This protocol describes a system architecture for performing automated small volume (0.15–1.5 ml) particle separations using a microfluidic device, and discusses methods to optimize acoustofluidic device performance and operation.
En stor fördel med mikrofluidikanordningar är förmågan att manipulera små prowolymer, vilket minskar reagensavfall och bevara värdefulla prov. Emellertid är det nödvändigt att ta itu med anordning integration med makroskala miljö för att uppnå robusta provmanipulering. För att förverkliga repeterbar, känslig partikelavskiljning med mikrofluidikanordningar, presenterar detta protokoll en komplett automatiserad och integrerad mikroflödes plattform som möjliggör exakt bearbetning av 0.15-1.5 ml prover med mikrofluidikanordningar. Viktiga aspekter av detta system inkluderar modulär enhet layout och robusta fixturer resulterar i pålitlig och flexibel värld att chip anslutningar, och helt automatiserad hantering vätska som åstadkommer sluten slinga provtagning, systemrengöring och priming åtgärder för att säkerställa repeterbar drift. Olika mikrofluidikanordningar kan användas omväxlande med denna arkitektur. Här införliva vi en acoustofluidic enhet, detalj sin characterization, prestandaoptimering och visa dess användning för storleks separation av biologiska prover. Genom att använda återkoppling i realtid under separationsexperiment, är provsamling optimerad för att bevara och koncentrera provet. Trots krav på integration av flera delar av utrustning, fördelarna med denna arkitektur är förmågan att bearbeta okända prover utan extra systemoptimering, enkel anordning ersättning, och exakt, robust prov behandling.
Prov separation och fraktionering är en av de mest lovande områdena användningsområden för mikroflödesteknik. Sådana provhanteringssteg är integrerade för effektiva klinisk diagnostik, terapi utveckling biosurveillance ansträngningar och framsteg inom biovetenskaplig forskning och teknik. En myriad mikroflödesstrategier separations har visats för vätske svävande partiklar och kolloider, samt för kemiska och biologiska arter; flera recensioner ger översikter över den senaste tidens framsteg och utvecklingen i dessa områden 1 – 9. Även om många av dessa mikroflödesteknik separations (nedan kallade "kärn Devices") har i stor utsträckning kännetecknas, har några rapporter ansåg provseparationsproblem på systemnivå. Kärn enheter är typiskt individuella centimeter skala chips, gränssnitt till fluorpolymerrör, med vätska levereras av en förskjutning eller tryckpump.Men om löftet om mikrofluidik – inklusive ökad automatisering, tillförlitlighet och minskning av provvolymer – är att bli verklighet, åtminstone en motsvarande ansträngningar måste ägnas åt att utformningen av en fullständig separation system i vilket Core Device är integrerad .
Dessutom är en stor utmaning för mikroflödes metoder för biodetection makro till mikro gränssnitt. Detta gäller inte bara de fysiska "världen mot chip" anslutningar en mikrofluidikanordning till makroskala komponenter, och obalansen mellan typiska kliniska eller analysprovvolymer (~ 0,1-10 ml) och den inre volymen av mikroflödessystem marker (~ 0.01-10 il), men också de begränsningar statistiska stickprovs till följd av att överbrygga dessa storleksskalor. Dessa frågor bidrar till uppfattningen att provet före bearbetning och beredning är "svaga länken" av biodetection. 10 Plattformen som beskrivs i detta arbete taKES viktiga steg mot att ta itu med dessa utmaningar.
Ta en systemnivå anser detta protokoll detaljer tillförlitlig behandling av just-doserade analytisk skala volymer (som sträcker sig från 0,15 till 1,5 ml) på ~ 10 min tidsramar. Detta är en "one-knappen" operation: när källan flaskan som innehåller provet och destinationsflaskor för fraktionsuppsamling placeras i systemet, "run" kommando initierar förfarandet, och alla steg är datorstyrda. Vid slutet av en körning, kan flaskorna insamlings avlägsnas från systemet för nedströms analys av de separerade fraktionerna.
Core Device i detta system är en akustofores chip som utvinner däggdjurscellstorlek (5-20 pm) partiklar från provet. Acoustophoretic separation Här väljs främst eftersom det är hög genomströmning (upp till 100-tals il / min), etikett-fri och icke-kontakt, vilket ger fördelar vid separation livskraftig viruSES från celler som få andra mikroflödesteknik kan matcha. Fysik akustisk partikel fokusering har utförligt beskrivits, 11-13 och är inte i fokus för detta protokoll, men en kort sammanfattning av de underliggande begreppen följer att underlätta förståelsen av ansökan till mikroflödes separation.
