Abstract
Insan ana girmek için, herpes simpleks virüsü tip 1 (HSV-1), mukoza yüzeyleri, deri ya da kornea engeli aşmak gerekir. HSV-1 hedefleri ilk girişi sırasında keratinositler ve nöronların latent enfeksiyon takip eder epitel, bir ilköğretim enfeksiyon oluşturur. Reaktivasyonu sonra, virüsler deri veya mukozal ülserler veziküller olarak görünür mukokutanöz sitelerde belirgin hale gelebilir. HSV-1 deri veya mukoza işgal ve ulaştığı Nasıl onun reseptörleri tam olarak anlaşılamamıştır. Hücresel düzeyde epidermal doku içine HSV-1 işgali rota araştırmak için, deride primer ve tekrarlayan enfeksiyon siteyi temsil eden fare epidermisin bir ex vivo enfeksiyon modeli kurdu. Tahlil fare deri hazırlanmasını içermektedir. Epidermis dispaz II muamele ile dermis ayrılır. Virüs içeren ortam üzerinde epidermal yüzer tabaka sonra, doku sabittir ve enfeksiyonunun çeşitli zamanlarda İnokulasyonu de görselleştirilebilirHSV-1-erken proteini ICP0 karşı bir antikor ile enfekte olmuş hücrelerin boyanması. ICP0 sentezleyen hücrelerin 1,5 saat İnokulasyonu zaten bazal keratinosit tabakada gözlenebilir. Uzun enfeksiyon süreleri ile enfekte olan hücreleri enfeksiyon bazal keratinositler sınırlı, ancak virüs dokusunda diğer katmanlarına yayılır olmadığını belirten suprabazal katmanlarında tespit edilir. Çeşitli fare modellerinin epidermal sayfaları kullanarak, enfeksiyon protokolü dokusu içine HSV-1 işgali katkıda hücresel bileşenlerin katılımı belirleyen verir. Ek olarak, analiz, ilk giriş adımları müdahale doku inhibitörleri, hücre-hücre yayılması ve virüs üretimini test etmek için uygundur. Burada, detaylı ex vivo enfeksiyon protokol açıklar ve adiponektin-1- veya HVEM eksik fareler kullanarak sonuçlarını sunmak.
Introduction
Herpes simpleks virüsü (HSV) yaşamı tehdit eden enfeksiyonların hafif komplike deri ve mukoza lezyonları, insanlarda çeşitli hastalıklara yol açabilir. HSV tip 1 (HSV-1), baskın olarak daha çok genital enfeksiyonlar 1 neden HSV tip 2 (HSV-2) ise, orofasyal enfeksiyonlar ve ensefalit ile ilişkilidir. HSV, kültür hücreleri girer enfeksiyon başlatır ve viral döl üreten nasıl anlaşılmasında önemli bir ilerleme olsa da, biz hücresel düzeyde 2'de doku içine viral invazyonu yolunun (ler) hakkında çok az şey biliyoruz. HSV deri ya da mukoza enfeksiyonu, farelerin çalışmaları için, tavşan ve gine domuzları, hayvan modelleri olarak kullanılmıştır. Cilt enfeksiyonu intradermal enjeksiyonu ile veya virüs varlığında cilt çizilmemesi tarafından kurulmuş ve hastalık gelişimi virüs üretimi ile ilişkili olduğu saptandı. Bu yöntemler hastalığın patogenezinde çeşitli yönlerini anlamasına yardım ve antiviral ilaçlar değerlendirmek için kullanılır. Tissu'nun HSV enfeksiyonu araştırmake düzeyi organotipik insan derisi modelleri uygulanmıştır. Enfeksiyon oranı, bu Sal kültürlerinde sınırlıdır gibi, enfeksiyon, viral yayılmayı çok çalışma yapılmış ve antiviral bileşenlerin etkileri sadece sınırlı sayıda 3-6 yayınlanmıştır.
Sağlam epitel HSV-1 enfeksiyon esnasında bir rol oynayabilir, hücresel belirleyicilerini karakterize etmek için, sıçangil epidermis 7 ex vivo enfeksiyon çalışmalar için bir protokol kurulmuştur. Cilt yenidoğan veya yetişkin farelerin kuyrukları hazırlandı. HSV-1 virüsü içeren bir ortamda batık bulundu komple deri örnekleri, enfekte olabilir bu yana, biz dispase II muamele ile epidermis, dermis ayrılmış. Virüs içeren ortam üzerinde epidermal tabakaların kayan sonra, enfekte olmuş hücreler, çeşitli katı İnokulasyonu (pi) 7 de epidermal bazal tabakasında, görüntülenebilir. Viral replikasyon a önce tek tek hücrelerin enfeksiyonunun başlamasını görselleştirmek içinnd virüs üretimi, HSV-1 enfeksiyon sırasında ifade edilen ilk proteinlerden biridir enfekte hücre proteini 0 (ICP0) karşı bir antikorla boyanmıştır. ICP0 hücresel lokalizasyonu, erken enfeksiyon sırasında farklı faz geçer. ICP0 viral gen ifadesinin erken aşamasında, nükleer odaklarda mevcut iken, sitoplazma ICP0 bir yerelleştirme enfeksiyonu 8 müteakip bir faz gösterir.
