶または4℃で約24時間、輸送することができます。尾部は、48時間まで維持される場合、表皮シートがほとんどHSV-1に感染したことはできませんでした。
- FACS分析のために表皮の解離
注：FACS分析による表面タンパク質の発現の検出は、細胞表面と目的のタンパク質を損なわない適切な細胞分離技術を必要とします。- RTで15分間、1.5ミリリットル/ウェルの組換えトリプシンに基づく細胞解離溶液に、37℃で15分間基底側を6ウェルプレート中の新生表皮シートをインキュベートします。
- 3ミリリットルのDMEMを追加することにより、インキュベーションを停止します。ケラチノサイトが溶解を得るように穏やかに6ウェルプレートに表皮を移動させるように湾曲した微細なピンセットを使用して、ケラチノサイトを解離します。細胞懸濁液を収集し、このステップを3回繰り返します常に新鮮なDMEMを使用。
注：この解離手法は、ケラチノサイトの表面にネクチン1を検出することが適当です。 - あるいは、RTで15分間、37℃で15分間、酵素を含まない細胞解離溶液に表皮シート（CDS）をインキュベートします。優しく上下CDSをピペットでケラチノサイトをフラッシュするために、室温でさらに15分間インキュベートします。
- 細胞懸濁液を収集し、新鮮なDMEMを使用して、フラッシング工程を3回繰り返します。
注：この解離がHVEMの表面発現を検出するのに適しています。 CDS溶液の欠点は、より少ない細胞が、組換えトリプシンに基づく細胞解離溶液よりも解離することです。表面発現に加えて、ICP0式として、核または細胞質発現は、組換えトリプシン基づく細胞解離溶液で感染表皮シートの解離後にFACSによって分析することができます。
- ケラチノサイトまたはexを単離するための表皮の解離道のRNA
- 1.5ミリリットル/ウェルの組換えトリプシン基づく細胞解離溶液を含んでいる皿の底部に向かって基底側で6ウェルプレートに新生児表皮シートを置きます。 RTで30分間インキュベートします。 3ミリリットルのDMEMを加え、穏やかに皿に表皮を移動するために、湾曲細かい鉗子を使用して、ケラチノサイトを解離。
- 細胞懸濁液を収集し、新鮮なDMEMを使用して、この手順を3回繰り返します。この細胞懸濁液は、RNAを抽出したり、文化の一次マウスケラチノサイトにするために使用します。
HSV-1と表皮シートの3感染
- 500μlのDMEM以上にHSV-1 WT株17 11の溶液を調製し、表皮シートはフローティングされたウイルス液で培地を交換してください。この時点は、0時間12として定義される。37℃で24ウェルプレートの1ウェルに表皮シートの感染を行っ。ウイルス力価の計算は、推定された数に基づいています表皮シート（5×5 mmのシートあたり約2×10 5細胞 ）あたりの基底層での細胞。
- HSV-1で約100プラーク形成単位（PFU）/細胞で感染し、1時間のパイでDMEMによるウイルス含有培地を交換
注：新生児の皮膚から表皮シートの場合、シートはインキュベーション中に解離し始めることに注意してください。
感染した細胞の可視化4.
- 表皮ホールマウント13
- RTまたはOで2時間/ N 4℃のいずれかの3.4％ホルムアルデヒドで表皮シートを修正。 PBSで2回洗浄し、0.5％粉乳、冷水魚皮、室温14で1時間、TBS中の0.5％のTriton X-100 0.25％ゼラチンでブロックします。
- 15を室温でブロッキング緩衝液中で1:60に希釈したマウス抗ICP0（モノクローナル抗体11060）とシートO / Nインキュベートします。中間径フィラメントネットワークを可視化するために、ウサギポリクローナルと同時にインキュベート抗マウスケラチン14（100ng / mlの）。
- 室温で4時間の間に、PBS-0.2％Tween 20で4〜5回洗浄します。 AF488結合抗マウスIgG（1 / mlの）、AF555結合抗ウサギIgG（1 / mlの）、およびDAPI（4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）（100 ngのでO / Nインキュベート/ ml）を、室温でブロッキング緩衝液中。
- 室温で4時間、PBS-0.2％Tween 20で洗浄します。試料スライドの上にその基底側マウントの表皮シート、蛍光マウンティング培地中に埋め込んで、カバーガラスでカバーしています。
- 表皮凍結切片
- 成人表皮シートを室温で20分間、PBS中の4％ホルムアルデヒドで固定し、PBSで2回洗浄しました。液体窒素中の培地と凍結凍結組織で固定シートを埋め込みます。クライオミクロトームで8-10ミクロンのセクションをカット。
- RTで10分間PBS中0.5％ホルムアルデヒドで再びセクションを修正、PBSで2回洗浄し、5％正常ヤギ血清でブロックし、0.2％Tween 20をPBS中で室温で30分間、次いで、Mで60分間染色ウーズ抗ICP0（モノクローナル抗体11060）15は、ブロッキング緩衝液で3回洗浄し、続いて、ブロッキング緩衝液中で1:60に希釈しました。
- その後、RTで45分間ブロッキング緩衝液中にAF488結合抗マウスIgG（1μg/ ml）およびDAPI（100ng / mlの）でインキュベートし、3回洗浄します。蛍光マウンティング培地中のセクションを埋め込み、カバーガラスでカバーしています。