Ultraljud stående vågor får gehör i vätskefyllda mikro producerar tryckfält, vilket ger upphov till krafter som driver partiklar mot noder med lågt tryck. Kraften storlek beror på partikelns volym, och på en akustisk kontrast faktor som härrör från de relativa densiteter och kompressibiliteter av partikeln och suspensionsvätskan. 14 Som sådan akustisk fokus är idealiskt för separation av cellstorlek (~ 7-15 um) från virusstora (~ 50-200 nm) partiklar. De större partiklarna migrera mot en tryck nod; emellertid eftersom kraften magnitud är mycket liten förpartiklar mindre än 2-3 | im, dessa små partiklar eller lösta species knappast flytta alls. Vår specifikt genomförande av akustisk avskiljning, som tidigare beskrivits, 15 innehåller en tunn vägg för att underindela fluidkanalen och tillåter avstämbar, asymmetrisk placering av fokuseringspositionen. Detta ger flexibilitet i enheten design och prestandafördelarna-inklusive ökad kvalitet och separation hastighets beskrivs helt annat håll. 16,17
Men det är en stor fördel med systemnivå design strategi som beskrivs i detta arbete att det kan anpassas till en stor variation av mikroflödeskärn Devices. Till exempel kan de flesta andra kontinuerligt flöde separationslägen, inklusive tröghets, flödesfältfraktionering, deterministisk sidoförskjutning (DLD), och olika typer av elektrokinetiska enheter lätt införlivas, med lämpliga justeringar för att ta hänsyn till förändringar i inlopp / utlopp konfiguration , flödeshastigheter,och provvolymer. Enheter med olika typer av on-chip fält (elektriska, magnetiska) eller gradienter (termiska, kemiska) kan kräva ytterligare anslutningar till chip, eller integration av ytterligare hårdvara, som denna plattform rymmer.
Detta protokoll ger de åtgärder som krävs för att utforma en mikroflödesseparationsanordning, och att tillverka kiselglaschips med djup reaktiv jonetsning (DRIE, en plasma-etsningsprocessen finns i många mikrotillverkningsanläggningar, som använder alternerande cykler av etsning och passivering för att uppnå djup funktioner med vertikala sidoväggar 18). Härnäst beskriver vi karakterisering av acoustofluidic enheten för att bestämma de optimala driftsparametrar för separering, och slutligen detalj fullt integrerat system separation och förfarandet för bearbetning av biologiska prover. Typiska enhet karakterisering resultat och bearbetning av data prov Därefter presenteras och diskuteras, och de viktigaste fördelarna med denna förekommandeach markeras, inklusive modularitet, robusthet, precision och automation.
Detta protokoll presenterar systemintegration-nivå mikrofluidikanordningar till makroskala utrustning för att utföra automatiserad biologiskt prov behandling. Modularitet denna plattform gör det möjligt att kunna anpassas till varje kontinuerlig flödesmätaren, och som ett exempel, fokuserar presenterade protokollet om karakterisera och förbättra prestanda i en acoustofluidic partikelseparationsanordning. Tre stora fördelarna med detta protokoll är markerade: (i) modularitet och chip-to-world gränssnitt, (ii) robust karakterisering av enheten prestanda, och (iii) automatisk behandling av just doserade provvolymer för partikelavskiljning.
jag. Modularitet och chip-to-world gränssnitt
Såsom visas i fig 2, är mikroflödeschip monterat på ett anpassat kopplingsdäcket för att enkelt passa in på ett mikroskop scen för direkt observation. Bakbord innehåller # 6-40 UNF gängade hål på en 5 mm-pitch galler, ENAbling chipet att fästas, och vätskeförbindelser göras. Fluid anslutningar PEEK rör med maskinbearbetade ändar, som tätar mot fluidic chip med en gummi ansikte packning och en krage av rostfritt stål. Detta gränssnitt system gör det enkelt chip byte och snabb enhet redesign, som kräver få eller inga förändringar i andra systemkomponenter, som chip fotspår uppfyller nätet format. Till exempel har vi använt denna plattform med mikroflödessystem marker för kontinuerligt flöde elektrofores, termisk cellys, 29 snabb blandning av reagens för kemisk syntes, och encelliga avskiljning och förhör.