Biz enfeksiyon sırasında çeşitli hücresel faktörlerin potansiyel rolünü test etmek için farklı fare modelleri epidermal yaprak ex vivo enfeksiyon deneyi kullanıldı. Aktin dinamiklerinin önemli bir regülatör olarak Rac1 etkisini gidermek için, biz Rac1 gen 9 bir keratinosit özgü silinmesi ile farelerin epidermis bulaşmış. Bu model epidermal keratinosit katmanları HSV-1 enfeksiyonu verimliliği üzerinde eksik Rac1 sonuçlarını incelemek için bize izin verdi. Yeniden kontrol littermates enfekte epidermis karşılaştırmaRac1 olmaması epidermis 7 bazal tabakasında enfeksiyonun başlaması üzerinde etki gösteren, anlamlı bir fark bozukluk saptanmadı. Daha fazla fare modellerinin kullanımı bize hücresel reseptörler epidermis içine girişini arabuluculuk hangi adrese izin verdi. HSV-1 ile adiponektin-1- ya da HVEM-eksikliği olan farelerde birinden epidermal yaprak bulaşmasını doku içine ilk viral girişi güçlü adiponektin-1 10 varlığına bağlıdır olduğunu ortaya koymuştur. Ayrıca, sonuçlar, aynı zamanda HVEM adiponektin-1 10 kadar verimli değildir, sıçangil epidermiste reseptör olarak görev yapabilir göstermektedir.
Epidermal katmanlar durumunda enfekte olan hücreler uzamsal dağılımını çözmek için, doku bölümleri ve epidermal bütün tamponla (Şekil 1) ICP0 tanımının görüntülenmesi. Tüm deri cryosections, hiçbir ICP0-ifade eden hücreler (Şekil 1) tespit edilir. Bunun aksine, epidermal tabakaların cryosections sitoplazmik göstermektedirZaten 3 saat pi (Şekil 1) bazal tabakada ICP0 ifade. Daha sonra zamanlarda, viral görüntülenebilir katmanları suprabazal yayılma. Bazal tabakasında enfekte hücrelerin mekansal dağılımı kolayca epidermal bütün bağlar (Şekil 1) takip edilebilir. HSV-1 100 PFU / hücre de enfeksiyon üzerine, interfolliküler epidermisin bazal keratinositlerin yaklaşık olarak% 50 bir çok enfekte hücreleri nükleer ICP0 ifade Bu zaman noktasında 1.5 saat pi de ICP0 ekspresyonunu göstermektedir. Erken gen ekspresyonunun daha sonraki bir aşamaya işaret sitoplazmaya ICP0 bir yerelleştirme 3 saat pi (Şekil 1) hemen hemen bütün hücrelerde bulunur. Ex vivo HSV-1 enfeksiyonu üzerine bulaşmış hücrelerin görselleştirme Bu modlar inhibitörleri veya doku viral girişi ve yayılması / silinmiş mutasyona uğramış hücre bileşenlerinin etkisini araştırmak için güçlü bir tahlil sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik bildirimi.
Kurban hayvanlardan epidermal tabakaların hazırlanması Landesamt für Natur, Umwelt ve Verbraucherschutz, Northrhine-Vestfalya (Almanya) ve Kılavuz önerileri ile tam uyum içinde yürütülür. Çalışma LANUV NRW (Sayı 8.84-02.05.20.13.018) tarafından onaylanmıştır.
Göstergeler ve Kültür Medya 1. Hazırlık
- Dulbecco değiştirilmiş Eagle ortamı (DMEM) / yüksek glukozlu glutamin dipeptid,% 10 FCS, 100 lU / ml penisilin içeren ve / ml streptomisin, 100 ug (bundan sonra "DMEM" olarak anılacaktır), epidermal yaprak geliştirin.
- Epidermal tabakaların hazırlanması için, dikkatli bir şekilde ısıtılmış PBS (kadar 37 ° C) 'de dispaz II tozu (5 mg / ml) çözülür. 0.22 um'lik bir filtreden filtre edin ve solüsyonu tedavisi için doğrudan kullanılır.
- Epidermal bütün hazırlanması 13 bağlar için, buff bloke hazırlanması% 0.5 süt tozu, soğuk su balıkları deri ve TBS içinde% 0.5 Triton X-100 ile% 0.25 jelatin ile er. Maddeler bir döner mikser üzerinde oda sıcaklığında en az 2 saat süre ile kuluçkaya bırakılması ve erimesine izin verir. Ayrıca yıkama tamponu gibi PBS içinde Tween 20% 0.2 hazırlar. Tespit için,% 3.4 ve PBS içinde% 4 formaldehit hazırlar.
- Cryosections immün için,% 5 normal keçi serumu ve% 0.2 Tween 20, PBS tamponu ile bloke hazırlar. Tespit için, PBS içinde% 0.5 Formaldehit hazırlar.
Fare Skin gelen Epidermal Levhaların 2. Hazırlık
- Enfeksiyon çalışmaları için yeni doğan arka deri epidermis hazırlanması
- Bir diseksiyon çanak içine bir decapitated fare (1 ila 3 gün doğumdan sonra) yerleştirin ve ekstremitelerde kesti ve gövde yakın kuyruk tam gövde derinin etkili kaldırılmasını sağlamak için. Ekstremite kaldırılması sırasında, çapı mümkün olduğunca küçük kesikler tutmaya çalışın.
