Abstract
Om du vill ange dess mänskliga värd, måste herpes simplex virus typ 1 (HSV-1) övervinna barriären av slemhinnor, hud, eller hornhinna. HSV-1 mål keratinocyter under första inresan och etablerar en primär infektion i epitel, vilket följs av latent smitta av nervceller. Efter reaktivering, kan virus blivit uppenbart vid mukokutana webbplatser som visas som hud blåsor eller slemhinnor sår. Hur HSV-1 invaderar hud eller slemhinnor och når dess receptorer är dåligt kända. För att undersöka invasionen vägen av HSV-1 i epidermal vävnad på cellnivå, har vi etablerat en ex vivo infektionsmodell av murina epidermis, som representerar platsen för primär och återkommande infektion i huden. Analysen omfattar förberedelse av murin hud. Epidermis är separerad från dermis genom dispas II behandling. Efter flytande epidermala arken på virusinnehållande mediet, är vävnaden fast och infektion kan visualiseras vid olika tidpunkter efter infektion medfärgning infekterade celler med en antikropp mot HSV-1 omedelbar tidig protein ICP0. ICP0-uttryckande celler kan observeras i basal keratinocytlager redan vid 1,5 h efter infektion. Med längre infektion tider, infekterade celler detekterades i suprabasala skikt, vilket indikerar att infektionen inte är begränsad till de basala keratinocyter, men viruset sprider sig till andra skikt i vävnaden. Använda epidermala ark av olika musmodeller, kan infektionen protokoll som fast medverkan av cellulära komponenter som bidrar till HSV-1 invasion i vävnad. Dessutom är analysen lämpligt att testa inhibitorer i vävnad som stör de inledande inträde steg, cell till cell spridning och virusproduktionen. Här beskriver vi ex vivo infektionsprotokoll i detalj och presentera våra resultat med hjälp nectin-1- eller Hvem-brist möss.
Introduction
Herpes simplex-virus (HSV) kan orsaka en rad sjukdomar hos människor från milda okomplicerade mukokutana lesioner till livshotande infektioner. HSV typ 1 (HSV-1) är dominant associerad med orofaciala infektioner och encefalit, medan HSV typ 2 (HSV-2) mer sannolikt orsakar genitala infektioner 1. Även om det finns en betydande framsteg i att förstå hur HSV in celler i odling, initierar infektion och producerar viral avkomma, vi vet lite om virus invasionen vägen (s) i vävnaden på cellnivå 2. För studier av HSV huden eller mukosala infektioner, möss, har kaniner och marsvin använts som djurmodeller. Hudinfektion bildades genom intradermal injektion eller genom att skrapa huden i närvaro av virus och sjukdomsutveckling korrelerade med virusproduktion. Dessa metoder hjälpte till att förstå olika aspekter av sjukdomen patogenes, och används för att utvärdera antivirala läkemedel. För att studera HSV-infektion vid tissue nivå har organotypic mänsklig hud modeller använts. Eftersom hastigheten av infektion är begränsad i dessa flotte kulturer har endast ett begränsat antal studier som undersöker infektion, viral spridning och effekter av antivirala komponenter publicerats 3-6.
För att karakterisera cellulära bestämningsfaktorer som spelar en roll under HSV-1-infektion i den intakta epitel, har vi etablerat ett protokoll för ex vivo infektionsstudier i murina epidermis 7. Hud framställdes från nyfödda eller från svansen på vuxna möss. Eftersom HSV-1 inte kunde infektera hela hudprover, vilka nedsänkta i virusinnehållande mediet, separerade vi epidermis från dermis genom dispas II behandling. Efter flytande av epidermala arken på virusinnehållande medium kan infekterade celler visualiseras i epidermal basalskiktet vid olika tidpunkter efter infektion (pi) 7. För att visualisera initieringen av infektionen i enskilda celler före virusreplikation ennd virusproduktion, färgades vi med en antikropp mot den infekterade-cellprotein 0 (ICP0), vilket är ett av de första proteinerna som uttrycks under HSV-1-infektion. Den cellulära lokaliseringen av ICP0 passerar genom distinkta faser under tidig infektion. Medan ICP0 är närvarande i nukleära foci under ett tidigt skede av viral genexpression, relocalization av ICP0 till cytoplasman indikerar en efterföljande fas av infektion 8.