II. Robust karakterisering av enhetens prestanda
För att optimera prestandan hos någon mikroflödesseparationsanordning, dess funktion måste först noggrant karakteriseras. Det system som beskrivs här stöder utvecklingen av snabba och automatiserade protokoll att göra detta. För den specifika example akustiska fokuseringsanordningar, fokuserings kvalitet, arbetsfrekvens och ställning fokuserade partiklar i mikroflödessystem kanal måste mätas för varje enskild enhet. Dessa mätningar kräver sveper genom en rad piezokeramisk drivfrekvenser, spänningar och flöden, för att identifiera de optimala parameterkombinationer för högkvalitativ separation. De presenterade protokollet varierar automatiskt dessa avstämbara parametrar och fångar relevant data- dvs fluorescerande bilder av partiklar som strömmar i kanalen som är efterbehandlade för att generera de nödvändiga mätningar av partikel fokus kvalitet, frekvens och position (Figur 3).
Full karakterisering av akustisk enhetens prestanda kräver upprepa steg 4.4 och 4.5 som behövs under olika experimentella betingelser. Exempelvis är den absoluta fokuseringsposition av ett chips hittas genom att köra avsökningsfrekvensen vid relativt låga flödeshastigheter och hög spännings för att säkerställa fullständig migrering till noden plats. Dessutom kan sådana frekvens skannar bedöma kvaliteten på sammansatta enheten (när den körs med polystyrenpärlor med känd storlek), eller för att bestämma hur en tidigare okänd partikel typ kommer att bete sig i systemet (efter ett chip har präglats med pärlor). Ett chip med bra energiöverföring från piezokeramisk till mikroflödessystem kanal kommer att resultera i snäva fokus vid höga flöden (> 1 ml / min) och låga spänningar (12-15 V pp), medan de med dålig energiöverföring kommer inte att fokusera ännu vid låga flödeshastigheter (<100 | j, l / min) och höga spänningar (> 20 V pp). Vi har funnit att intim kontakt mellan mikroflödeschip och den piezokeramiska är kritisk för effektiv energiöverföring in i vätskan. Ytterligare undersökning av den optimala metoden för att binda mikroflödes chip och den piezoelektriska möjliggör tillförlitlig produktion av högpresterande enheter.
Slutligen, ett komplettbild av en acoustophoretic enhetens verksamhet kan erhållas genom att kombinera bildbaserade frekvens scan mätningar i Steg 4 (och figur 3) med partikelräkningar samlats in från SPO LPO som funktioner av de berörda driftsparametrarna, från separations experiment utförda med mikrosfärer , såsom beskrivs i steg 5. Såsom visas i fig 6, kan en sådan serie av automatiska experiment snabbt karakterisera en enskild enhet prestanda och avstämbarhet, informerar användaren av den optimala parameterrymden att driva anordningen för partikelseparation.
III. Automatiserad litet prov behandling för partikelavskiljning
För framgångsrik och exakt mikroflödes chip-baserade prov bearbetning, är det viktigt att på ett tillförlitligt och exakt meter, last, leverera, och samla volymer av vätska när de passerar genom. Denna precision är särskilt viktigt när prowolymen är liten(~ 0,1-1 ml), vilket är vanligt i kliniska eller forskning laboratorium inställningar. 30 Precise provhantering är en utmaning i traditionella mikroflödes experiment som använder manuell indragning av provet i en spruta och infusion i en enhet utan återkoppling av när provet har skilts och när det ska samlas in. De presenterade protokollet sysselsätter automatiserad provpolen lastning och doserings kombination med återkoppling i realtid från flödesgivare för att möjliggöra reproducerbara separationer av små provvolymer.
Figur 5 visar flödesprofilerna uppmätt på SPO LPO från ett typiskt separationsexperiment. För det första är ledande buffert av minst 35 fil laddad för att säkerställa stabilt flöde innan provet når den akustiska chipet. Prowolymer mindre än 100 ^ rekommenderas inte för denna systemkonfiguration, eftersom provutspädning på grund av den ledande bufferten blir överdriven. En plugg av luft används i början av the injektion innan ledande buffert för att separera provpluggen från den vätska som följer, förhindrar blandning och spädning av prov och fungerar som en indikator på flödesgivare. Efter en inledande transient som fluidum börjar rör sig genom systemet, skarpa spiksignaler i båda utloppen indikerar passagen av den första luftbubblan. Dessa transienter följs av en lång period av stabilt flöde som provet strömmar genom systemet, sedan en annan spik när den andra luftbubbla passerar, och slutligen en eventuell minskning i flödeshastigheten till noll efter sprutpumpen stannar.