- Kavisli ince forseps a ile gövde Fixyavaşça gövdeden cilt ayırmak için sırt boyunca kaudal kafatasın deri altına künt uçlu makas hareket nd. Sırt boyunca cildi kesti.
- FACS analizi, keratinositlerin veya RNA hazırlanması izolasyonu için gövde itmek doku ve kör uç makas düzeltmek için forseps kullanarak gövde komple deri soyulabilir. Cryosections veya tüm bağlar hazırlanması için arka cilt sadece parçalara ayırın.
- Yaklaşık 10 x 10 mm 1-2 parçaya bir neşter ile arka cilt doğrayın. ~ 1 ml steril PBS ile 6 oyuklu plakanın bir kuyuda parçaları koyun. Dermal tarafı dibe baktığından emin olun.
- 1.5 mi dispase II (5 mg / ml PBS) ile PBS yerine yerleştirin ve 4 ° C / 30 (tam araç için olan) 37 ° C'de min veya O biri için N inkübe edin. 3 kez PBS ile yıkayın. Yavaşça epidermisin kaldırmaya yatan dermis ve diğer forseps düzeltmek için bir forseps kullanarak bozulmamış levha olarak epidermis kaldırın. Bu adımı EAS yapmak için bir Dürbünü kullanıny. Alt yönelik bazal tarafı ile DMEM içine epidermal sayfasını aktarın. Enfeksiyon deneyler için hemen yapraklarını kullanın.
Not: özellikle, FACS analizi, keratinositlerin veya RNA hazırlanması izolasyonu için yeni doğmuş deriden epidermis hazırlanmasını kullanın. Nedeniyle kırılganlık, cryosections veya bütün araç için olan enfekte edilmiş tabakaların hazırlanması daha az uygundur.
- Enfeksiyon çalışmaları için yetişkin kuyruk ciltten epidermis hazırlanması
- Servikal dislokasyon ile 1 ila 3 aylıkken fareler Euthanize. Sırtında uzun gömülü saç folikülleri bozulmamış epidermal yaprak ayrılmasını engelleyen beri yerine arka cilt kuyruk alın. Kurban farelerden alınan kuyruk kesti ve bir neşter ile uzunlamasına onu yarık.
- Kemikten deri soyulabilir ve yaklaşık 5 x 5 mm parçalar halinde bir neşter ile doğrayın. Tek kuyuda 4 adet koyun ve 2.1.5 bölümünde anlatıldığı gibi dispase II inkübasyon devam
NOT: yetişkin tail deri cryosections veya tüm bağlar hazırlamak. Seçenek olarak acil kullanım için, kuyruk depolanmış ya da önemli enfeksiyonun etkinliğini kaybetmeden 4 ° C'de yaklaşık 24 saat süre ile nakledilebilir. Kuyrukları 48 saat kadar tutulur ise, epidermal yaprak pek HSV-1 ile enfekte olabilir.
- FACS analizi için, epidermisin ayrışma
Not: FACS analizi ile yüzey proteini ifade Algılama hücre yüzeyi ile ilgili proteini zarar vermeyen uygun bir hücre ayrışma teknikleri gerektirir.- Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 1.5 ml / oyuk rekombinant tripsin-bazlı hücre ayrışma çözeltisi ve 37 ° C'de 15 dakika boyunca taban yüzü, bir 6-yuvalı plaka içinde yeni doğmuş epidermal yaprak inkübe edin.
- 3 ml DMEM ekleyerek inkübasyon durdurun. Keratinositler çözülmüş olsun şekilde hafifçe 6-çukurlu plaka içindeki epidermis taşımak için kavisli bir ince forseps kullanılarak keratinositler ayrıştırmaları. Hücre süspansiyonu toplayın ve bu adımı 3 kez tekrarlayınher zaman taze DMEM kullanarak.
NOT: Bu ayrılma işlemi keratinositlerin yüzeyinde adiponektin-1 tespit etmek için uygundur. - Seçenek olarak ise, oda sıcaklığında 15 dakika ve 37 ° C'de 15 dakika boyunca enzimsiz hücre ayrışma çözeltisi epidermal yaprak (CDS) inkübe edilir. Yavaşça yukarı ve aşağı CDS pipetleme keratinositler dışarı floş oda sıcaklığında 15 dakika inkübe başka.
- Hücre süspansiyonu toplayın ve taze DMEM kullanılarak yıkama adımı 3 kez tekrarlayın.
NOT: Bu ayrılma HVEM yüzey ekspresyonunu tespit etmek için uygundur. CDS çözümün dezavantajı daha az hücre rekombinant tripsin-bazlı hücre ayrışma çözeltisi ile daha ayrışmış olmasıdır. Buna ek olarak, rekombinant tripsin-bazlı hücre ayrışma çözeltisi ile enfekte epidermal tabakaların disosiasyon sonra sentezleme gibi ICP0 ifadesi olarak çekirdek ya da sitoplazmik sentezlenmesi FACS ile analiz edilebilir yüzey.