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Representative Results
この方法の課題は、HSV-1は、基底層から浸透することが可能に表皮シートを調製することです。重要なステップは、マウスの系統に応じて、適合させる必要があり、ディスパーゼII処理によって真皮から表皮を分離することです。ディスパーゼIIの濃度は、2.5から5 mg / mlの、そして20〜45分間のインキュベーション時間の範囲であることができます。中間フィラメントタンパク質のケラチン14の染色が容易に表皮基底層を感染させることができるかどうか、それが感染した細胞（ 図2）のごく限られた数を表示するかどうかを予測することができます。理想的には、表皮ホールマウントのケラチン14染色は、基底細胞（ 図2A）の無傷の層を示す必要があります。最悪の場合には、ディスパーゼII治療は、基底層を破壊し、毛包間表皮において染色何の細胞が存在しないケラチン14を発現する基底ケラチノサイトが解離していることを示している（ 図2B 16（ 図2B） 。ケラチン14染色（ 図2C）により可視化のみ30分間mlの2.5ミリグラム/ディスパーゼIIへの還元後、無傷の基底膜を得ました。
皮膚が成体マウスの尾から取られたときにそのため、表皮の付属として密な毛包の、真皮から表皮の分離が最も便利です。インキュベーション後、シートの脆弱性は、分析可能な領域の大きさを制限するが、代替的に、毛包の発達との新生マウスの背中の皮膚を使用することができます。これまでのところ、HSV-1感染の効率にも差は表皮が新生児または成体マウス（ 図3）から取られたかどうかに応じて、認められませんでした。 newboのホールマウントRN表皮は、効率的な毛包間表皮の感染だけでなく発展途上毛包の内側を覆う密集した細胞のように（ 図3）を視覚化します。大人の表皮の毛包間表皮が効率的に感染している間、毛細菌や毛包の外毛根鞘の部分だけが（ 図3）感染しています。非感染対照（ 図3）に示すように、毛幹の下の皮脂腺が常に伴う二次抗体の非特異的な染色を、しかし、である、染色されます。
阻害剤の研究を使用して、我々は、コレステロールは、表皮へのHSV-1エントリの役割を果たしているかどうか、検討しました。成体マウスの表皮シートは、原形質膜17-19からコレステロールを枯渇メチルβシクロデキストリン（MβCD）で前処理しました。感染に先立ち、MβCDがウイルスenvelのコレステロールの任意の枯渇の影響を避けるために、数回の洗浄工程により除去しましたOPE。前処理時に20 mMのとほとんど感染した細胞は、毛包間表皮や毛の細菌のいずれかで見られますが、皮脂腺の唯一の非特異的な染色が見える（ 図4A）であったMβCD。組織は、阻害剤処理によって損傷されなかったことをコントロールとして、我々は、MβCD処置表皮シート（ 図4A）を補充するための500μg/ mlのコレステロールを添加しました。この処理は完全に阻害剤による前処理は、組織の生存能力を妨害しなかったことを証明する感染性を回復しました。
マウスモデルを用いて、我々は、表皮10でのHSV-1のネクチン1と細胞受容体のようなヘルペスウイルスエントリーメディエーター（HVEM）の関与を取り上げました。両方のタンパク質は、種々の細胞系20,21におけるHSVのような効率的な受容体に作用することが知られており、それらは、マウス22における疾患の発生のために十分なされています。私たちは、HSV-としてネクチン1及びHVEMの表皮固有のロールを決定しました1受容体10。ウイルス含有培地上で野生型、ネクチン1またはHVEM欠損マウスから表皮シートを浮遊した後、全体のマウントは、感染した細胞の数を可視化するために3時間のパイで調製しました。 interfollicular表皮の比較のみネクチン1欠乏が劇的ICP0発現細胞（ 図4B）の数を減少させたことを示しています。 18時間のパイで凍結切片に示すように加えて、ウイルスの拡散は、ネクチン1の非存在下ではかなり限られていました （ 図4C）。感染した細胞の定量のために、それは、感染した細胞の数が均等に毛包間表皮を横切って、または感染した細胞のクラスターが観察されるかどうかに分散されているかどうかを監視することが重要です。例えばネクチン1欠損表皮では、感染効率は、一部の地域では約10％の感染および毛包間表皮10の他の領域では約30％で変化しました。したがって、我々はTを決定しましたO感染の減少を実証するために、感染した細胞のない数字を与えませんが、定性的なデータとして存在するホールマウント。
図1：表皮切片またはホールマウント内の感染細胞の可視化は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