Vi använde infektionsanalysen av epidermala ark ex vivo från olika musmodeller för att testa potentiella roll olika cellulära faktorer under infektion. För att hantera effekterna av RAC1 som en viktig regulator av aktin dynamik, smittade vi epidermis hos möss med en keratinocyt specifik deletion av RAC1 genen 9. Denna modell tillät oss att studera konsekvenserna av bristfällig RAC1 på effektiviteten i HSV-1-infektion hos epidermal keratinocyter skikt. Jämförelsen till infekterade epidermis hos kontrollkull reuppenbarade ingen signifikant skillnad, vilket tyder på att frånvaron av RAC1 hade ingen effekt på inledandet av infektion i basalskiktet av epidermis 7. Användningen av ytterligare musmodeller tillät oss att ta itu med vilka cellulära receptorer förmedlar inträde i överhuden. Infecting epidermala ark från antingen nectin-1- eller HVEM-saknande möss med HSV-1 avslöjade att den initiala viralt inträde i vävnad är starkt beroende av närvaron av nectin-en 10. Dessutom, våra resultat visar att HVEM också kan fungera som receptor i murina epidermis, men mindre effektivt än nectin-1 10.
För att lösa den geografiska fördelningen av infekterade celler i epidermala skikten, visualisera vi ICP0 uttryck i vävnadssnitt och epidermala hela fästen (Figur 1). I kryosektioner av total hud, inga ICP0-uttryckande celler detekteras (figur 1). Däremot kryosnitt av epidermala ark visar cytoplasmiskICP0 expression i basalskiktet redan vid 3 h pi (figur 1). Vid senare tillfällen, viral spridning till suprabasala lager kan visualiseras. Den geografiska fördelningen av infekterade celler i basalskiktet kan lätt följas i epidermala hela fästen (Figur 1). Vid infektion med HSV-1 vid 100 pfu / cell, cirka 50% av de basala keratinocyter i de interfollikulära epidermis visar ICP0 uttryck vid 1,5 tim pi Vid denna tidpunkt mest infekterade celler uttrycker nukleär ICP0. Den relocalization av ICP0 till cytoplasman som indikerar ett senare skede av tidig genuttryckning är närvarande i nästan alla celler vid 3 h pi (figur 1). Dessa lägen att visualisera infekterade celler efter ex vivo HSV-1-infektion ger en kraftfull analys för att studera effekten av inhibitorer eller av borttagna / muterade cellulära komponenter på viralt inträde och spridning i vävnaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande.
Framställningen av epidermala ark från offrade djur genomförs i strikt överensstämmelse med rekommendationerna från Guide Landesamt für Natur, Umwelt och Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen (Tyskland). Studien godkändes av LANUV NRW (Number 8.84-02.05.20.13.018).
1. Framställning av instrument och kultur Media
- Odla epidermala ark i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) / hög glukos innehållande glutamin dipeptid, 10% FCS, 100 lU / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin (nedan kallad "DMEM").
- För framställningen av epidermala ark, noggrant upplösa dispas II pulver (5 mg / ml) i upphettad PBS (upp till 37 ° C). Filtrera lösningen genom ett 0,22 pm filter och använda den direkt för behandling.
- För framställning av epidermal hela fästen 13, förbereda blockera buffer med 0,5% mjölkpulver, 0,25% gelatin från kallt vatten fiskskinn och 0,5% Triton X-100 i TBS. Tillåt substanser för upplösning genom inkubering av blandningen under åtminstone 2 h vid RT på en roterande bländare. Också förbereda 0,2% Tween 20 i PBS som tvättbuffert. För fixering, förbereda 3,4% och 4% formaldehyd i PBS.
- För immunofärgning av kryosnitt, förbereda blockerande buffert med 5% normalt getserum och 0,2% Tween 20 i PBS. För fixering, förbereda 0,5% formaldehyd i PBS.
2. Beredning av Epidermala Ark från Murine Skin
- Framställning av epidermis från nyfödda rygghud för infektionsstudier
- Placera en halshuggen mus (en till tre dagar efter födseln) i en dissektion skålen och avbröt extremiteter och svansen nära bålen för att möjliggöra effektivt avlägsnande av huden från hela bålen. Under avlägsnande av armar och ben, försök att hålla nedskärningarna så liten som möjligt i diameter.
- Fäst bålen med böjda fin pincett ennd rör försiktigt trubbiga spets sax under huden från kraniala till kaudalt längs baksidan för att separera huden från bålen. Slits huden längs ryggen.