Passagen av luft pluggar genom flödessensorerna används som triggningspunkter för att byta ventilerna för att starta och stoppa provsamling, vilket minimerar förlorad prov och utspädning av icke-urvalsvätskevolymer. Sluten slinga dosering av bearbetade prowolymer eliminerar behovet av att omprogrammera dessa värden före starten av experimentet varje gång provet ingången ändras. Den här funktionen ärsärskilt viktigt när prowolymen är begränsad, till exempel i fallet med många kliniska prover. Realtidsövervakning flödet bistår också vid felsökning; en dålig sikt (t.ex. en träsko bildas i ett av utloppen) är omedelbart uppenbart från de resulterande flödesprofiler, som i figur 5b.
För att visa flexibilitet och effektivitet acoustofluidic separation med hjälp av presenterade systemarkitektur, renat DENV och GGV virusstammar spetsades i cell lager och separeras genom bearbetning genom mikroflödes chip. Figur 7a visar att Raji-celler var väl separerade från virus, såsom 97 % av Raji-celler som lämnar chipset befanns vara i LPO och lämnar därigenom en höggradigt anrikad prov av DENV i SPO. I jämförelse, effektivitet DENV separation var lägre, med 70% av DENV lämnar chip som finns i SPO. Detta kan tillskrivas viss konvektiv omblandning inducerad av varven hos separatipå kanal, men mer sannolikt att vissa DENV partiklar migrerar tillsammans med Raji celler i LPO. Celler som migrerar i sidled över strömnings drar lite vätska med dem, även vid låga Reynolds tal. Genom denna mekanism, liksom ospecifik ytadsorption, viruspartiklar överföra till LPO. Ändå är höganrikat prov av DENV i SPO en stor nytta, till exempel när de novo-sekvensering används för att upptäcka och identifiera virus.
Figur 7b visar att i en experimentkörning, var endast cirka 70% av Boa celler som lämnar chipset finns i LPO, jämfört med nästan 100% avskiljningsgrad för Raji-celler. Skillnaden i separationsprestanda mellan de två celltyperna kan tillskrivas en mindre genomsnittlig storlek eller en lägre täthet av Boa celler jämfört med Raji-celler, vilket därför resulterar i mindre akustiska krafter. För att bekräfta eller vederlägga dessa antaganden, storlek, densitet och morfologi av Boaceller i suspension (som normalt växer anhängare) i Boa cellerna måste mätas noggrant, en insats för vidare utredning. I samma experiment, liknande de experiment med DENV, huvuddelen av den återvunna GGV lämnat SPO, vilket tyder på en anrikning av det virala fraktionen.
De presenterade uppgifterna belysa de inneboende utmaningar ingenjörs brett tillämpliga plattformar för behandling av en rad olika biologiska prover. Viktigt kan de biologiska interaktioner börjar spela en så stor roll som de fysikaliska och mekaniska effekter. Men dessa preliminära experiment visar också makt och löfte om att använda detta system arkitektur för prov bearbetning i kliniska och forskningsansökningar. Som en robust, väl karakteriserad konstruerade systemet, ger denna plattform möjlighet att söka svar på nya vetenskapliga frågor.
The authors have nothing to disclose.
This work was performed under the auspices of the U.S. Department of Energy by Lawrence Livermore National Laboratory under Contract DE-AC52-07NA27344, and partially supported by LLNL’s Laboratory Directed Research and Development (LDRD) program, 14-LW-077. The authors thank Michael Wilson, Mark Stenglein and Joe DeRisi at the Univeristy of California, San Francisco for generously providing GGV and Boa cell samples. EJF acknowledges support from the LLNL Lawrence Scholar Graduate Program. MS acknowledges support from the UC Office of the President Lab Fees Research Program. LLNL-JRNL-665235
Materials required for Steps 1-3: Device Design, Fabrication and Assembly | |||
Double Sided Polished Silicon Wafer | Silicon Quest International, Inc. San Jose, CA, USA | 100 mm <100> prime wafer | 1-20 ohm-cm, 495 +/- 25µm Double-side polished |
Glass Wafer | Bullen Ultrasonics, Eaton, OH, USA | 100mmx0.5mm Boro | |
Photoresist, AZ 1518 | MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany | AZ 1518 | Photoresist used to adhere wafer to blank wafer for DRIE etching |
Photoresist, AZ 4620 | MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany | AZ 4620 | Photoresist to define fluidic and via mask patterns |
DRIE plasma etcher | STPS, Newport, NP, United Kingdom | Multiplex Advance Oxide Etch (AOE) ICP system | |
Wafer Bonder | Electronic Visions Group, St.Florian am Inn, Austria | EVG 501 | |
Dicing saw | Kulicke & Soffa Industries, Singapore | K&S 982 | |
Epoxy kit | Epoxy Technology, Billerica, MA, USA | EPO-TEK 301 | Epoxy used to couple piezo and microfluidic chip |
PZT piezoceramic | Piezo Systems, Woburn, MA, USA | PSI-5A4E | 37.5 × 10 × 0.5 mm |
28 AWG Kynar-insulated solid wire | Squires Electronics, Cornelius, OR, USA | UL1422 | |
2-part silver epoxy | MG Chemicals, Surrey, BC, Canada | 8331 | Conductive adhesive for attaching wire leads to PZT |
L-edit | Tanner EDA, Monrovia, CA, USA | Ledit v15.1 64-bit | CAD software for mask layout |
Materials required for Step 4: Characterizaiton of Acoustic Focusing Performance | |||
Dual Pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | PHD ULTRA Series, 703007 | |
5ml syringes | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA | 309646 | |
Luer to Threaded port adapter | IDEX, Oak Harbor, WA, USA | P-659 | Connects syringe to tubing |
Union | IDEX, Oak Harbor, WA, USA | P-623 | Connects world to chip connections to fluoropolymer tubing. Can also use webbed |
Ferrule 1/4-28 flat bottom | IDEX, Oak Harbor, WA, USA | P-200 | Used with nut to make connections between tubing and syringe, flow sensors and world to chip hardware |
Nut 1/4-28 flat bottom | IDEX, Oak Harbor, WA, USA | P-202 | Used with ferrule to make connections between tubing and syringe, flow sesnsors and world to chip hardware |
1/16" OD Fluoropolymer tubing | IDEX, Oak Harbor, WA, USA | 1912L | Tubing to connect syringe pumps to world to chip connections. Tubing size is not critical during claibration steps (.01-.03" ID typically used, other suitable part numbers: 1907L, 1902L). |
Small ID fluoropolymer tubing | IDEX, Oak Harbor, WA, USA | 1476-20 | Used for Flow restrictors: 0.006" ID, 1/16" OD FEP |
PEEK tubing | Connects from chip to fluoropolymer tubing. | ||
Cooling fan | Multicomp, Leeds, England | MC19663 | |
Function Generator | Agilent, Santa Clara, CA, USA | 33220A | |
RF amplifier | ENI, Rochester, NY | 325 LA | Must be able to amplify signals from <1V in the range of 1-2MHz to 25 Vpp to the piezo. |
CCD Camera | Photometrics, Tucscon, AZ, USA | CoolSnap HQ | |
Inverted Microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | Axiovert S100 | |
FITC filter set | Chroma Tech, VT, USA | SP101 | |
Objective, 10x | Zeiss, Oberkochen, Germany | ACHROPLAN | |
Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, OR, USA | TDS3014B | To monitor voltage output by RF amplifier |
MatLab | Mathworks, Natick, MA, USA | R2014a | |
Driver interface software to integrate Photometrics camera with LabVIEW | R Cubed Software, Lawrenceville, NJ, USA | SITK | |
Tween 20 | Sigma Aldrich, St. Lousi, MO, USA | P9416 | |
Dragon Green Fluorescent 5.76 or 7.32 µm Beads | Bangs Laboratory, IN, USA | FS06F | |
Additional materials required for Step 5: Automated Separation | |||
Multiport valves | VICI, Houston, TX, USA | C25Z-3180EUHA | In the current configuration 4 valves are needed |
Flow Sensors | Sensirion, Westlake Village, CA, USA | SLI-1000 | |
Fluoropolymer tubing, .01 and .03" ID | IDEX, Oak Harbor, WA, USA | 1902L and 1912L | High purity PFA preferred |
Nut | VICI, Houston, TX, USA | ZN1PK-10 | Used with ferrule to make connections between tubing and valves. Alternative part numbers: MZN1PK-10, LZN1PK-10 |
Ferrule | VICI, Houston, TX, USA | ZGF1PK-10 | Used with nut to make connections between tubing and valves. |
LabVIEW | National Instruments, Austin, TX, USA | LabVIEW Professional Development system | Laboratory Automation Software |
PBS | Teknova, Hollister, CA, USA | P0200 | |
Raji Cells | ATTC, Manassas, VA, USA | CCL86 | |
Boa Cells | Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF | ||
GGV | Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF | ||
DENV | Kindly provided by Jose Pena at LLNL | ||
Coulter Counter Z2 | Beckman Coulter, Brea, CA, USA | Z2 | |
Hemacytometer | Fisher Scientific, Waltman, MA, USA | 0267151B |