上部には、基底ケラチノサイト層の目に見える表面で完全な成人の皮膚サンプル、真皮から分離した後、表皮のセクション、表皮全体のマウントを示す方式があります。毛包とスターへの矢印ポイントは、毛包間表皮を示しています。 3週齢のマウスから調製した皮膚試料と表皮シートは、1.5または3時間のパイサンプルだったstaineでHSV-1で約100 PFU /細胞で感染させ、固定し、DAPI（青）と核の感染細胞を可視化するモック感染後または1.5 3時間のパイでの抗ICP0（緑）とD、および対比は様々な層内のすべてのセルを示しています。対照として、モック感染の完全な皮膚サンプルを全くICP0染色（左部分）を実証していない3時間のパイに感染したサンプルと比較して示しています。凍結切片のように調製したモック感染または感染した上皮シートを中央部分に示されています。 1.5または3時間感染表皮全体マウントが右側に表示されます。バー、25ミクロン（凍結切片）、および40ミクロン（ホールマウント）。
図2：ディスパーゼIIの異なる濃度とインキュベーションした後、表皮ホールマウントのケラチン14染色 C57BL / 6またはB6.A2G-Mx1のマウスからの表皮をディスパーゼIIと真皮から分離しました。表皮ホールマウントを抗keratiで染色しましたnは14（赤）およびDAPI（青）で。表皮シートを、5 mg / mlの（A、B）または37℃で30分間、2.5 mg / mlの（C）ディスパーゼIIと共にインキュベートしました。バー、25ミクロン。略語：毛包（HF）、毛包間表皮（IFE）、皮脂腺（SG） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：新生児または成体表皮のホールマウントでICP0式の可視化スキームそれぞれ、成人および新生児表皮から基底層の目に見える表面を示し、毛包と表皮ホールマウントを示すか、毛包を開発。表皮シートを、HSV-1、約100 PFU /細胞で感染させ、全体のマウントを用いて染色しました。抗ICP0（緑）、対照として3時間のパイでのDAPI（青）で、大人の尾の皮膚から感染していない表皮ホールマウントは皮脂腺の非特異的な染色を実証するだけで、二次抗体で染色しました。バー、25ミクロン。略語：毛包（DHF）、毛包（HF）、毛包間表皮（IFE）、皮脂腺（SG）を開発。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：3週齢のwtマウス（C57BL / 6）の大人の尾皮膚からの阻害剤MβCDまたはネクチン1-またはHVEM欠損表皮のいずれかを使用して、細胞因子の影響を評価する（A）表皮シートは、MβCDで前処理しました（20ミリモル）とapproxiでHSV-1に感染しましたmately 100 PFU /細胞。対照として、未処理の表皮シートを感染させ、35mMのMβCDで前処理した表皮シートは、感染の前に500 / mlのコレステロールで処理しました。表皮ホールマウントはMβCD処置によるコレステロールの枯渇後に感染した細胞の数を示すために抗ICP0（緑色）とし、3時間PIでのDAPI（青色）で染色しました。 図3に示すように 、皮脂腺（SG）の染色は、非特異的です。略語：HF（毛包）、IFE（毛包間表皮）、SG（皮脂腺）。バー、150μmの。重量の（B）アダルトテール表皮（C57BL / 6）、ネクチン-1- 23、またはHVEM欠損マウス24（1ヶ月齢）は、約100 PFU /細胞で感染させました。表皮ホールマウントは、抗ICP0（緑）で、3時間のPI（C）重量から表皮シートの凍結切片にDAPI（青）（C57BL / 6）、またはネクチン1欠損マウス23は、18時間のPIで染色して染色しましたRES（B）に示すults及び（C）A、B及びCの共焦点突起とマージされた画像では、基準10から変更されたが示されています。バー、150μmの（A）、および25ミクロン（B、C）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
C57BL / 6から、成人の皮膚の表皮シートは、HSV-1に感染している場合で約100 PFU /細胞より低いウイルス用量が少なく、感染細胞と相関し、遅いながら、私たちは、毛包間表皮内の基底層のほぼ全ての細胞に感染を観察感染の進行。一般的には、毛包には、感染した細胞の可変数を示します。開発毛包の内側を覆うかなり小さいケラチノサイトのほとんどが感染している間、大人の毛包の唯一の毛芽が完全に感染しています。ディスパーゼII治療が進むことにより、表皮の分離は、毛包の一部が失われるか穏やかに応じて。ほとんどの場合、皮脂腺と毛包間表皮の間のケラチノサイト層が不足していると外毛根鞘の内側を覆う層が破壊されていてもよいです。いずれの場合においても、真皮および感染効率から表皮を分離する手順は、（別のマウス株から変えることができます まとめると、ex vivoでの感染アッセイの課題は、表皮シートの作成 とメンテナンスです。組織の脆弱性は、非常に慎重な取り扱いが必要であり、組織が真皮から分離した後に保存されているどれだけうまく制御します。さらに問題は、培養中のシートの限られた生存能力です。細胞生存率は経時的に減少するので、感染実験は、シートの調製直後または少なくとも3時間行われるべきです。マウスの皮膚に加えて、表皮シートはまた、ヒトの皮膚又は粘膜試料から調製することができます。自然及び表皮の厚さに応じて、ディスパーゼ処理を適合させる必要があります。 感染の経過を追うためには、凍結切片に感染した細胞を可視化するのに最適です。一つは、高いPFU /細胞および感染のより長い時間で、表皮シートがdisintegraのいくつかの種類を開始することを心に留めておく必要がありまする。