Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Заказ Микродиализ зонд Дизайн

Published: July 21, 2015 doi: 10.3791/53048
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 1
1Department of Pharmacology, Goethe University of Frankfurt, 2Department of Pharmaceutical Chemistry, Goethe University of Frankfurt, 3Department of Clinical Pharmacology, Goethe University of Frankfurt

Summary

Микродиализ является широко используется метод в области нейронаук. Поэтому коммерческие зонды в большой demand.In эта работа сборка зонд подробно, чтобы построить надежный, концентрические, на заказ микродиализа зонд менее чем за $ 10.

Abstract

Микродиализ является широко используется метод в области нейронаук. Поэтому коммерческие зонды большим спросом контролировать физиологические, фармакологические и патологические изменения в спинномозговой жидкости. К сожалению, коммерческие зонды дорого для научно-исследовательских групп в государственных учреждениях. В этой работе, сборка зонд подробно построить надежную, концентрические, на заказ микродиализа зонд менее чем за $ 10. Микродиализ зонд состоит из полисульфона мембраны с молекул рным отсечением 30 кДа. Зонд в пробирке восстановление веществ с различной молекулярной массой (в диапазоне 100-1,600 DA) и различными физико-химическими свойствами по сравнению. Зонд дает восстановление в пробирке примерно 20% для небольших соединений глюкозы, лактата, ацетилхолина и АТФ. В пробирке извлечения для нейропептидов с молекулярной массой от 1,000-1,600 Да составляют 2-6%. Таким образом, в то время как более высокой молекулярной Wвосемь из нейропептидов снижена значений пробирке восстановления, диализ соединений в нижнем диапазоне (до 500 Da) молекулярных весов не имеет огромное влияние на в пробирке скорости восстановления. Данный способ позволяет использование диализа мембраны с другим значением отсечения и мембранного материала. Таким образом, этот заказ сборки зонда имеет преимущество достаточной гибкостью, чтобы диализа веществ в широком диапазоне молекулярных масс. Здесь мы вводим микродиализа зонд с обменным длиной 2 мм, которая применима для микродиализа в мыши и крысы областях головного мозга. Тем не менее, размеры зонда может быть легко адаптирована для больших длин обмена для использования в более крупных животных.

Introduction

Микродиализ является широко используется метод в области нейронаук. За последние 50 лет, минимально-инвазивная методика микродиализа постоянно совершенствовалась, чтобы стать хорошо создана метод контроля локальных концентраций мелких соединений молекулярным весом в межклеточное пространство. Почти каждый межклеточной жидкости ткани могут быть исследованы в свободно движущихся животных.

Gaddum представил технику двухтактный в 1960-х. Он изменил подход от Feldberg и др., В которых тубокурарин вливают через канюлю заканчивается в боковой желудочек и сбора эффлюента также через канюлю 1. Gaddum разработана методика двухтактный, в котором канюли, состоящий из двух концентрических стальных игл был имплантирован в различных областях головного мозга и перфузии раствором, одновременно удаляя нейротрансмиттеры, высвобождаемые из нейронов, окружающих верхушку 2. К сожалению, ткани дамаGE вызвано канюли вокруг кончика ограничивает применение этого метода. В дальнейшем продвижении этого метода, Бито и его коллеги ввели метод диализа, в котором собраны раствор отделили от окружающей ткани с диализной мембраны. Они имплантировали диализа мешок в подкожной ткани собак шеи. Содержание диализа является белков и не могут быть проанализированы многие недели для ионов и аминокислот 3. Следующим шагом в развитии была dialytrode, примитивный микродиализ зонд, который первоначально был описан в 1972 Delgado 4. Наконец, Ungerstedt и его коллеги улучшили схему микродиализа зонда так, чтобы она была меньше и меньше смещены ткани 5.