- För FACS-analys, isolering av keratinocyter eller framställning av RNA, dra av den fullständiga huden från bålen med hjälp av pincett för att fixera vävnaden och de trubbiga spets sax för att trycka ifrån bålen. För framställning av kryosnitt eller hela fästen tar bara bitar i ryggen hud.
- Chop baksidan huden med en skalpell i 1-2 stycken av ca 10 x 10 mm. Lägg bitarna i en brunn i en 6-brunnsplatta med ~ 1 ml steril PBS. Se till att den dermala sidan är vänd mot botten.
- Ersätt PBS genom 1,5 ml dispas II (5 mg / ml PBS) och inkubera under antingen 30 min vid 37 ° C (för hela monteringar) eller O / N vid 4 ° C. Tvätta 3 gånger med PBS. Försiktigt bort överhuden som en intakt ark med hjälp av en pincett för att åtgärda de underliggande dermis och andra pincett för att lyfta överhuden. Använd en kikare för att göra detta steg easy. Överför den epidermala arket i DMEM med dess basalsidan mot botten. Använd arken omedelbart för infektionsförsök.
OBS: Använd framställningen av epidermis från nyfödd hud främst för FACS-analys, isolering av keratinocyter eller beredning av RNA. På grund av sin skörhet, är framställningen av infekterade blad för kryosnitt eller hela fästen mindre lämpliga.
- Framställning av epidermis från vuxna svans hud för infektionsstudier
- Euthanize mössen vid en ålder av 1 till 3 månader halsdislokation. Ta svans i stället för rygghud sedan länge inbäddade hårsäckarna på baksidan hindra separation av intakta epidermala ark. Klipp av svansen från offrade möss och springa den på längden med en skalpell.
- Dra av huden från benet och hacka den med en skalpell i bitar om ca 5 x 5 mm. Sätt upp till 4 stycken i en brunn och fortsätt med inkubation i dispas II enligt beskrivningen i 2.1.5
OBS: Använd vuxen tail hud för att förbereda kryosnitt eller hela fästen. Som alternativ till omedelbar användning, kan svansar lagras eller transporteras under ca 24 h vid 4 ° C utan att förlora betydande infektionseffektivitet. Om svansar hålls upp till 48 timmar, kunde epidermala arken knappast infekterade med HSV-1.
- Dissociation av epidermis för FACS-analys
OBS: Detektion av ytprotein expression genom FACS-analys kräver lämpliga cell dissociation tekniker som inte skadar cellytan och proteinet av intresse.- Inkubera nyfödda epidermala ark i en 6-brunnar med den basala sida på 1,5 ml / brunn rekombinant trypsin baserad cell dissociation lösningen under 15 minuter vid rumstemperatur och 15 minuter vid 37 ° C.
- Stoppa inkubationen genom att tillsätta 3 ml DMEM. Dissociera keratinocyter genom att använda en böjd fin pincett för att försiktigt röra epidermis i 6-brunnsplatta så att keratinocyterna blir upplöst. Samla cellsuspensionen och upprepa detta steg 3 gångeralltid med färska DMEM.
OBS: Denna dissociation förfarandet är anpassat att detektera nectin-1 på ytan av keratinocyter. - Alternativt, inkubera de epidermala ark på enzymfritt cell dissociationslösning (CDS) för 15 min vid RT och 15 minuter vid 37 ° C. Inkubera ytterligare 15 min vid RT för att försiktigt spola ut keratinocyterna genom pipettering CDS upp och ned.
- Samla cellsuspensionen och upprepa spolningssteget 3 gånger med färska DMEM.
OBS: Denna dissociation är lämplig för att upptäcka yta uttryck för HVEM. Nackdelen med lösningen CDS är att färre celler dissocieras än med rekombinant trypsin baserad cell dissociationslösning. Förutom ytan uttryck, kan kärnkraft eller cytoplasmiskt uttryck som ICP0 uttryck analyseras med FACS efter dissociation av de smittade epidermala ark med rekombinant trypsin baserad cell dissociation lösning.
- Dissociation av epidermis att isolera keratinocyter eller exvägarna-RNA
- Put nyfödda epidermala ark i en 6-brunnsplatta med den basala sidan mot botten av skålen som innehåller 1,5 ml / brunn rekombinant trypsin baserad cell dissociationslösning. Inkubera under 30 min vid RT. Tillsätt 3 ml DMEM och dissociera keratinocyter genom att använda en krökt fin pincett för att försiktigt flytta epidermis i skålen.
