Abstract
酵素微小バイオセンサーは広くリアルタイムで細胞外シグナルを測定するために使用されてきました。それらの用途のほとんどは、脳切片および神経細胞培養物に限られていました。最近、この技術は、全体の臓器に適用されています。センサ設計の進歩は、血液灌流生体腎臓内での細胞のシグナル伝達の測定を可能にしました。現在のプロトコルは、ラット腎臓の間質におけるATP と H 2 O 2のシグナル伝達を測定するために必要な手順を示します。二つの別々のセンサ設計は、 エキソビボおよびインビボのプロトコールにおいて使用されます 。センサーの両方のタイプは、高速応答、高感度かつ選択的なバイオセンサーを与えるために選択透過性層の上に薄い酵素生物層で被覆されています。選択透過性膜は、生体組織内の干渉から信号を保護し、酵素層は、グリセロールキナーゼとグリセロール-3- PHOSの連続触媒反応を利用しATPの存在下で酸塩オキシダーゼはH 2 O 2を生成します。 ex vivoでの研究のために使用されるセンサのセットは、さらに、白金/イリジウム白金（Pt-IR）は、ワイヤ電極の上にH 2 O 2の酸化による分析物を検出しました。 in vivoでの研究のためのセンサーではなく、血液灌流組織のために設計されたメディエータコーティングされた金電極上のH 2 O 2の還元に基づいています。最終濃度の変化は、分析物の既知濃度のキャリブレーションに続いて、リアルタイムの電流測定により検出されます。また、電流測定信号の特異性は、それに対応し、H 2 O 2及びATPを分解し、そのようなカタラーゼやアピラーゼなどの酵素を添加することによって確認することができます。これらのセンサは、各実験の前と後の正確なキャリブレーションに大きく依存しています。次の2つのプロトコルは、ATPとH 2のリアルタイム検出の研究を確立します腎組織中のO 2は 、さらに他の生物学的製剤または全臓器での使用のために記載した方法を拡張するために改変することができます。
Introduction
（も、本原稿内のセンサとして参照）酵素微小電極のバイオセンサーは、生細胞や組織におけるダイナミックなシグナル伝達プロセスを研究するための貴重なツールとなっています。センサーは、生物学的に関連する濃度で、細胞シグナル伝達分子の時間的および空間分解能が向上してい。サンプリングと長期間にわたって間隔で採取した細胞外体液を分析する代わりに、これらのセンサは、高速、その酵素は、それによってリアルタイム測定1,2を製造 、分析物に反応するように反応します。高速プリンまたは過酸化水素のようなオートクリンおよびパラクリン因子の間質濃度の検出、及びそれらの放出の動力学は、正常および病的状態3における薬剤の効果のプロファイルを確立するために使用することができます。現在、センサを使用するアプリケーションの大部分は、脳組織切片および細胞培養物4-10にされています。この原稿を目的に詳細なプロトコル正確全体腎臓中の分析物のリアルタイムの濃度を測定する手段を確立します。
以下のプロトコルは、腎臓で間質ATP及びH 2 O 2シグナル伝達を研究するために開発されました。腎臓のネイティブ環境では、細胞外ATPは急速にその誘導体（ADP、AMPおよびアデノシン）に内因性ectonucleotidasesによって異化されます。ここで使用されるセンサは、他のプリンまたはATPの分解生成物11の上に、ATPに高度に選択的です。それはATP放出とそのシグナル伝達機能の定数と動的濃度の正確なモニタリングを可能にするので、これは大きな利点を提供しています。間質ATP濃度は、二つの微小電極、ATPセンサ及びヌルセンサーの組み合わせを使用して測定されます。カタラーゼのアプリケーションとの組み合わせでヌルのセンサは、間質H 2 O 2濃度12を検出することができます 。次のプロトコルは、戦争の二つの異なるデザインを使用しますエキソビボまたはインビボのいずれかのアプリケーションでのための最適な特性を持つRS。
両方の設計は、センサ酵素層中に含まれるグリセロールキナーゼとグリセロール-3-リン酸オキシダーゼの逐次触媒反応に基づいており、ATPの存在によって駆動されます。 ex vivoでの研究で使用されるセンサのセットでは、H 2 O 2、最終酵素反応生成物は、白金/イリジウム白金（Pt-IR）は、ワイヤ電極上の酸化によって検出されます。 in vivoでの研究のためのセンサーではなく、血液灌流組織のために設計されたメディエータコーティングされた金電極上に2 O 2還元 Hに基づいています。 図1に示す本原稿に記載され両方のプロトコルのスキームです。それが結合酵素を欠いている以外ヌルセンサーは、対応するATPセンサーと同じです。したがって、カタラーゼ酵素とH 2 O 2の検出に加えて、ヌルセンサMEAsures非特異的な干渉を。 ATP濃度は、ATPセンサ信号からの非特異的な干渉および背景H 2 O 2を検出したヌルを減算することによって計算されます。対応するヌルと対になったときに、いくつかのセンサは、アデノシン、ionosine、ヒポキサンチン、アセチルコリン、コリン、グルタミン酸、グルコース、乳酸、ex vivoでのアプリケーションまたはアデノシン、ionosine、およびin vivoのためのヒポキサンチンのためのD-セリンを含む他の検体を検出するために、市販されていますセンサー。