Концентрические микродиализа зонд ведет себя подобно капиллярной крови. Система постоянно перфузии раствором с участием ионный состав окружающей тканевой жидкости, а не имея интерес аналит. Чте диализа мембраны воздействию внешнего раствора или ткани является полупроницаемой. Это позволяет пассивной диффузии веществ в зонд вдоль градиента их концентрации 6. Проницаемость зависит от многих факторов, таких как молекулярной массы, формы, заряда и рН соединения. Он также ограничен из-за свойств материала мембраны, размер пор мембраны и скорость потока 7.

1 и 2 показывают концентрическую микродиализные зонд. Перфузионной жидкости поступает через впускной трубки в металлической гильзе, которая окружает кварцевого стекла. Внутри металлического рукава, он стекает по плавленого кварца и оставляет его на кончике. В пространстве между диализной мембраны и политетрафторэтилен (ПТФЭ) -tubing (например, тефлон) перфузии жидкости затем течет вверх. Здесь диффузии веществ из ткани происходит, которые окружают мембраны. Диализат оставляет зонд через ПТФE-трубки, который соединен с выпускной трубки и может быть собрана.

Методика микродиализа имеет несколько преимуществ по сравнению с другими методами в естественных условиях. Зонд представляет собой физический барьер в результате чего диализат не содержит ферментов или клеток. Таким образом, нет необходимости в очистке элюата перед анализом, и не ферментативное расщепление аналитов не происходит. Окислительной деградации может произойти во время прохождения аналитов в трубке, но это часто может быть предотвращено путем добавления антиоксиданта (например, аскорбиновая кислота) в перфузат. В качестве альтернативы, окислительное повреждение нейропептидов, например, было эффективно подавлено путем замены трубки на выходе с наконечником для сбора диализата 8. Диализат может быть исследована непосредственно с почти любой вид аналитического метода и несколько аналитов могут быть собраны одновременно. Эта система может быть использована в активных животных, и почти все области мозга может бытьрассмотрел. Кроме того, вливание препаратов через зонд можно (retrodialysis). Тем не менее, есть также ограничения метода микродиализа. Несколько раз с низким разрешением не предоставлять информацию в режиме реального времени об изменениях нейромедиаторов. Потому что это агрессивная техника, зонд имплантация вызывает хирургическую травму и анестезии, которые могут повлиять на нейротрансмиттеров концентрации, необходимый во время этого шага 7,9,10.

Концентрация соединения в диализате составляет лишь небольшое количество фактического концентрации соединения во внеклеточной жидкости. Для расчета неизвестной концентрации соединения во внеклеточной жидкости, относительная восстановления в пробирке должен быть рассчитан. Определение индивидуального родственника в пробирке извлечения для каждого зонда и каждого соединения необходимо перед началом эксперимента в естественных условиях. Для этого, зонд погружают в раствор, содержащийинтерес аналит, тогда как перфузионной жидкости в тот же раствор не имея интерес аналит. После определения концентрации соединения в диализат, эти данные должны быть отнесены к их концентрации в окружающей жидкости. In Vitro восстановления определений различных веществ могут быть реализованы одновременно 9.

Многие неврологии исследовательских групп используют технику микродиализные исследовать нейротрансмиттеров и метаболитов во внеклеточном пространстве в различных областях головного мозга. Таким образом, коммерческие зонды большим спросом в неврологии исследовательской среды. Большим преимуществом коммерчески доступных зондов высокая функциональная надежность. Экспериментальная установка для коммерческих зондов хорошо известна и утверждена для многих известных нейротрансмиттеров и метаболитов. Тем не менее, в то время как коммерчески доступный микродиализ оборудование стоит дорого и имеет меньшую гибкость в применении 11, в гоэто работать в сборе микродиализ зонда представлена ​​в деталях, которые могут быть адаптированы к любым приложением, и может быть изготовлен менее чем за $ 10. Это заказ зонд концентрические микродиализа зонд испытания для исследований в различных областях головного мозга 8.