- Samla cellsuspensionen och upprepa detta steg 3 gånger med färska DMEM. Använd denna cellsuspension för att extrahera RNA eller kultur primära murina keratinocyter.
3. Infektion av Epidermala Ark med HSV-1
- Framställ en lösning av HSV-1 vikt- stam 17 11 av inte mindre än 500 | j, l DMEM och ersätta mediet genom viruslösningen på vilken epidermala arken är flytande. Denna tidpunkt definieras som tiden 0 12. Utför infektion av en epidermal arket i en brunn på en 24-brunnsplatta vid 37 ° C. Beräkningen av virustiter baseras på det uppskattade antaletav celler i basallagret per epidermala ark (cirka 2 x 10 5 celler per 5 x 5 mm plåt).
- Infektera med HSV-1 vid ungefär 100 plackbildande enheter (PFU) / cell och ersätta den virusinnehållande medium genom DMEM vid en tim pi
OBS: Vid epidermala ark från nyfödda hud, tänk på att ark börja dissociera under inkubation.
4. Visualisering av infekterade celler
- Epidermal Hela Mounts 13
- Fix epidermala ark med 3,4% formaldehyd, antingen för två timmar vid rumstemperatur eller O / N vid 4 ° C. Tvätta två gånger med PBS och blockera med 0,5% mjölkpulver, 0,25% gelatin från kallvattenfiskskinn och 0,5% Triton X-100 i TBS under 1 timme vid RT 14.
- Inkubera ark O / N med mus-anti-ICP0 (monoklonal antikropp 11060) 15 utspätt 1:60 i blockerande buffert vid RT. Att visualisera mellantrådnätverket inkubera med kanin polyklonala samtidigt anti-mus keratin 14 (100 ng / ml).
- Tvätta fyra till fem gånger med PBS-0,2% Tween 20 under 4 h vid RT. Inkubera O / N med AF488-konjugerat anti-mus-IgG (1 | ig / ml), AF555-konjugerad anti-kanin IgG (1 | ig / ml), och DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) (100 ng / ml) i blockerande buffert vid RT.
- Tvätta med PBS-0,2% Tween 20 under 4 h vid RT. Mount epidermala ark med deras basala sida ovanpå ett preparatglas, bädda in fluorescerande monteringsmedium och täck med täck.
- Epidermal Kryosnitt
- Vuxna epidermala ark fixerades i 4% formaldehyd i PBS under 20 min vid RT och tvättades 2 gånger med PBS. Bädda fasta blad i vävnadsfrysmedium och frysa i flytande kväve. Skär 8-10 um sektioner med en cryomicrotome.
- Fäst sektionerna igen med 0,5% formaldehyd i PBS under 10 min vid RT, tvätta 2 gånger med PBS, block med 5% normalt getserum och 0,2% Tween 20 i PBS under 30 min vid RT och sedan färgas för 60 min med mOuse anti ICP0 (monoklonal antikropp 11.060) 15 spädd 1:60 i blockeringsbuffert, följt av 3 gånger tvätt med blockeringsbuffert.
- Därefter inkubera med AF488-konjugerat anti-mus-IgG (1 | j, g / ml) och DAPI (100 ng / ml) i blockerande buffert under 45 min vid RT och tvätta 3 gånger. Bädda in avsnitt i fluorescerande monteringsmedium och täck med täck.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utmaningen med metoden är att framställa epidermala ark till vilket HSV-1 kan tränga från basalskiktet. Det kritiska steget är separationen av epidermis från dermis genom dispas II behandling, som, beroende på musstam, måste anpassas. Koncentrationen av dispas II kan sträcka sig från 2,5 till 5 mg / ml, och tiden för inkubation från 20 till 45 minuter. Färgningen av mellanfilament protein keratin 14 lätt kan förutsäga huruvida det basala epidermalskiktet kan vara smittade, eller om det kommer att visa endast ett mycket begränsat antal infekterade celler (Figur 2). Helst ska keratin 14 färgning av epidermala hela fästen indikera en intakt skikt av basala celler (Figur 2A). I värsta fall, dispas II behandling störde basalskiktet och det finns inga celler färgade i interfollikulära epidermis indikerar att keratin 14-uttryck basala keratinocyter dissocieras (Figur 2B 16 (figur 2B) . Först efter reduktion av dispas II till 2,5 mg / ml för 30 minuter, tillsattes en intakt basalskiktet erhölls som visualiserades genom keratin 14 färgning (figur 2C).