- Epidermisin Ayrılma keratinositler veya ex izole etmekyolu RNA
- 1,5 ml / oyuk rekombinant tripsin-bazlı hücre ayrışma çözeltisi içeren çanak tabanına doğru taban yüzü, bir 6-yuvalı plaka içinde yeni doğmuş epidermal yaprak koyun. Oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir. 3 ml DMEM ekleyin ve hafifçe çanak epidermis taşımak için kavisli ince forseps kullanarak keratinositler ayırmak.
- Hücre süspansiyonu toplayın ve taze DMEM kullanarak bu adımı 3 kez tekrarlayın. RNA veya kültür birincil fare keratinositlere ayıklamak için bu hücre süspansiyonu kullanın.
HSV-1 ile epidermal Levhaların 3. Enfeksiyon
- 500 ul DMEM daha az HSV-1 ağırlık suşu 17 11 içeren bir çözelti hazırlanması ve epidermal tabakalar kayan olan virüs çözeltisi orta yerine. Bu zaman noktası, zaman 0 12 olarak tanımlanır. 37 ° C'de 24 oyuklu plakanın bir kuyuda bir epidermal tabakasının enfeksiyonu gerçekleştirin. Virüs titresi hesaplanması tahmini sayısına dayanırepidermal tabaka başına taban tabakadaki hücrelerin (yaklaşık olarak 5 x 5 mm levha başına 2 x 10 5 hücre).
- HSV-1, yaklaşık 100 plak oluşturucu birimler (PFU) / hücre ile enfekte ve sonra 1 saat pi de DMEM virüs içeren ortam yerine
NOT: Yenidoğan cilt epidermal yaprak durumunda, yaprak inkübasyon sırasında ayırmak başlar unutmayın.
Enfekte hücreler 4. Görselleştirme
- Epidermal Tüm Mounts 13
- % 3.4 formaldehid, 4 ° C'de, oda sıcaklığında ya da O / N, 2 saat süre ile epidermal yaprak sabitleyin. PBS ile iki kez yıkanır ve% 0.5 süt tozu, soğuk su balıkları deri ve oda sıcaklığında 14 1 saat boyunca, TBS içinde% 0.5 Triton X-100 ile% 0.25 jelatin ile bloklayın.
- 15, oda sıcaklığında bloke edici tampon içinde 1:60 oranında seyreltilen fare anti-ICP0 (monoklonal antikor 11.060) sahip levhalar O / N inkübe edin. Ara filaman ağını görselleştirmek için tavşan poliklonal ile eş zamanlı olarak kuluçkaya antiFare keratin 14 (100 ng / ml).
- Oda sıcaklığında 4 saat boyunca PBS% 0.2 Tween 20 ile 4 ila 5 kez yıkayın. O / N AF488 konjuge edilmiş anti-fare IgG (1 ug / ml), AF555-konjüge edilmiş anti-tavşan IgG (1 ug / ml) ve DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) (100 ng inkübe oda sıcaklığında bloke edici tampon içinde / ml).
- Oda sıcaklığında 4 saat boyunca PBS% 0.2 Tween 20 ile yıka. Bir örnek slayt üstünde bazal tarafı Mount epidermal yaprak, floresan montaj orta embed ve lamelleri ile kaplayın.
- Epidermal Cryosections
- Yetişkin epidermal tabakalar oda sıcaklığında 20 dakika boyunca PBS içinde% 4 formaldehit içinde sabitleştirildi, PBS ile 2 kez yıkanmıştır. Dokuda göm sabit levhalar sıvı azot içinde orta ve donma donma. Bir cryomicrotome ile 8-10 mikron bölümleri kesin.
- Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde% 0.5 Formaldehit ile tekrar bölümler saptamak PBS, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS içinde% 5 normal keçi serumu ve% 0.2 Tween 20 ile blok ile 2 kez yıkanır ve daha sonra m, 60 dakika boyunca lekeAnti-ICP0 (monoklonal antikor 11.060) 15 bloke edici tampon ile yıkanarak 3 kez, ardından bloke tamponu içinde 1:60 seyreltilmiş OUSE.
- Daha sonra oda sıcaklığında, 45 dakika süre ile blokaj tamponu AF488 konjuge edilmiş anti-fare IgG (1 ug / ml) ve DAPI (100 ng / ml) ile inkübe edilir ve 3 kez yıkayın. Floresan montaj orta bölümleri göm ve lamelleri ile kaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yöntemin meydan HSV-1 bazal tabakadan nüfuz içine epidermal yaprak hazırlamaktır. Kritik bir adım fare suşu bağlı adapte edilmesi gerekir dispase II tedavi ile dermis epidermis ayrılmasıdır. Dispase II konsantrasyonu 2.5 ile 5 mg / ml, ve 20 ila 45 dakika ile fırınlama süresi aralığında olabilir. Ara filaman protein keratin 14 boyama kolayca bazal epidermal tabaka enfekte veya enfekte olan hücreleri (Şekil 2), sadece çok sınırlı sayıda gösterecektir olmadığını edilip edilemeyeceğini tahmin verir. İdeal olarak, epidermal bütün bağlar keratin 14 boyama basal hücrelerde (Şekil 2A) sağlam bir tabaka göstermelidir. En kötü durumda, dispase II tedavi bazal tabaka bozulur ve (Şekil 2B ayrışmış olan keratin bazal keratinositler 14-ifade olduğunu belirten interfolliküler epidermis lekeli hiçbir hücre vardır 16 (Şekil 2B) . 14 lekeleme (Şekil 2C) keratin ile görselleştirildiği gibi sadece 30 dakika boyunca 2,5 mg / ml dispase II indirgemeden sonra, sağlam bir taban tabakası elde edilmiştir.
Cilt yetişkin farelerin kuyrukları alındığında Çünkü epidermis uzantıları olarak yoğun saç foliküllerinin, dermis epidermis ayrılması en uygundur. Inkübasyondan sonra yaprak kırılganlığı analiz bölgelerinin boyutunu da sınırlar, ancak alternatif olarak, saç köklerinin gelişen yeni doğmuş farelerin arka deri, kullanılabilir. Şimdiye kadar, HSV-1 enfeksiyonuna verimliliğinde herhangi bir fark epidermis (Şekil 3) Yeni doğmuş veya yetişkin farelerden alınmıştır bağlı olarak fark edilmiştir. Yeni doğmuşlar Whole bağlarrn epidermis verimli interfolliküler epidermisin enfeksiyon yanı sıra gelişmekte olan saç köklerinin döşeyen yoğun paketlenmiş hücre olarak (Şekil 3) görselleştirmek. Yetişkin epidermis interfolliküler epidermis verimli enfekte iken, saç mikropları ve saç foliküllerinin dış kök kılıflarının sadece parçaları (Şekil 3) enfekte olmaktadır. Enfekte olmamış kontrollere (Şekil 3) de gösterildiği gibi saç mil altında yağ bezleri nedeniyle her zaman ikincil antikor spesifik olmayan boyama, ancak, bu, boyanır.
Inhibitör çalışmaları kullanılarak biz kolesterol epidermise HSV-1 girişi için bir rolü olup olmadığını araştırıldı. Yetişkin farelerin epidermal tabakalar plazma zarının 17-19 kolesterol tüketen metil-β-siklodekstrin (MβCD) ile önceden muamele edilmiştir. Enfeksiyondan önce, MβCD viral envel kolesterol üzerinde herhangi bir etkiye tüketen önlemek için çeşitli yıkama adımları ile çıkarıldıope. Ön-muamele üzerine 20 mM ile hemen hemen hiç enfekte olmuş hücreler interfolliküler epidermis ya da saç mikrop ya görüldü ama yağ bezleri sadece spesifik olmayan bir lekelenmesi görünmüştür (Şekil 4A) idi MβCD. Doku inhibitörü muamele ile zarar görmemiş olduğunu, bir kontrol olarak, MβCD ile muamele edilmiş yaprak epidermal (Şekil 4A) doldurmak için 500 ug / ml kolesterol ilave edildi. Bu tedavi tamamen inhibitör ile tedavi öncesi dokusunun canlılığı müdahale etmediğini gösteren enfeksiyon restore.
Fare modelleri kullanılarak epidermis 10 HSV-1 için adiponektin-1 ve hücresel reseptör olarak herpes virüsü giriş aracı (HVEM) tutulumunu ele alındı. Her iki protein de, çeşitli hücre çizgileri 20,21 HSV için etkili reseptörleri olarak işlev gördükleri bilinmektedir ve fareler 22 hastalık gelişimi için yeterli vardır. Biz HSV- olarak adiponektin-1 ve HVEM epidermis özgü roller belirlenmiş1 reseptörleri 10. Virüs içeren ortam üzerinde vahşi tipli, adiponektin-1- ya da HVEM-eksikli fareden epidermal yüzer tabaka sonra tüm bağlar enfekte edilmiş hücre sayısını görselleştirmek için 3 saat pi hazırlandı. Interfolliküler epidermises karşılaştırılması sadece adiponektin-1 eksikliği büyük ölçüde ICP0-salgılayan hücrelerin sayısı (Şekil 4B) azalttığını göstermektedir. 18 saat pi de cryosections gösterildiği gibi ek olarak, ağız yoluyla dağıtımı adiponektin-1 yokluğunda, oldukça sınırlı (Şekil 4C). Enfekte olmuş hücrelerin miktarının için, enfekte olmuş hücrelerin sayısının eşit interfolliküler epidermis üzerinde ya da enfekte olmuş hücre kümeleri gözlenir olup dağıtılmış olup olmadığını izlemek için önemlidir. Örneğin adiponektin-1-eksikliği olan epidermis, enfeksiyon etkinliği bazı bölgelerde yaklaşık% 10 seviyesinde, enfeksiyon ve interfolliküler epidermis 10 diğer alanlarda yaklaşık% 30 ile değişiyordu. Böylece, t verdio nitel veri olarak enfeksiyon azalma, ancak mevcut bütün bağlar göstermek için enfekte hücrelerin yok numaralarını vermek.
Şekil 1:. Epidermal bölümler veya tüm bağlar enfekte hücrelerin Görselleştirme bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Üst kısmında tam yetişkin deri örnekleri gösteren bir düzendir, bazal keratinosit tabakasının görünür yüzeyi ile dermis ayrılması ve epidermal bütün bağlar sonra epidermal bölümleri. Bir saç folikülü ve yıldızı ok noktaları interfolliküler epidermis gösterir. 3 haftalık farelerden hazırlanan deri örnekleri ile epidermal tabakalar 1,5 ya da 3 saat pi Örneklerinde edildi Staine HSV-1, yaklaşık olarak 100 PFU / hücre ile enfekte edilmiş ve tespit edildiAnti-ICP0 (yeşil) mock-enfeksiyon sonrası veya 1.5 ya da 3 saat pi de d enfekte hücreleri görselleştirmek ve DAPI (mavi) ile çekirdeğinin counterstaining çeşitli katmanlarında tüm hücreleri gösteriyor etmek. Kontrol olarak, mock-enfekte komple deri örnekleri hiçbir ICP0 boyama (sol kısmı) gösteren 3 saat pi enfekte örneklere kıyasla gösterilmiştir. Cryosections olarak hazırlanan-Mock enfekte ya da enfekte epidermal yaprak orta kısmında gösterilir. 1.5 veya 3 saat enfekte epidermal bütün bağlar sağ tarafında gösterilir. Bar, 25 mikron (cryosections) ve 40 um (bütün bağlar).
Şekil 2:. Dispase farklı konsantrasyonlarda C57BL / 6 veya B6.A2G-MX1 farelerden II epidermis ile inkübasyondan sonra epidermal bütün bağlar keratin 14 boyama dispase II dermis ayrıldı. Epidermal bütün bağlar, anti-keratinositlerden ile boyandın 14 (kırmızı) ve DAPI (mavi) ile. Epidermal levhalar, 5 mg / ml ile inkübe edildi (A, B) ya da 2.5 mg / ml, 37 ° C 'de 30 dakika süre ile (C) dispaz II. Bar, 25 um. Kısaltmalar:. Kıl folikülü (HF), interfolliküler epidermis (IFE), yağ bezi (SG) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. Yenidoğan veya yetişkin epidermis bütün bağlar içinde ICP0 ifade Görselleştirme Düzenleri sırasıyla yetişkin ve yeni doğan epidermises bazal tabakanın görünen yüzeyini gösteren, saç köklerinin ile epidermal bütün bağlar gösteren veya saç folikülleri gelişmekte. Epidermal yaprak HSV-1, yaklaşık olarak 100 PFU / hücre ile enfekte edilmiştir ve bütün bağlar ile boyandıAnti-ICP0 (yeşil) ve bir kontrol olarak 3 saat pi de DAPI (mavi) ile erişkin kuyruk deriden enfekte olmamış epidermal bütün bağlar, sadece ikincil antikor yağ bezlerinin spesifik olmayan lekeler gösteren ile boyandı. Bar, 25 um. Kısaltmalar: saç folikülü (DHF), saç folikülü (HF), interfolliküler epidermis (IFE), sebase bezi (SG) gelişmekte. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. Önleyicisi MβCD ya adiponektin-1- ya da HVEM-eksikli epidermises birini kullanarak hücresel faktörlerin etkisinin değerlendirilmesi (A) 3 haftalık farelerde ağırlık (/ 6 C57BL) yetişkin kuyruk deriden Epidermal yaprak MβCD ile ön-muamele edilmiştir (20 mM) ve en approxi HSV-1 ile enfektekalıntılarından 100 PFU / hücre. Bir kontrol olarak, muamele edilmemiş yaprak epidermal enfekte edildi ve 35 mM MβCD ile önceden tedavi edilen epidermal tabakalar enfeksiyondan önce 500 ug / ml kolesterol ile muamele edildi. Epidermal bütün bağlar MβCD işlenerek kolesterol yok olmasından sonra enfekte edilmiş hücre sayısını göstermek için anti-ICP0 (yeşil) ve 3 saat pi de DAPI (mavi) ile boyanmıştır. Şekil 3 de gösterildiği gibi, yağ bezleri (SG) boyanması spesifik değildir. Kısaltmalar: HF (saç folikülü), IFE (interfolliküler epidermis), SG (sebase bezi). Bar, 150 um. (B) Yetişkin kuyruk ağırlıkça epidermises (/ 6 C57BL), adiponektin-1-23 ya da HVEM-eksikli farenin 24 (1 aylık), yaklaşık olarak 100 PFU / hücre enfekte edildi. Epidermal bütün bağlar, anti-ICP0 (yeşil) ve 3 saat pi (C), ağırlık olarak epidermal tabakaların Donuk kesitler de DAPI (mavi) (C57BL / 6) veya adiponektin-1-eksikliği olan fareler 23 18 saat pi de lekeli ile boyandı Res(B) ve (C) 'de gösterilen ka bul etmez, A, B ve C konfokal çıkıntılar olarak 10 referans değiştirilmiş ve görüntüler gösterilir birleştirilir. Bar, 150 mikron (A) ve 25 mikron (B, C). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yetişkin C57BL / deri 6 epidermal tabakalar HSV-1 ile enfekte olduğunda daha düşük virüs dozları ilişkili ise, yaklaşık olarak 100 PFU / hücre, daha az enfekte olmuş hücrelerin ve daha yavaş olan interfolliküler epidermisin bazal katmanın hemen hemen bütün hücrelerin enfeksiyonu gözlemlemek Enfeksiyonun ilerlemesi. Genel olarak, saç köklerinin enfekte hücrelerin değişken sayısını göstermektedir; Gelişmekte olan saç köklerini astar oldukça küçük keratinositler çoğu enfekte ise, yetişkin saç folikülünün sadece saç mikrop tamamen bulaşmış. Dispase II tedavi ilerledikçe tarafından epidermis ayrılması, saç köklerinin parçaları kaybolmak nasıl nazik bağlı. Çoğu durumda, yağ bezleri ve interfolliküler epidermis arasındaki keratinosit tabakaları yoktur ve dış kök kılıflarının astar tabakası bozulabilir. Herhangi bir durumda, dermiş ve enfeksiyon verimliliği epidermisi ayırma işlemi (bir fare suşu değişebilir Birlikte ele alındığında, ex vivo enfeksiyon testinin zorluk epidermal yaprak hazırlanması ve bakımıdır. Doku kırılganlığı çok dikkatli kullanım gerektirir ve doku dermis ayrıldıktan sonra korunur ne kadar iyi denetler. Bir başka konu kültüründe yaprak sınırlı canlılığı olduğunu. Hücre canlılığı, zamanla azaldığı için, enfeksiyon deneyleri Formlarının hazırlanması hemen sonra veya en az 3 saat yapılmalıdır. Sıçangil deri ek olarak, epidermal tabakalar aynı zamanda insan deri ya da mukoza örneklerinden hazırlanabilir. Doğası ve epidermisin kalınlığına bağlı olarak, dispaz tedavisi adapte edilmelidir. Enfeksiyon seyrini takip etmek, bu cryosections virüslü hücrelerin görselleştirmek için en uygun olanıdır. Bir yüksek PFU / hücre ve enfeksiyon uzun süreleri ile epidermal yaprak disintegra çeşit başlangıç akılda tutmak zorundadıryon. Sitopatik etki dayanarak, hücreler yuvarlak ve hücre-hücre temas kesintiye olsun. 100 PFU / hücre ile 24 saat pi tarafından, bazı enfekte bazal hücreler de dispase II tedavi bağlı olabilir, hangi kaybolabilir. Düşük PFU / hücre ile, enfeksiyon zaman derin doku hasarına yol açmadan uzatılabilir. Seçenek olarak ise, hasarın ölçüde patojenik çeşitli virüs suşları kadar olan markeri olarak kullanılabilir. Biz ICP0 ifadesini boyanarak enfekte hücreleri görselleştirmek için tercih ediyor. Avantaj enfekte hücrelerin oldukça erken teşhis ve, ICP0 boyama desen dayalı, enfeksiyon sırasında erken bir aşamada hücreler ileri bir aşamada olanlardan ayırt edilebilir. Seçenek olarak ise, enfekte olmuş hücreler, örneğin viral kapsid proteini VP5 ve viral zarf proteini gD gibi erken genlerin ekspresyonunu boyanarak görünür olabilir. Biz de önce viral gen ifadesi ya inf tarafından gelen virüs partiküllerini görselleştirmek için çalıştıGFP etiketli HSV-1 ile birlikte ya da sabit örneklerde kapsidleri boyanarak ection. Deneyimlerimize göre, GFP-floresan desen veya doku kesitlerinde boyama modeli açıkça içselleştirilmiş virüs parçacıklarının varlığını göstermek için çok karmaşık. 1500 PFU / hücre kullanılmaktadır - ~ 1000 yüksek virüs titreleri Alternatif olarak, virüs partikülleri elektron mikroskobu ile görülebilir. Düşük virüs dozu halinde, virüs partiküllerinin hemen hemen tespit edilebilir. Bunun yerine intakt epidermal yaprak enfekte olmuş hücreler görselleştirme epidermis RNA seviyelerini analiz veya FACS analizi ile ilgili genlerin yüzeyi sitoplazmik ya da nükleer ekspresyonu ile hücre sayısını ölçmek için ayrışmış edilebilir. Biz bu ex vivo enfeksiyon protokolü bazal keratinositler bulaştırmak bilinmektedir bu virüslere karşı en azından adapte edilebilir olduğunu varsayalım.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz teknik danışmanlık için B6.A2G-MX1 fareler ve Semra Özçelik sağlamak için Peter Staeheli teşekkür ederiz.
Bu çalışma SFB829 ve KN536 / 16 ile Alman Araştırma Vakfı ve Tıp Köln Fortune Program / Fakülte, Köln Üniversitesi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/high glucose/GlutaMAX | Life Technologies | 31966047 | needed for cultivation of epidermal sheets |
| dispase II powder | Roche | 4942078001 | has to be solved in heated PBS |
| enzyme-free cell dissociation solution | Sigma | C5914 | needed for very gentle dissociation of epidermal sheets |
| TrypLE select cell dissociation solution | Life Technologies | 12563-029 | needed for dissociation of epidermal sheets |
| chelex 100 resin | Bio-Rad | 142-2832 | needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum |
| gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7765 | needed for minimization of non-specific antibody binding |
| Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml) | Covance | PRB-155P | used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis |
| Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml) | Life Technologies | A-11029 | used as secondary antibodies |
| Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml) | Life Technologies | A-21429 | used as secondary antibodies |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride) (conc.: 0.1 mg/ml) | Sigma | 36670 | used to counterstain the nucleus |
References
- Koelle, D. M., Corey, L. Herpes simplex: insights on pathogenesis and possible vaccines. Annu. Rev. Med. 59, 381-395 (2013).
- Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J. Herpes simplex Viruses. Fields Virology. , 6th edition, 1823-1897 (2013).
- Syrjänen, S., Mikola, H., Nykänen, M., Hukkanen, V. In vitro establishment of lytic and nonproductive infection by herpes simplex virus type 1 in three-dimensional keratinocyte culture. J. Virol. 70, 6524-6528 (1996).
- Visalli, R. J., Courtney, R. J., Meyers, C. Infection and replication of herpes simplex virus type 1 in an organotypic epithelial culture system. Virology. 230, 236-243 (1997).
- Hukkanen, V., Mikola, H., Nykänen, M., Syrjänen, S. Herpes simplex virus type 1 infection has two separate modes of spread in three-dimensional keratinocyte culture. J. Gen. Virol. 80, 2149-2155 (1999).
- Gescher, K., et al. Inhibition of viral adsorption and penetration by an aqueous extract from Rhododendron ferrugineum L. as antiviral principle against herpes simplex virus type-1. Antiviral Res. 82, 408-413 (2010).
- Petermann, P., Haase, I., Knebel-Mörsdorf, D. Impact of Rac1 and Cdc42 signaling during early herpes simplex virus type 1 infection of keratinocytes. J. Virol. 83, 9759-9772 (2009).
- Everett, R. D., Maul, G. G. HSV-1 IE protein Vmw110 causes redistribution of PML. EMBO J. 13, 5062-5069 (1994).
- Chrostek, A., et al. Rac1 is crucial for hair follicle integrity but is not essential for maintenance of the epidermis. Mol. Cell. Biol. 26, 6957-6970 (2006).
- Petermann, P., et al. Entry mechanisms of Herpes Simplex Virus Type 1 into murine epidermis: Involvement of nectin-1 and HVEM as cellular receptors. J. Virol. 89, 262-274 (2015).
- McGeoch, D. J., et al. The complete DNA sequence of the long unique region in the genome of herpes simplex virus type 1. J. Gen. Virol. 69, 1531-1574 (1988).
- Schelhaas, M., Jansen, M., Haase, I., Knebel-Mörsdorf, D. Herpes simplex virus type 1 exhibits a tropism for basal entry in polarized epithelial cells. J. Gen. Virol. 84, 2473-2484 (2003).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130, 5241-5255 (2003).
- Rahn, E., Petermann, P., Hsu, M. J., Rixon, F. J., Knebel-Mörsdorf, D. Entry pathways of herpes simplex virus type 1 into human keratinocytes are dynamin- and cholesterol-dependent. PLoS One. 6, e25464 (2011).
- Everett, R. D., Cross, A., Orr, A. A truncated form of herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 is expressed in a cell type dependent manner. Virology. 197, 751-756 (1993).
- Horisberger, M. A., Staeheli, P., Haller, O. Interferon induces a unique protein in mouse cells bearing a gene for resistance to influenza virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 1910-1914 (1983).
- Christian, A. E., Haynes, M. P., Phillips, M. C. Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. J. Lipid Res. 38, 2264-2272 (1997).
- Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. Effects of cholesterol depletion by cyclodextrin on the sphingolipid microdomains of the plasma membrane. Biochem. J. 335, 433-440 (1998).
- Yancey, P. G., et al. Cellular cholesterol efflux mediated by cyclodextrins: Demonstration of kinetic pools and mechanism of efflux. J. Biol. Chem. 271, 16026-16034 (1996).
- Montgomery, R. I., Warner, M. S., Lum, B. J., Spear, P. G. Herpes simplex virus-1 entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family. Cell. 87, 427-436 (1996).
- Geraghty, R. J., Krummenacher, C., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Spear, P. G. Entry of alphaherpesviruses mediated by poliovirus receptor-related protein 1 and poliovirus receptor. Science. 280, 1618-1620 (1998).
- Taylor, J. M., Lin, E., Susmarski, N., Yoon, M., Zago, A., Ware, C. F., Pfeffer, K., Miyoshi, J., Takai, Y., Spear, P. G. Alternative entry receptors for herpes simplex virus and their roles in disease. Cell Host Microbe. 2, 19-28 (2007).
- Barron, M. J., Brookes, S. J., Draper, C. E., Garrod, D., Kirkham, J., Shore, R. C. The cell adhesion molecule nectin-1 is critical for normal enamel formation in mice. Hum. Mol. Genet. 17, 3509-3520 (2008).
- Wang, Y., Subudhi, S. K., Anders, R. A., Lo, J., Sun, Y., Blink, S., Wang, Y., Liu, X., Mink, K., Degrandi, D., Pfeffer, K., Fu, Y. X. The role of herpesvirus entry mediator as a negative regulator of T cell-mediated responses. J. Clin. Invest. 115, 711-717 (2005).