正確に検体を検出するためのセンサの能力は、適切な前後のキャリブレーション13に依存します。これは、分析は、生物学的組織での使用時に発生するセンサ感度のドリフトを占めていることを保証します。センサは、センサの酵素反応における試薬として使用されるグリセロールのデポを保持しています。センサはグリセロールを含む浴溶液中で使用されていない場合、それは時間をかけて洗います。短いRecording回次に、センサドリフトを最小化するために必要です。さらに、内因性プロテアーゼとタンパク質断片によって汚れセンサーが大きく、センサ14の感度を減少させることができます。
現在の原稿は 、ex vivo およびインビボ腎臓製剤中の酵素微小電極のバイオセンサーの使用を確立します。リアルタイムの分析物の定量化は、腎疾患や薬剤のメカニズムに新たな洞察を明らかにすることができる細胞内シグナル伝達の前例のない詳細を提供します。
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Protocol
実験動物の管理と使用に関するNIHガイドに付着した以下の動物手順。事前承認は、施設内動物管理使用委員会（IACUC）から入手しました。
注：センサーメーカーの説明書のレビューは、実験の設計時およびそれらの使用前に行われるべきです。センサーを使用している場合、これらの命令に従うことで、最適な結果が得られます。
1.センサーのキャリブレーション
- 実験の開始前に、新鮮なストック溶液を準備します。
- 10mMのNaPi緩衝液、100mMのNaCl、1mMのMgCl 2、2mMのグリセロールを含む緩衝液Aを作成します。 NaOHを用いてpHを7.4に調整します。 2〜8℃で保存してください。
- -20℃で保存株式ATP濃度（100 mm）を使用して、緩衝液Aの90μlに10μlの株式を追加することにより、新鮮な10 mMのATP校正ソリューションを作成
- トンにその先端（ 図2）を配置することにより、ATPセンサーを再水和2〜8℃で少なくとも10分間、緩衝液Aを含む彼水分補給室。
注：再水和の後、センサは、以上20秒間空気に曝されるべきではないか、センサ感度が低下することがあります。空気に長時間露光が予想される場合は、グリセロールの溶液に簡単にセンサーを浸し。センサは、複数の実験のために使用することができるが、これらは、センサ水分補給と同じ日に行われなければなりません。センサは、最大24時間、緩衝液Aでの再水和チャンバ内に格納することができます。 - デュアルチャネルポテンショスタット（ 図3）をオンにし、記録システムソフトウェアを起動します。
- 校正室に緩衝液Aプレイス3mlの基準電極との校正室を準備します。その後、マニピュレータに取り付け、キャリブレーションチャンバ溶液に挿入し、再水和室から各センサーを取ります。
注：校正室のような標準的なシリコンコーティングされたシャーレを使用します。すべてのキャリブレーションを実施し、ST電流測定の記録（ 図4）の間に信号ノイズを低減するために、高性能ラボ空気テーブルにファラデーケージ内udies。キャリブレーションは、最高の可能な限りのデータ収集の開始に近くで行われています。 インビボ用途のためのキャリブレーションのための最適な時間は、動物の手術後の回復期間の間にあります。 - ex vivoでのキャリブレーション
- 10サイクルのための100 mVの/秒の速度で500 mVのに-500 mVのからセンサーを循環させることにより、校正室でのサイクリックボルタンメトリーを実行します。これは非常に、センサの感度を向上させます。 10サイクルから見たトレースについては、図5を参照してください 。
- 最後のサイクルの後に600 mVのにセンサーを分極。センサ電流は、漸近線に減衰します。安定した読み取りが5分の最小後に達成されます。ゼロ読書を記録します。
- インビボセンサ較正で
- in vivoでの戦争にサイクリックボルタンメトリーを実行しないでくださいRS。代わりに、500 mVで30秒間の較正室にセンサを偏光。その後、0 mVのにポテンショスタットを設定し、センサ電流が漸近線に上昇することができます。センサ電流は漸近線に少なくとも2分かかります。ゼロ読書を記録します。
- 連続して所望の検出範囲を網羅する検量線を生成するためにチャンバー内にATP溶液のセット量を追加します。 ATP溶液は、ATPがチャンバ全体に均等に拡散するにつれて減衰が続く、最初にセンサ信号に鋭いピークを生成します。記録信号の値は、信号レベル一旦各ATPを添加した後、図6A及び図7のトレースを安定化し、それぞれ、 インビボ研究の両方エキソビボおよび内 ATP濃度を示唆しています。