På grund av de täta hårsäckar som bihang till epidermis, är bekvämast separation av epidermis från dermis när huden tas från svansen på vuxna möss. Alternativt kan rygghud av nyfödda möss med att utveckla hårsäckar användas, även om bräckligheten i arken efter inkubation begränsar storleken på analyserbara områden. Hittills har ingen skillnad i effektivitet HSV-1-infektion märkt beroende på om epidermis togs från nyfödda eller vuxna möss (Figur 3). Hela monteringar av newborn epidermis visualisera effektiv infektion i interfollikulära epidermis liksom de tätt packade celler som kantar utvecklings hårsäckarna (Figur 3). Medan interfollikulära epidermis av vuxna epidermis effektivt smittade, är hår bakterier och bara delar av de yttre rot höljen hårsäckar infekterade (Figur 3). Talgkörtlarna nedanför hårstrået alltid färgas, som emellertid, på grund av icke-specifik färgning av den sekundära antikroppen, såsom visas i oinfekterade kontroller (Figur 3).
Använda hämmar studier undersökte vi, oavsett om kolesterol spelar en roll för HSV-1 har trätt i epidermis. Epidermala ark av vuxna möss förbehandlades med metyl-β-cyklodextrin (MβCD), vilket utarmar kolesterol från plasmamembranet 17-19. Före infektion, var MβCD avlägsnades genom flera tvätt åtgärder för att undvika eventuella nedbrytande effekt på kolesterol i det virala envelopa. Vid förbehandling med 20 mM MβCD nästan ingen infekterade celler sågs i antingen interfollikulära epidermis eller hår bakterier, men endast det icke-specifik färgning av talgkörtlarna var synlig (Figur 4A). Som en kontroll att vävnaden inte skadas av inhibitorbehandling har vi lagt 500 mikrogram / ml kolesterol att fylla på MβCD-behandlade epidermala ark (Figur 4A). Denna behandling helt återställd smittsam visar att förbehandling med hämmare inte stör lönsamhet vävnaden.
Med hjälp av musmodeller vi riktar medverkan av nectin-1 och herpesvirus inträde medlare (HVEM) som cellulära receptorer för HSV-1 i epidermis 10. Båda proteinerna är kända för att fungera som effektiva receptorer för HSV i olika cellinjer 20,21, och de är tillräckliga för sjukdomsutveckling i möss 22. Vi bestämde epidermis-specifika roller nectin-1 och HVEM som HSV1-receptorer 10. Efter flytande epidermala ark från vildtyp, nectin-1- eller HVEM-brist möss på virusinnehållande mediet, var hela fästen ställdes vid 3 h pi att visualisera antalet infekterade celler. Jämförelsen av interfollikulära epidermises visar att endast nectin-1-brist minskat dramatiskt antalet ICP0-uttryckande celler (Figur 4B). Dessutom viral spridning var ganska begränsad i avsaknad av nectin-1 som visas i kryosnitt på 18 timmar pi (Figur 4C). För kvantifiering av de infekterade cellerna, är det viktigt att kontrollera om antalet infekterade celler är jämnt fördelad över interfollikulära epidermis eller om kluster av infekterade celler observeras. I nectin-1-brist epidermis till exempel infektionseffektiviteten varierade med ca 10% infektion i vissa områden och cirka 30% i övriga områden i interfollikulära epidermis 10. Därför bestämde vi oss för to ge några siffror för infekterade celler för att visa en minskning av infektion, men förekommer hela monteringar som kvalitativa data.
Figur 1:. Visualisering av infekterade celler i epidermal sektioner eller hela fästen Klicka här för att se en större version av denna siffra.
På toppen är ett system som visar kompletta vuxen hudprover, epidermala sektioner efter separation från dermis och epidermala hela monteringar med den synliga ytan av basal keratinocytlager. Pilen pekar på en hårsäck och stjärnan indikerar interfollikulära epidermis. Hudprover och epidermala ark framställda från tre veckor gamla möss infekterades med HSV-1 vid ungefär 100 PFU / cell och fastställas till 1,5 eller 3 hr pi Prover stained med anti-ICP0 (grön) efter skeninfektion eller vid 1,5 eller 3 h pi att visualisera infekterade celler, och motfärgning av kärnorna med DAPI (blå) visar alla celler i de olika skikten. Som en kontroll, skeninfekterade kompletta hudprover som visas i jämförelse med infekterade prover vid 3 h pi visar ingen ICP0 färgning (vänstra delen). Mock-infekterade eller infekterade epidermala ark framställda såsom kryosnitt visas i den mellersta delen. Epidermala hela monteringar infekterade under 1,5 eller 3 timmar visas på den högra delen. Bar, 25 pm (kryosektioner), och 40 pm (hela fästen).