細胞変性効果に基づいて、細胞は切り上げと細胞間接触が中断されます。 100 PFU /細胞で24時間のパイでは、いくつかの感染基底細胞はまた、ディスパーゼII治療に依存する可能性がある、失われる可能性があります。下部PFU /細胞で、感染時間は、重篤な組織損傷を招くことなく拡張することができます。代替的に、損傷の程度は、種々のウイルス株がどのように病原性のマーカーとして使用することができます。 私たちは、ICP0式を染色することによって、感染細胞を可視化することを好みます。利点は、感染細胞の非常に早期の検出である、と、ICP0染色パターンに基づいて、感染の間の初期の段階にある細胞は、進行段階のものと区別することができます。あるいは、感染細胞は、ウイルスカプシドタンパク質のVP5およびウイルスエンベロープタンパク質のgDのような他の初期遺伝子の発現を染色することによって可視化することができます。 我々はまた、前のいずれかのウイルス遺伝子の発現にINFによって着信ウイルス粒子を視覚化しようとしましたGFPタグ、HSV-1または固定したサンプルでキャプシドを染色することによってection。我々の経験によれば、GFP蛍光のパターンまたは組織切片中の染色パターンは、明らかに内在化ウイルス粒子の存在を証明するには余りにも複雑です。 1500 PFU /細胞に使用される - 〜1000高いウイルス力価を時あるいは、ウイルス粒子は、電子顕微鏡によって可視化することができます。低いウイルス量の場合に、ウイルス粒子はほとんど検出できません。 代わりに、無傷の表皮シートで感染した細胞を可視化する、表皮は、RNAレベルを分析またはFACS分析による目的の遺伝子の表面、細胞質または核発現を有する細胞の数を定量化するために解離させることができます。 我々は、このex vivoで感染プロトコールは、少なくとも基底ケラチノサイトに感染することが知られているそれらのウイルスに適合させることができると仮定する。
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Acknowledgments
我々は、技術的な助言をB6.A2G-Mx1のマウスとSemraÖzcelikを提供するためのピーターStaeheliに感謝します。
この作品は、SFB829とKN536 / 16を通じてドイツ研究財団、医学のケルンフォーチュンプログラム/学部、ケルン大学によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/high glucose/GlutaMAX | Life Technologies | 31966047 | needed for cultivation of epidermal sheets |
| dispase II powder | Roche | 4942078001 | has to be solved in heated PBS |
| enzyme-free cell dissociation solution | Sigma | C5914 | needed for very gentle dissociation of epidermal sheets |
| TrypLE select cell dissociation solution | Life Technologies | 12563-029 | needed for dissociation of epidermal sheets |
| chelex 100 resin | Bio-Rad | 142-2832 | needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum |
| gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7765 | needed for minimization of non-specific antibody binding |
| Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml) | Covance | PRB-155P | used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis |
| Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml) | Life Technologies | A-11029 | used as secondary antibodies |
| Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml) | Life Technologies | A-21429 | used as secondary antibodies |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride) (conc.: 0.1 mg/ml) | Sigma | 36670 | used to counterstain the nucleus |
References
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