注：これは、分析物の捕捉剤を使用することにより、電極の選択性を確認することが重要です。現在のプロトコルは<HのためのATPセンサーとカタラーゼの特異性をテストするためにアピラーゼを使用しましたサブ> 2 O 2信号（ 図6B）。薬物を投与する場合は、センサーとの反応性の測定は、試験の前に決定されるべきです。 - ATPセンサー（ゼロレベル（ 図7）に削減する必要があり、ATPのアプリケーションによって生成される電流の特異性をテストするために2 mg / mlの（89 UN / mg）をストックからアピラーゼの3μLを追加します。
- ヌルセンサー（H 2 O 2のアプリケーションによって生成される電流がゼロの読み取りに減らす必要があります）の特異性をテストするために2mg / mlの（100 UN / mg）をストックからカタラーゼの3μLを追加します。
センサーの研究2.動物の手術
- ex vivoでの手術
- イソフルラン（5％誘導、1.5〜2.5％のメンテナンス）/医療グレードのO 2または他の承認された方法で実験動物を麻酔。15 '12動物は、継続的に、麻酔の適切なレベルを確保するために監視されなければなりません。セントできる呼吸数及びつま先ピンチ反応は、適切な麻酔を確認するために使用されます。
注：承認済みIACUCプロトコルに従って動物を安楽死させます。すべての非生存手続きの完了時に動物12の人道的な終焉を確実にするために開胸誘導気胸により深く麻酔をかけた動物を安楽死させます。 - 仰臥位で温度制御手術台の上にラットを置きます。適切な麻酔深度を維持しながら、左腎臓に沿って約5cmの正中切開を行い、遠位腹部大動脈を露出させます。
- 腹腔と上腸間膜動脈、およびこれらの動脈上の腹部大動脈の周りの合字をラップするが連結しないでください。腎動脈下の腹部大動脈約2合字を包みます。
- 合字以上の腹部大動脈をクランプします。下の合字を接続します。ポリエチレン管（PE50）と腹部大動脈をカテーテルを挿入。二大動脈結紮でカテーテルを固定します。
- クランプを外し、腸間膜や腹腔動脈を結紮。腎臓が完全にブランチングされるまで2〜3分間室温でハンクス平衡塩溶液で6 ml /分で腎臓を灌流。
- 大動脈の一部を接続腎臓およびカテーテルを、切り出します。浴溶液を充填した3ミリリットルのペトリ皿に腎臓を置きます。
注：実験プロトコルは、室温で行うことができます。 145のNaCl、4.5のKCl、2のMgCl 2、1のCaCl 2、10 HEPES、NaOHでpH調整7.35：浴溶液はmm含まれています。
- イソフルラン（5％誘導、1.5〜2.5％のメンテナンス）/医療グレードのO 2または他の承認された方法で実験動物を麻酔。15 '12動物は、継続的に、麻酔の適切なレベルを確保するために監視されなければなりません。セントできる呼吸数及びつま先ピンチ反応は、適切な麻酔を確認するために使用されます。
- in vivoでの手術
- 承認されたIACUCプロトコルを用いてラットを麻酔。 in vivoでの分析のためにケタミン（20 mgの/ kgのIM）とinactin（50ミリグラム/ kg、腹腔内）でラットを麻酔。動物は、継続的に、麻酔の適切なレベルを確保するために監視されなければなりません。安定した呼吸数及びつま先ピンチ反応は、適切な麻酔を確認するために使用されます。
- 適切な麻酔深度が得られた後edは、エアテーブルの上に配置された温度制御された接地面上に仰臥位にラットを配置します。表面は、予熱し36℃に維持されるべきです。
- 適切な麻酔深度を維持しながら、正中切開腎臓に沿って約5cmを作ります。
- 腎臓全体が表示されるように、皮膚や皮下組織を偏向し、固定するために縫合糸を使用してください。あらゆる動きアーチファクトを最小限にするために腎臓カップに腎臓を置きます。
- 血液量を維持するために、頚静脈を介して1ミリリットル/ 100グラム/時で0.9％のNaCl：2％BSAのIV注入を使用します。尿採取のための両方の尿管にカニューレを挿入。上腸間膜や腹腔動脈と腎灌流圧（ 図10A）を操作するための遠位大動脈の周りに置きネクタイ。
- 薬剤の適用は、in vivo実験中に必要とされる場合、間質カテーテルの挿入は、（ 図10Bに推奨されます
3.データ集録のセットアップ
- データ収集プログラムを開き、両方のex vivoおよび陽極ポジティブにin vivo実験のためにその極性を設定します。 ASCIIコードなどのデータを保存するためのプログラムを設定します。
- 腎臓へのセンサーの迅速な挿入のためのマイクロマニピュレーターを置きます。
注：別の方法として、センサーの所望の配置を達成するためにマイクロマニピュレータに取り付けられたダミープローブを使用しています。 - エクスビボデータ収集
- 650μL/ minの一定速度でカニューレを挿入し、大動脈を介して（2.1.6）から浴溶液で腎臓を灌流。手術用ハサミを使用して、慎重にセンサ挿入するために必要な腎臓カプセルを、削除してください。
- ゴムバンド腎臓の上に縛り付けとピンとシリコーンコートディッシュに付着して腎臓を固定します。
- に沈め、その先端とペトリ皿の中で腎臓に近い基準電極を配置緩衝溶液。
- インビボでのデータ取得で