В пробирке зонда извлечения веществ с различной молекулярной массой (диапазон 100-1,600 DA) и сравнивают с различными физико-химическими свойствами. В пробирке определение восстановления глюкозы, лактата и ацетилхолина с молекулярной массой менее 200 Da, АТФ с молекулярной массой приблизительно 500 Да и нейропептиды ангиотензина II, вещество Р и соматостатина с молекулярной массой выше 1000 дальтон выполняется.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка ПТФЭ-трубка

  1. Сократить PTFE-трубы в 2.5 см. Используйте бумагу масштаб оценить физические размеры. (Рис 3а)
  2. Отрежьте один конец под углом для облегчения подключения на выходе трубы. (Рис 3а)
  3. Шероховатым ПТФЭ-трубки с использованием наждачной бумаги, чтобы склеивание с эпоксидным клеем.

2. Подготовка плавленого кварца

  1. Сократить кварцевого стекла в 2,25 см кусок. (Рис 3а)

3. Установка кварцевой в PTFE-трубы

  1. Вставьте 30 G канюли в полый PTFE волокна пробить его на расстоянии 1 см от плоского конца. Согните PTFE-шланг для упрощения процесса. (Рис 3b)
  2. Вставьте кварцевого стекла в ПТФЭ-трубки с использованием канюли в качестве руководства. (Рис 3в)
  3. Аккуратно снимите канюлю и закрепить кварцевого стекла. (УвидетьРис 3)
  4. Плавленый кварц должен выступать на 5 мм на торце. (Рис 3e)
  5. Клей кварцевой на месте на месте прокола цианакрилатного клея и дайте ему затвердеть в течение ночи. (Рис 3e)

4. Подготовка эпоксидного клея (клей Двухкомпонентный)

  1. Добавить 30 частей желтого отвердителя 70 частей черного эпоксидного клея с помощью тонкой иглы и смешайте его нежно. Это непосредственно готовы к использованию.

5. Применение мембраны (Все дальнейшие шаги должны быть выполнены под микроскопом и масштаб работы, применяется для определения физических Размеры)

  1. Потяните полисульфоновое мембрану тщательно над плавленого кварца, а затем потяните мембрану в PTFE-трубы и отрегулировать мембрану до 5,5 мм, используя острый скальпель. (Рис 3F)
  2. Установите маркировку точки на мембране с тонкой ручкой для определения обменного длину 2 ммот конца оболочки.
  3. Нанесите небольшое количество эпоксидного клея, чтобы покрыть наконечник мембраны с помощью тонкой иглы. (Рис 3g)
  4. Закрывают стык между диализа мембраны и волокон ПТФЭ с помощью той же тонкой иглой, используемого на стадии 5.3) с эпоксидным клеем. (Рис 3g)
  5. Добавьте достаточно эпоксидный клей на мембране до метки точки для обеспечения обмена длину 2 мм. Позвольте ему затвердеть в течение ночи. (Рис 3G) До определения длины обмена, мембрана 5,5 мм. После нанесения эпоксидного клея на мембране, только на 2 мм мембраны доступна для диффузии.

6. Применение металлической гильзе

  1. Вырезать 25 G иглу в 1 см металлический рукав куски помощью гибочного плоскогубцами.
  2. Потяните 1 см металлической муфты (25 г) на остальной части плавленого кварца. Металлическая втулка позже позволяет подключение впускного трубопровода с MICRODIAлизис зонд. (Рис 3h)
  3. Печать соединения между металлическим рукавом и PTFE-трубы с оставшимся эпоксидным клеем. Позвольте ему затвердеть в течение, по крайней мере 24 часов. (Рис 3i)
  4. Применяя горячий клей вокруг бифуркации зонда для дополнительной фиксации и стабилизации.
    Примечание: на входе внутренний объем зонда 0,045 мкл и выпускной внутренний объем 2,5 мкл. Таким образом, при скорости потока 1 мкл / мин, это занимает приблизительно 2,5 мин, после соединения впускной трубы, чтобы начать сбор диализата. С настоящего Протокола, процедура сборки зонда дает микродиализа зондов, которые 95% надежным.