Figur 2:. Keratin 14 färgning av epidermala hela monteringar efter inkubation med olika koncentrationer av dispas II epidermis från C57BL / 6 eller B6.A2G-Mx1 möss separerades från dermis med dispas II. Epidermala hela fästen färgades med anti-keratin 14 (röd) och DAPI (blå). Epidermala ark inkuberades med 5 mg / ml (A, B) eller 2,5 mg / ml (C) dispas II för 30 min vid 37 ° C. Bar, 25 ^ m. Förkortningar:. Hårsäckar (HF), interfollikulära epidermis (IFE), talgkörtelaktiviteten (SG) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Visualisering av ICP0 uttryck i hela monteringar av nyfödda eller vuxna epidermis System illustrerar epidermala hela monteringar med hårsäckar eller utvecklings hårsäckar, visar den synliga ytan av basalskiktet från vuxna och nyfödda epidermises, respektive. Epidermala ark infekterades med HSV-1 vid ungefär 100 PFU / cell och hela monteringar färgades medanti ICP0 (grön) och med DAPI (blå) vid 3 h pi Som kontroll var oinfekterade epidermala hela monteringar från vuxen svans hud färgas endast med sekundär antikropp som visar den icke-specifik färgning av talgkörtlarna. Bar, 25 ^ m. Förkortningar: utveckling av hårsäcken (DHF), hårsäcken (HF), interfollikulära epidermis (IFE), talgkörtelaktiviteten (SG). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Bedömning av effekten av cellulära faktorer genom att använda antingen hämmaren MβCD eller nectin-1- eller HVEM-brist epidermises (A) Epidermala ark från vuxna svans hud 3 veckor gamla WT möss (C57BL / 6) förbehandlades med MβCD (20 mM) och infekterades med HSV-1 vid approxifär 100 pfu / cell. Som en kontroll, var obehandlade epidermala ark smittas och epidermala ark förbehandlade med 35 mM MβCD behandlades med 500 | ig / ml kolesterol före infektion. Epidermala hela monteringar färgades med anti-ICP0 (grön) och med DAPI (blå) vid 3 h pi till demonstrera antalet infekterade celler efter utarmning av kolesterol genom MβCD behandling. Såsom visas i fig 3, är färgningen av talgkörtlar (SG) ospecifik. Förkortningar: HF (hårsäcken), IFE (interfollikulära epidermis), SG (talgkörtel). Bar, 150 | am. (B) Vuxen tail epidermises av wt (C57BL / 6), nectin-1- 23 eller HVEM-brist möss 24 (1 månader gamla) infekterades vid ungefär 100 pfu / cell. Epidermala hela monteringar färgades med anti-ICP0 (grön) och med DAPI (blå) vid 3 h pi (C) Kryosnitt av epidermala ark från wt (C57BL / 6) eller nectin-1-brist möss 23 färgades vid 18 h pi resÜLTS som visas i (B) och (C) ändras från referens 10. I A, B och C konfokala prognoser och sammanslagna bilder visas. Bar, 150 m (A), och 25 nm (B, C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
När epidermala ark av vuxen hud från C57BL / 6 infekteras med HSV-1 vid ungefär 100 pfu / cell, observerar vi infektion i nästan alla celler i det basala skiktet i de interfollikulära huden medan lägre virusdoser korrelerar med mindre infekterade celler och en långsammare framsteg för infektion. I allmänhet hårsäckar visar ett variabelt antal av infekterade celler; medan de flesta av de ganska små keratinocytema kantar utvecklings hårsäckarna är smittade, är bara håret groddar av den vuxna hårsäcken helt smittade. Beroende på hur mild separation av epidermis genom intäkterna dispas II behandling, delar av hårsäckarna vilse. I de flesta fall är keratinocytceller skikten mellan talgkörtlar och interfollikulära epidermis saknas och skiktet kantar yttre rot slidor kan störas. I varje fall kan förfarandet att separera epidermis från dermis och infektionseffektiviteten varierar från en musstam med en annan ( Sammantaget är den utmaning som ex vivo infektionsanalysen förberedelser och underhåll av epidermala arken. Bräcklighet vävnaden kräver mycket noggrann hantering och styr hur väl vävnaden bevaras efter separation från dermis. En annan fråga är den begränsade lönsamheten för arken i kultur. Eftersom cellviabilitet minskar med tiden, bör infektionsexperiment utföras direkt eller åtminstone 3 timmar efter framställning av bladen. Förutom den murina huden, kan epidermala ark även framställas från humana hud eller slemhinna prover. Beroende