- 腎臓カップに腎臓を置きます。動物の歪みや年齢に応じて緩やかに腎臓を保持しているカップのサイズを使用します。8に示す腎臓カップの2つのサイズを図 。同様のカップは、微小穿刺等16と腎臓機能の分析に焦点を当てた異なる生理学的なアプローチのために使用されます。
注意：腎臓カップの位置は、動物の呼吸によって生成された機械的ノイズを除去することが重要ですが、妨害または腎臓灌流または尿の流れを遮断しないようにしてください。 - データ収集を行う前に、回復時間の45分を許可します。
- 26-30G針を使用して、腎臓におけるセンサーの所望の位置と深さでパンク穴を作ります。滲出血液を除去するために表面の穴を吸い取ります。腎臓の表面にグリセロール溶液を加えます。これは、実験中に乾燥から腎臓表面を防ぐことができます。 再水和室から第一のセンサを取り外し、マイクロマニピュレータに取り付けます。すぐに、20秒以内に、腎臓における新規に作成した穴に電極を挿入します。繰り返しヌルセンサーの3.5から3.9を繰り返します。
- センサからから約1cm、腎臓に参照電極を挿入します。
- 腎臓カップに腎臓を置きます。動物の歪みや年齢に応じて緩やかに腎臓を保持しているカップのサイズを使用します。8に示す腎臓カップの2つのサイズを図 。同様のカップは、微小穿刺等16と腎臓機能の分析に焦点を当てた異なる生理学的なアプローチのために使用されます。
- ポテンショスタットをオンにして、コンピューター上の記録プログラムを活性化させる。 図9は、ex vivoで腎臓データ収集の最終セットアップを示します。 図10は、挿入されたカテーテルを用いたインビボ腎臓データ収集の最終セットアップを示します。
4.データ解析
- 起源または他の同様のソフトウェアへのASCIIデータファイルをインポートします。
- 集中現在の関係
- 現在まで直線濃度（x軸 ）を構築するために、ATPまたはH 2（Y -軸）の関係を線形フィット/外挿機能を使用2の較正点（ 図6および図7）。
線形適合ライン：Y = MX + B
- 現在まで直線濃度（x軸 ）を構築するために、ATPまたはH 2（Y -軸）の関係を線形フィット/外挿機能を使用2の較正点（ 図6および図7）。
- 濃度への電流を同一視
- 細胞内ATPによって生成される実際の電流を得るためにATPセンサのものからヌルセンサの測定されたトレースを引きます。
- 4.2.1で詳述した較正式を用いてnmの電流測定により得られたpAの中のATP値に変換します。 「X」の値にそれぞれ調整電流をインポートするとy（分析物の濃度）を解くことにより、ATPセンサの減算データトレースの濃度を決定します。
- 必要に応じて同様に、その検量線からH 2 O 2濃度を算出。
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Representative Results
酵素微小電極のバイオセンサーの設計は、いずれかのエキソビボまたはインビボ研究の一般的実験計画を図1【選択を使用するセンサや外科的処置に示されている。全体の腎臓中の分析物のリアルタイム検出を可能にするかどうか調査によって異なりますエクスビボまたはインビボです 。
再現性のある結果、正確な前後のキャリブレーションを得るためにある重要。 図6Aは、校正中にex vivoでのATPセンサーから見た信号の代表的なトレースを示しています。すぐにアピラーゼ（注）は、ATP信号を排除しました。カタラーゼは、ATPの信号に影響を及ぼさなかったし、それが（ 図6B）を生成するH 2 O 2への特異性を示します。較正手順は、ATP（ 図6A、右パネル）の動的な変化を計算するために使用される線形近似を生成する。VIにVOセンサ校正は 、生体外のセンサと同様のトレースを生成します。しかし、このセンサーではなく、酸化電流の還元を検出し、生産、現在のように、負です。これらのセンサのキャリブレーションも0.3〜80μMの範囲で直線フィット（ 図7A右パネル）を生成します。他のプリン製品に比べATPに対するin vivoでのセンサの特異性は、 図7Bに示されています。
ここに記載されたアプローチは、私たちは内因性物質と薬物注入12に応答して、急性変化の両方の基礎レベルを測定することができます。 図11に示すの耐塩性と食塩感受性ラットにおけるH 2 O 2の間質内因性濃度のアンギオテンシンII誘発性の変化です。これらの実験では、スプラーグ・ドーリー（SD）またはダール食塩感受性（SS）ラットから新たに単離した腎臓は、一定の層流（650μL/分）の下で、1μMのAngIIで灌流しました。笙としてWN 図11に 、アンギオテンシンIIは、SDおよびSSラットの両方からの腎臓におけるH 2 O 2の急性放出を誘発します。しかし、それぞれの応答の最大振幅が大きく、動物を高塩分食12を供給した場合は特に、SSラットにおいて上昇しました。 インビボでのバイオセンサーの代表的な用途は、 図12に示されています。カタラーゼ（5μg/ mlの）バイオセンサーによって検出された完全にブロックH 2 O 2信号の注入。これらの実験は、内因性物質と薬理学的介入に応答して、それらの放出のリアルタイム測定の基礎レベルを検出するための電流測定技術と組み合わせて、特定の酵素バイオセンサーの使用方法を説明します。このアプローチのさらなる用途は、食塩感受性高血圧のような腎臓の病理の知識と理解を向上させるプリンシグナリングおよび過酸化水素の役割を研究するために、腎臓の牛idativeストレスや慢性腎臓病。
プロトコルの図1の回路図。目的の分析物とその特異性をテストするとキャリブレーションは、実験開始直前に行われます。 in vivoでのプロトコルは、薬理学的用途のための複雑な生理学的な実験およびエクスビボのために従うべきです。ポスト実験校正が行われ、データ分析の際に考慮すべきである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2。酵素微小電極センサー。2ex vivoでの用途のために使用されるセンサのサイズは、50ミクロンと125ミクロンの直径を示しています。各センサワイヤは、金エンドコネクタ（図示せず）に接続するために、毛細管内に延びています。挿入図は、ATP検出のための酵素でコーティングされたセンサーチップを示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3。デュアルチャネルポテンショスタット。CH1とCH2ラベルポテンショスタットチャンネル。 1）CH1のATPセンサ接続および2）CH2ヌルセンサ接続3）電気参照電極に接続されている接続。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図4。センサーの設定は、データの収集は、電気的ノイズを低減するファラデーケージおよび振動のない作業面用の高性能ラボテーブル上で行われます。 1）温度制御された手術台は、マイクロマニピュレーターは、光源が外科的処置及びセンサ挿入4のために必要とされる実験3）中のセンサの柔軟な位置決めのための磁気取付アダプタに接続されている）、生理学的実験2中の動物の体温を維持するために使用されます）デュアルチャネルポテンショスタット5）センサー用ホルダー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図5。 。ex vivoでの研究のために、センサーサイクリックボルタンメトリーは、従来のキャリブレーションプロトコルに-0.5と0.5 Vとの10サイクル実施されるサイクリックボルタンメトリーは 、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6。 エクスビボアンペロメトリー校正。（A）は、キャリブレーションは、浴溶液に知られているATP濃度の追加を使用しています。漸近線レベル（黒のトレース）で記録されたアンペロメトリック値に対応します。電流は較正方程式を作成し得ます。例は、右側のパネルに表示されています。赤のトレースはcurreですNTのH 2 O 2の添加のみに応答するヌルセンサーの。 （B）ヌルセンサを浴溶液と電流測定値が記録されて漸近線（細い黒矢印）に知られているH 2 O 2濃度（赤矢印）を添加して較正されます。浴溶液（太い黒矢印）へのカタラーゼの添加は、急速な電流減衰になります。右側のパネルには、ヌルセンサ校正式を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図7。電流測定のためのキャリブレーション; インビボにおけるインビボ電極の校正が還元反応を除いてex vivoでの研究で、その詳細と同様に行われるが、逆電流（極性）を引き起こします。 （A）は、公知のATP濃度の添加は、ATPセンサー（黒のトレース）のアンペロメトリック電流を生成するが、ヌルセンサー（赤線）には影響しません。アピラーゼの添加は、ATPセンサーの電流を消滅させます。 （B）ATPセンサの特異性は、異なるプリン作動薬（UTP、UDP、およびアデノシン）の10μMを添加することによって確認されます。 ATPのさらなる用途は、安定した検出可能なアンペロメトリック電流を供給します。 （C）メディエータコーティングされた金電極に基づいて、in vivoでのセンサーの顕微鏡写真。 このfiguの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください再。
図8。腎臓カップ。 インビボ研究では、腎臓をまだ示したステンレス製の腎臓カップを使用して開催されます。カップの2つのサイズが、腎臓サイズの変化に適応するために使用されます。これらのカップは、動物の呼吸によって生成される運動アーチファクトを低減。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図9. エクスビボ単離され、灌流腎臓。孤立した腎臓は、厚さのSiでコーティングされた1）ペトリ皿に置かれますピン挿入2用licone下）、腎動脈は、実験3の間にカニューレを挿入し、一定の灌流用シリンジポンプに接続されている）は、ATPセンサー、4）とヌルセンサーは腎臓5に挿入されている）参照電極は水没し、腎臓の近くに配置され、浴溶液に。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