7. Выполнение экспериментов In Vitro восстановления

  1. Падение зонда с отсечкой 30 кДа и обмена длиной 2 мм в маточного раствора, состоящего из ACSF, содержащего 1 мМ глюкозы и 1 мМ лактата и, в отдельном эксперименте, в CSF, содержащий 100нМ АТФ и 100 нМ ацетилхолина.
  2. Заливать зондов с ACSF. Указан расход 1 мкл / мин и проводить эксперименты при комнатной температуре (22 ° С). Разрешить зонды для уравновешивания в течение 1 часа в маточном растворе, а не собирать образцы каждые 30 мин после этого и хранят при -80 ° С до измерения.
  3. Для расчета извлечения в пробирке, сравнивать концентрации аналитов в диализате с известными концентрациями аналита в маточном растворе. Экспресс результаты в процентах от концентрации вещества в диализат против исходного раствора.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Концентрические заказ микродиализ зонд состоит из полисульфона мембраны с молекул рным отсечением 30 кДа. Сборка зонд показано на рисунке 3.

Это выставлены восстановление в пробирке для глюкозы мало энергии метаболитов (180,16 Da) и лактата (112,06 Da) в 19.10 ± 1.2% и 21.2 ± 1.6%, соответственно. Для положительно заряженной ацетилхолина с молекулярной массой 181.66 Да, он показал ин витро восстановительной стоимости 22,6 ± 1,4%. АТФ с молекулярной массой 551,62 дальтон и три отрицательно заряженных фосфатных остатков дал восстановление в пробирке в сопоставимой степени (22,4 ± 0,7%). В пробирке восстановление малых молекул приведены на фиг.4А.

Нейропептиды с молекулярной массой выше 1000 дальтон показали ниже в пробирке извлечения по сравнению с более мелкие молекулы (<500 Да) (см Fi фигура 4В). Среди протестированных нейропептидов, ангиотензин II (1,046.18 Да) является наименьшим пептид с 8 аминокислот. Это выставлены восстановление в пробирке 6,1 ± 0,3%. Остаток кислоты вещество Р 11 амино (1,347.63 Да) и соматостатин кислоты 14 амино (1,637.88 Да) показали примерно равны в пробирке значений рекуперации 2,2 ± 0,3% и 2,3 ± 0,1%, соответственно. В пробирке извлечения нашего 30 кДа зонда сопоставимы с восстановлений в пробирке коммерчески доступных микродиализные зондов (СМА микродиализа, Стокгольм, Швеция), например. лактат 23% и 13% глюкозы (см приложение, обратите внимание, нет. 1)

Фигура 1
Рисунок 1: Фотография заказной зонда.

8 / 53048fig2.jpg "/>
Рисунок 2: Схематическое изображение из микродиализа зонда (Перепечатано из Lietsche др, 2014, с разрешения Elsevier.).

Рисунок 3
Рисунок 3: Схематическое изображение узла зонда; шаг ай подробнее см протокол (перепечатано из Lietsche др., 2014 г., с разрешения Elsevier).

Рисунок 4
Рисунок 4: Восстановление небольших молекул и нейропептидов (а) восстановление пробирке глюкозы, лактата, ацетилхолина и АТФ.. Раствор содержал 1 мМ глюкозы и лактата и, альтернативно, от 100 нм АТФ и 100 нм ацетилхолин для каждой экспериментальной состоянии. Результаты выражали в процентах от вещества Concentration в диализат / раствора. Значения исследуемых веществ являются средством ± SD п = 22 для глюкозы, п = 22 для лактата, п = 11 для ацетилхолина и п = 13 для АТФ. (Б) в пробирке восстановление нейропептидов ангиотензина II, вещества Р и соматостатин. Раствор содержал 100 нМ ангиотензин II, вещество Р и соматостатин для каждой экспериментальной состоянии. Результаты выражали в процентах от концентрации вещества в диализат / маточного раствора. Значения столбцов средства ± SD п = 6 для каждого зонда.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Фиг.3 показывает примерную сборку зонда. Правильные размеры внутренней и внешний диаметр должны быть внимательно следили за труб (OD 1,6 мм; ID 350 мкм), плавленого кварца (OD 105 мкм; ID 40 мкм) и диализной мембраны (OD 245 мкм; ID 210 мкм). Важно также, чтобы сохранить пространство между мембраной и плавленого кварца из (105 мкм), а также между мембраной и трубкой (105 мкм), а. Если значения различаются, давление в зонде может расти и привести к утечке мембраны.