på naturen och tjockleken av epidermis har den dispas behandling som skall anpassas. För att följa infektionsförloppet, är det lämpligast att visualisera infekterade celler i kryosektioner. Man måste komma ihåg att med hög PFU / cell och längre tider för infektion, epidermala arken starta någon form av disintegraning. Baserat på den cytopatiska effekten, celler runda upp och cell-cell kontakter blir störd. Vid 24 h pi med 100 PFU / cell, skulle vissa infekterade basalceller vilse, vilket också kan bero på dispas II behandlingen. Med lägre PFU / cell, kan infektionstider utökas utan att det leder till allvarliga vävnadsskador. Alternativt kan skadans omfattning användas som markör för hur patogena olika virusstammar är. Vi föredrar att visualisera infekterade celler genom färgning ICP0 uttryckning. Fördelen är en ganska tidig upptäckt av infekterade celler, och baserat på ICP0 färgningsmönstret, kan celler i ett tidigt skede under infektion skiljas från dem i ett framskridet stadium. Alternativt kan infekterade celler visualiseras genom färgning uttryck av andra tidiga gener såsom det virala kapsidproteinet VP5 och det virala höljesproteinet gD. Vi försökte också att visualisera inkommande viruspartiklar före viral genuttryck antingen genom infektion med GFP-märkt HSV-1 eller genom färgning kapsider i fasta prover. Enligt vår erfarenhet, mönstret av GFP-fluorescens eller färgningsmönstret i vävnadssnitt är alltför komplexa för att tydligt visa närvaron av internaliserade viruspartiklar. Alternativt kan viruspartiklar visualiseras genom elektronmikroskopi, när höga virustitrar av ~ 1000 - 1500 pfu / cell användes. Vid lägre virus dos, kan viruspartiklar knappast upptäckas. I stället för att visualisera infekterade celler i intakta epidermala ark, kan epidermis dissocieras för att analysera RNA-nivåer eller kvantifiera antalet celler med ytan, cytoplasmatisk eller nukleär expression av gener av intresse genom FACS-analys. Vi antar att detta ex vivo infektion protokoll kan anpassas åtminstone för de virus som är kända för att infektera basala keratinocyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi tackar Peter Staeheli för att ge B6.A2G-MX1 möss och Semra Özcelik för teknisk rådgivning.
Detta arbete stöddes av det tyska Research Foundation genom SFB829 och KN536 / 16, och Köln Fortune Program / Medicinska fakulteten vid universitetet i Köln.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/high glucose/GlutaMAX | Life Technologies | 31966047 | needed for cultivation of epidermal sheets |
| dispase II powder | Roche | 4942078001 | has to be solved in heated PBS |
| enzyme-free cell dissociation solution | Sigma | C5914 | needed for very gentle dissociation of epidermal sheets |
| TrypLE select cell dissociation solution | Life Technologies | 12563-029 | needed for dissociation of epidermal sheets |
| chelex 100 resin | Bio-Rad | 142-2832 | needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum |
| gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7765 | needed for minimization of non-specific antibody binding |
| Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml) | Covance | PRB-155P | used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis |
| Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml) | Life Technologies | A-11029 | used as secondary antibodies |
| Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml) | Life Technologies | A-21429 | used as secondary antibodies |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride) (conc.: 0.1 mg/ml) | Sigma | 36670 | used to counterstain the nucleus |
References
- Koelle, D. M., Corey, L. Herpes simplex: insights on pathogenesis and possible vaccines. Annu. Rev. Med. 59, 381-395 (2013).
- Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J. Herpes simplex Viruses. Fields Virology. , 6th edition, 1823-1897 (2013).
- Syrjänen, S., Mikola, H., Nykänen, M., Hukkanen, V. In vitro establishment of lytic and nonproductive infection by herpes simplex virus type 1 in three-dimensional keratinocyte culture. J. Virol. 70, 6524-6528 (1996).