生体内の血液灌流腎臓では図10（A）左の腎臓は腎臓カップに露出して配置され、右の腎臓は、動物の内部そのまま残ります。両方のセンサは、腎臓内に挿入されます。 BSA：NaClのはBの原因となった流体損失を相殺するためにカテーテルを挿入頚静脈を介して注入され、Yダイレクト理学的用途のために移植された間質カテーテルを用いたin vivo実験の大ミッドライン切開（B）実施例1）腎臓は腎臓カップ2に保持されている）は、ATPセンサー3）ヌルセンサーと4）参照電極が挿入されています腎臓5）カテーテル腎臓に移植し、層状の薬理学的な注入のための蠕動ポンプに接続されている。の腹面に、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
H 2の図11. 生体外分析 腎臓におけるサブ> O 2。アンギオテンシンII灌流は、ラット腎皮質中のH 2 O 2放出を引き起こします。 （A）は、平均の実時間変化N = 8のアプリケーションの合計からのH 2 O 2濃度 （グレーのバーは標準誤差を示す）（4匹の異なるラットから4腎臓）。上のバーは、アンギオテンシンIIのアプリケーションを表します。スプラーグ・ドーリー（SD）とダール食塩感受性（SS）ラットでのAng II灌流中に（B）最大のH 2 O 2濃度の振幅値は、それぞれ、低および高塩分食を供給しました。 * - P <SDラット対0.05。数値は、許可を得て参考文献12から適合されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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H 2 O 2 の in vivo 解析では、図12（図10（b）に示すように）。SSラットの髄質中の格子間のH 2 O 2濃度の in vivo評価の例は、低塩食を与え。 5分間隔での移植されたカテーテルを介したカタラーゼの間質適用は腎髄質中のH 2 O 2信号の完全な封鎖を生産しました。カタラーゼの減少は、腎臓の血流による洗い出しから、追加のカタラーゼアプリケーション（10分）によって再びブロックされた信号の部分的な回復をもたらした。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
現在のプロトコルは、ATPの強化時間・空間分解能を提供するために開発したex vivoでの灌流、単離され、in vivoでの血液灌流腎臓用のH 2 O 2シグナリングが。プロトコルと、ここで使用されるセンサとの違いは、薬理学的薬剤または生理学的研究のいずれかに最適なデータ収集を提供します。プロトコルは、1）センサ較正、2）外科的処置、3）データ収集の設定、及び4）データ分析から成ります。彼らは、多くの実験条件のための検体のリアルタイム測定を可能にします。これは、より大きな腎疾患への洞察と、より効果的な薬理学的治療法の開発につながります。ここでは、ATP と H 2 O 2 を分析するためのセンサを使用していました。しかし、他の物質のためのセンサも使用可能であり、使用することができます。ここで説明するプロトコルは、ラットの腎臓でのATP および H 2 O 2を研究するために適用されるが、同じメトましたdは簡単にマウスでのアプリケーションのために調整することができます。したがって、このアプローチは、遺伝的げっ歯類モデルの存在を考慮大きな可能性を秘めています。
酵素微小電極のバイオセンサーの基本設計は、クラークとライオンズ2によって1960年代に開発されました。バイオセンサーの初期開発に続いて、進歩が設計17-19とアプリケーション20の両方で行われています。 Llaudet ら 21,22は、酵素コーティングにCosneir ら 23からメソッドを使用して、本プロトコルで使用ATPセンサの原理デザインを開発しました。これらのセンサは、脳アストロサイト8からのATP放出、4,24呼吸の制御、および骨格筋細動脈の規制25を含む生理学的プロセスの数にATPシグナリングを検出しました。最近エキソビボプロトコルは、腎臓12におけるATPシグナルを測定するために使用されてきました。この原稿iの目標腎臓におけるATPなどの内因性物質の検出のための効果的な方向性と洞察を提供することです。
酵素微小電極のバイオセンサーは、生体内での検体を測定する既存の手段に比べて多くの利点を有しています。しかし、特別な予防策は、他の新しい方法として、このアプローチを使用する必要があります。確立されたアプローチの検証は、得られたデータの信頼性を提供します。先に説明したように26,27、例えば、微小透析の測定を行いました。有意差は、センサ及び透析サンプル12から得られたものによって決定されるピーク濃度との間で観察されませんでした。微小透析の制限は、それが唯一の分析物の定常状態レベルを測定することです。このように、細胞シグナル伝達の動的変化の評価は、酵素の微小電極のバイオセンサーを使用して達成することができます。センサ応答時間の工場仕様は、センサー間で異なりますタイプ。 エクスビボセンサは5〜10秒の90％〜10からの信号の立ち上がりのために30〜35秒の生体センサにおける応答時間を持っています。キャリブレーショントレース（ 図6及び7）は 、分析物の添加/除去の時間分解能を示します。両方のセンサーとマイクロダイアリシスの手法については、分析物によって生成される信号を遮断する特異的な酵素の使用は、特異性を確保するために必要とされます。