Здесь мы вводим микродиализа зонд с обменным длиной 2 мм, которая применима для микродиализа в регионах мозга мыши. Однако размеры могут быть легко приспособлены для больших длин обмена для использования в более крупных животных.

Некоторые части сборки могут быть заменены. Например, нет необходимости в использовании ПТФЭ трубку. Применение полиэтиленовой трубки также возможно с одинаковыми внешний и гостиницыэ размеры диаметр. Шероховатости трубы необходимо только при использовании ПТФЭ-трубки. Замена мембраны диализа также возможно. Для настоящего зондового, 30 кДа отсечки мембраны используют, но и любой другой диализа мембраны могут быть использованы с идентичными размерами. Таким образом, наш заказ сборки зонда имеет преимущество большой гибкости диализировать вещества с широким диапазоном молекулярной массы; чем выше молекулярная масса отсечки, чем выше молекулярная масса вещества, которое может быть диализу. В пробирке восстановление, как правило, увеличивается с молекулярно-весовое отсечение диализной мембраны.

Для покрытия наконечник мембраны, эпоксидный клей необходимо закрыть стык между диализа мембраны и PTFE-трубы и для определения длины курса. Применение цианоакрилатный клей не возможно на этом этапе, потому что это влияет на диализной мембраны и приводит к утечке. Цианоакрилатный клей для склеивания плASTIC следует применять для фиксации плавленого кварца с трубки на месте на месте прокола.

Следует отметить, что эта конструкция датчика не был протестирован с направляющие канюли. Наша лаборатория предпочитает имплантировать зонды низкого диаметра для острых экспериментов, в которых у нас есть 48-72 ч экспериментальной времени, прежде чем астроглиоз вызывает неисправность зонда. Для этого типа эксперимента, руководство канюли не имеют преимущество, потому что руководство канюли больше и вызывают больше повреждение тканей. Более того, даже с направляющей канюли в место, зонд всегда должен быть вставлен в здоровой ткани головного мозга, вызывая острое поражение в области диализа. Повторное введение и удаление зонда через направляющие канюли вызывает повторный ущерб, ситуацию, которая избежать одной-времени, то есть острой вставки. Гематоэнцефалический барьер было показано, что интактные несколько часов после имплантации 12. Направляющие канюли являются предпочтительными, однако, когда серии измерений чпр быть сделано в течение нескольких дней или недель. Наконец, летучие анестетики должны использоваться для зонда имплантации, поскольку инъецируемые анестетики мешать последующих экспериментах в течение 1-2 дней.

В пробирке восстановлений для глюкозы, лактата, ацетилхолина и АТФ примерно 20%, то есть для всех протестированных небольшие веществ молекулярным весом, восстановление в пробирке почти равны. Очевидно, что в нижнем диапазоне (до 500 Da), молекулярная масса не имеет большого влияния на в пробирке скорости восстановления. Молекулярная масса отсечки 30 кДа также позволяет диализировать нейропептиды. В связи с более высокой молекулярной массой из нейропептидов, в пробирке значение восстановления ниже. Вещество Р (1,348 Да) и соматостатин (1638 Да) может быть диализу в той же степени, в пробирке с значениями восстановления 2-3%. Хотя оба пептида имеют массовый сдвиг приблизительно 300 дальтон, в пробирке восстановление остаются теми же. Оба ПодстANCE Р и соматостатина положительно заряжены в водном растворе и может демонстрировать подобные физико-химические свойства. Ангиотензин II с молекулярной массой 1046 Да показывает высокую в пробирке восстановление до 6%, что в три раза больше, чем у двух других нейропептидов. Следовательно, молекулярные массы выше 500 Да ясно влияет на восстановление в пробирке, даже если при вещества загружают нейтральным в водном растворе. В этом случае восстановление в пробирке не зависит от расхода Диализованный веществ. Тем не менее, при использовании других мембранных материалов, восстановление заряженных соединений могут влиять 8.