- Visalli, R. J., Courtney, R. J., Meyers, C. Infection and replication of herpes simplex virus type 1 in an organotypic epithelial culture system. Virology. 230, 236-243 (1997).
- Hukkanen, V., Mikola, H., Nykänen, M., Syrjänen, S. Herpes simplex virus type 1 infection has two separate modes of spread in three-dimensional keratinocyte culture. J. Gen. Virol. 80, 2149-2155 (1999).
- Gescher, K., et al. Inhibition of viral adsorption and penetration by an aqueous extract from Rhododendron ferrugineum L. as antiviral principle against herpes simplex virus type-1. Antiviral Res. 82, 408-413 (2010).
- Petermann, P., Haase, I., Knebel-Mörsdorf, D. Impact of Rac1 and Cdc42 signaling during early herpes simplex virus type 1 infection of keratinocytes. J. Virol. 83, 9759-9772 (2009).
- Everett, R. D., Maul, G. G. HSV-1 IE protein Vmw110 causes redistribution of PML. EMBO J. 13, 5062-5069 (1994).
- Chrostek, A., et al. Rac1 is crucial for hair follicle integrity but is not essential for maintenance of the epidermis. Mol. Cell. Biol. 26, 6957-6970 (2006).
- Petermann, P., et al. Entry mechanisms of Herpes Simplex Virus Type 1 into murine epidermis: Involvement of nectin-1 and HVEM as cellular receptors. J. Virol. 89, 262-274 (2015).
- McGeoch, D. J., et al. The complete DNA sequence of the long unique region in the genome of herpes simplex virus type 1. J. Gen. Virol. 69, 1531-1574 (1988).
- Schelhaas, M., Jansen, M., Haase, I., Knebel-Mörsdorf, D. Herpes simplex virus type 1 exhibits a tropism for basal entry in polarized epithelial cells. J. Gen. Virol. 84, 2473-2484 (2003).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130, 5241-5255 (2003).
- Rahn, E., Petermann, P., Hsu, M. J., Rixon, F. J., Knebel-Mörsdorf, D. Entry pathways of herpes simplex virus type 1 into human keratinocytes are dynamin- and cholesterol-dependent. PLoS One. 6, e25464 (2011).
- Everett, R. D., Cross, A., Orr, A. A truncated form of herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 is expressed in a cell type dependent manner. Virology. 197, 751-756 (1993).
- Horisberger, M. A., Staeheli, P., Haller, O. Interferon induces a unique protein in mouse cells bearing a gene for resistance to influenza virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 1910-1914 (1983).
- Christian, A. E., Haynes, M. P., Phillips, M. C. Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. J. Lipid Res. 38, 2264-2272 (1997).
- Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. Effects of cholesterol depletion by cyclodextrin on the sphingolipid microdomains of the plasma membrane. Biochem. J. 335, 433-440 (1998).
- Yancey, P. G., et al. Cellular cholesterol efflux mediated by cyclodextrins: Demonstration of kinetic pools and mechanism of efflux. J. Biol. Chem. 271, 16026-16034 (1996).
- Montgomery, R. I., Warner, M. S., Lum, B. J., Spear, P. G. Herpes simplex virus-1 entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family. Cell. 87, 427-436 (1996).
- Geraghty, R. J., Krummenacher, C., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Spear, P. G. Entry of alphaherpesviruses mediated by poliovirus receptor-related protein 1 and poliovirus receptor. Science. 280, 1618-1620 (1998).
- Taylor, J. M., Lin, E., Susmarski, N., Yoon, M., Zago, A., Ware, C. F., Pfeffer, K., Miyoshi, J., Takai, Y., Spear, P. G. Alternative entry receptors for herpes simplex virus and their roles in disease. Cell Host Microbe. 2, 19-28 (2007).
- Barron, M. J., Brookes, S. J., Draper, C. E., Garrod, D., Kirkham, J., Shore, R. C. The cell adhesion molecule nectin-1 is critical for normal enamel formation in mice. Hum. Mol. Genet. 17, 3509-3520 (2008).
- Wang, Y., Subudhi, S. K., Anders, R. A., Lo, J., Sun, Y., Blink, S., Wang, Y., Liu, X., Mink, K., Degrandi, D., Pfeffer, K., Fu, Y. X. The role of herpesvirus entry mediator as a negative regulator of T cell-mediated responses. J. Clin. Invest. 115, 711-717 (2005).