記載されているプロトコルは、いくつかの課題があります。組織への任意のセンサの挿入と同様に、組織の損傷が発生しません。これは、測定値28に影響を与える可能性のシグナル伝達経路を活性化できます。細胞の損傷を最小限に抑えるために、より薄いセンサが必要とされるであろう。しかし、針は、小さな入口穴を作るために使用されるようにセンサを腎臓被膜を貫通することは困難です。シンセンサーは挿入時にそのコーティングを曲げると破壊する可能性が高くなります。大きな直径センサは曲げとresultaより耐性がありますそのコーティングに損傷を与えるNT。 図3は薄く、厚いセンサを示します。曲げ厚いセンサの抵抗に加えて、それらは、酵素層に増加保護を提供し、コーティングの厚い層を含みます。厚いセンサを使用することによって引き起こされる組織損傷の懸念は、脳組織であろうよりも腎臓でかなり少なかったです。挿入深さは、近似され、腎臓での測定が完了した後、最終的な配置が確認する必要があります。挿入ガイドとしてセンサーチップの長さを使用して、皮質と髄質層の間の推定とセンサーチップが0.5mmであり、腎皮質2-3 mm厚であるように十分です。センサーの汚れはまた、このように一つの実験に生体内プロトコルで長いのセンサの使用を制限し、血液中の大きな割合で発生します。 1〜1 1/2時間の録音時間はわずかセンサードリフトが生じました。主な基準縮小センサの性能を評価することは低感度であります較正プロセス中に検体に。増加した電気的ノイズ、ベースライン電流の不安定性は、センサチップが破損していることを示すことができます。 ATPの正確な測定のために、両方のセンサ（ATPとヌル）は、信号の更なる減算のための同様のノイズと安定性特性を持つ必要があります。それ以外の場合は、センサの一つを交換する必要があります。低ノイズおよび低濃度の検体を検出するために、各動物のための新たなセンサの使用が提案されています。
いくつかのステップが成功した実験的な成果のために重要です。センサーは非常に脆弱であり、センサチップの損傷を避けるために慎重に取り扱われるべきです。また、再水和した後、センサは以上の20秒間空気にさらされるべきではありません。低ノイズの記録は組織における生体信号の検出に成功するために必要とされます。そのためには、高性能なラボエアテーブルと適切な電気的接地が必要です。分析対象DURの正確な量を追加します較正手順をると、実験における正確な濃度の決意が必要です。 ex vivoで腎臓手術で腎臓の良いクリアを達成することは成功の録音になります。キャリブレーションでの実験でアピラーゼとカタラーゼ酵素の使用は、センサ非特異的な感度の評価を可能にし、測定値を確認します。
これらのプロトコルは、腎臓における細胞外シグナルの大幅に強化詳細を提供します。センサーによって与えられる改良された感度と時間分解能は、私たちは疾患状態でシグナリングと以前に検出されなかった薬理学的操作を次のATPの変化を解決することを可能にします。 ex vivoでは腎臓に薬理学的用途の研究に最適ですながら、in vivoでのプロトコルは複雑な生理学的研究に適しています。ここで使用されるin vivoでのセンサの設計は、BLにおける干渉に対する前例のない抵抗を可能にしますOOD灌流組織。まとめると、これらのセンサは、既存のプロトコルおよび技術を用いて、以前は不可能であったアプリケーションを大量に提供します。
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Disclosures
この原稿のビデオ録画のためのセンサは、必ずSarissaバイオメディカル・リミテッド（コベントリー、UK）により提供されました。
Acknowledgments
私たちは、現在の原稿に使用されるセンサーの開発に自分の仕事のために必ずSarissaバイオメディカルを感謝しています。この研究は、国立心肺血液研究所HL 116264（A.カウリー）およびHL 122662（A. StaruschenkoとA.カウリー）、医科大学によって資金を供給プロジェクト、HL108880（A. Staruschenko）を付与することによってサポートされていましたウィスコンシン調査委員会の＃9306830（O. Palygin）と健康ウィスコンシン研究教育プログラム＃9520217を推進、国立腎臓財団の若手研究グラント（O. Palygin）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sensor Kit | Sarissa Biomedical | SBK-ATP-05-125 | The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes. Also included with the kit is the user's choice of sensors. |
| Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-ATP-05-125 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissagold ATP Biosensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-ATP-10-50 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissaprobe null sensor 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-NUL-20-125 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissagold null sensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-NUL-10-50 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissaprobe ATP Manual | Sarissa Biomedical | http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf | |
| Faraday cage | TMC | ||
| Dual channel potentiostat | Digi-Ivy | DY2021 | Type II Faraday cage |
| Data acquisition program | Digi-Ivy | DY2000 | |
| Perfusion pump | Razel Scientific Instruments | Model R99E | |
| Fiber optic illuminator | Schott | ACE 1 | |
| micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| micromanipulator magnetic stand | Narishige | GJ-8 | |
| air table | TMC | 63-500 | |
| isoflurane ventilator | LEI Medical | M2000 | |
| 3 ml petri dish | Fisher Scientific | S3358OA | |
| needle | Santa Cruz | 26-30 G | |
| pins | Standard dissection pins | ||
| catheter | Polyethylene tubing (PE50) | ||
| catheter tissue glue | Vetbond | 1469SB | |
| suture | Look | SP117 | |
| rubber bands | any 2-4 mm wide rubber bands | ||
| silicone | Momentive | RTV-615 Clear 1# | |
| clamp | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| standard dissection kit | Kit should include scalpel and dissection sissors | ||
| Kidney Cup | Of own design | ||
| standard chemicals | Sigma-Aldrich | ||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | 100 mM ATP solution |
| hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A7646 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| isoflurane | Clipper | 10250 | |
| inactin | Sigma-Aldrich | T133 | |
| ketamine | Clipper | 2010012 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 |
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