В заключение, сборка на заказ микродиализа зонда приемлемой альтернативой коммерческим зондов. Наши самодельные датчики крепкий, имеют высокую надежность и хорошую воспроизводимость.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Epoxy glue SunChrom GmbH, Fiedrichsdorf, Germany    
Fused silica ID 40 µm OD 105 µm Ziemer-Chromatographie, Mannheim, Germany Art. No: 6.040105
Polysulfone membrane (haemodialysis filter FX Cor Diax 600) Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA, Bad Homburg, Germany REF: F00001593
Cyanacrylate glue (Pattex® superglue plastic) Henkel AG&Co. KGaA, Düsseldorf, Germany
TEFLON-tubing 1.6 x 0.35 mm SunChrom® GmbH, Friedberg, Germany Art. No: 969-195.219
Scalpel (Feather® Surgical Blade No. 10) pfm medical ag, cologne, Germany Art. No: 07310
Microscope MEIJI Techno  EMZ-8TR
30 G x 11" (0.3 x 25 mm) cannula  Sterican® Z B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany REF: 9324500
25 G x 11/2" (0.5 x 40 mm) cannula 100 Sterican® B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany REF: 9186166
Fine pen (Stabilo point 88 fine 0.4) Schwan-STABILO Schwanhäußer GmbH & Co. KG Art. No: 88/36
Hot glue  (Glue sticks ULTRA Power x 11 mm) Steinel® GmbH, Herzebrock-Clarholz, Germany Art. No: 4007841046910
Sandpaper P60 230 x 280 Robert Bosch GmbH, Gerlingen-Schillerhöhe, Germany Catalog Number: 2608605397

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Feldberg, W., Malcom, J. Experiments on the site of action of tubocurarine when applied via the cerebral ventricles. J Physiol. 149, 58-77 (1959).
  2. Gaddum, J. H. Push-pull cannulae. J Physiol. 155 (1 P), (1961).
  3. Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
  4. Delgado, J. M., Lerma, J., Martín del Río, R., Solís, J. M. Dialytrode technology and local profiles of amino acids in the awake cat brain. J Neurochem. 42 (5), 1218-1228 (1984).
  5. Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30 (1-3), 44-55 (1974).
  6. Ungerstedt, U. Microdialysis--principles and applications for studies in animals and man. J Intern Med. 230 (4), 365-373 (1991).
  7. Bourne, J. A. Intracerebral microdialys: 30 years as a tool for the neuroscientist. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30 (1-2), 16-24 (2003).
  8. Lietsche, J., Gorka, J., Hardt, S., Karas, M., Klein, J. Self-built microdialysis probes with improved recoveries of ATP and neuropeptides. J Neurosci Methods. 237, 1-8 (2014).
  9. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of Brain Microdialysis. Curr Protoc Neurosci. 7, Unit 7.1 (2009).
  10. Neurochem, J. Brain Microdialysis. J. Neurochem. 52 (6), 1667-1679 (1989).
  11. Jolly, D., Vezina, P. In vivo microdialysis in the rat: low cost and low labor construction of a small diameter, removable, concentric-style microdialysis probe system. J Neurosci Methods. 68 (2), 259-267 (1996).
  12. Sumbria, R., Klein, J., Bickel, U. Acute depression of energy metabolism after microdialysis probe implantation is distinct from ischemia-induced changes in mouse brain. Neurochem Res. 36, 109-116 (2010).

Tags

Неврология выпуск 101 заказ зонд микродиализа зонд нейропептиды молекулярный отсечки пассивная диффузия монтаж зонда относительно полупроницаемой мембраной
Заказ Микродиализ зонд Дизайн
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lietsche, J., Gorka, J., Hardt, S.,… More

Lietsche, J., Gorka, J., Hardt, S., Karas, M., Klein, J. Custom-made Microdialysis Probe Design. J. Vis. Exp. (101), e53048, doi:10.3791/53048 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter