Abstract
Enzymatische micro-elektrode biosensoren zijn op grote schaal gebruikt om extracellulaire signalen in real-time te meten. De meeste van hun gebruik is beperkt tot hersencoupes en neuronale celkweken. Recentelijk is deze technologie toegepast op het gehele organen. Vooruitgang in de sensor ontwerp hebben mogelijk gemaakt door het meten van cell signaling in-bloed perfusie in vivo nieren. De huidige protocollen lijst van de stappen die nodig zijn om de ATP en H 2 O 2 signalering in de rat nier interstitium meten. Twee afzonderlijke sensor ontwerpen worden gebruikt voor ex vivo en in vivo protocollen. Beide sensoren zijn bedekt met een dunne enzymatische biolayer bovenop een perm-selectiviteit laag snel reageert gevoelige en selectieve biosensoren geven. De perm-selectiviteit laag beschermt het signaal van de interfererende in biologisch weefsel, en de enzymatische laag maakt gebruik van de opeenvolgende katalytische omzetting van glycerol kinase en glycerol-3-fosfaatfosfaat oxidase in de aanwezigheid van ATP H 2 O 2 produceren. De set van sensoren die worden gebruikt voor de ex vivo studies verder gedetecteerd analyt door oxidatie van H 2 O 2 op een platina / iridium (Pt-Ir) draadelektrode. De sensoren voor de in vivo studies worden in plaats daarvan gebaseerd op de reductie van H 2 O 2 op een mediator beklede gouden electrode ontworpen voor bloed geperfuseerde weefsel. De eindconcentratie wijzigingen worden gedetecteerd door real-time amperometrie gevolgd door kalibrering met bekende concentraties analyt. Bovendien kan de specificiteit van de amperometrische signaal bevestigd door de toevoeging van enzymen zoals catalase en apyrase die breken H 2 O 2 en ATP dienovereenkomstig. Deze sensoren ook sterk afhankelijk van nauwkeurige ijking vóór en na elk experiment. De volgende twee protocollen stellen de studie van real-time detectie van ATP en H 2O 2 in nierweefsels en kunnen verder worden gemodificeerd om de beschreven werkwijze te breiden voor gebruik in andere biologische preparaten of hele organen.
Introduction
Enzymatische micro-elektrode biosensoren (ook genoemd sensoren in dit manuscript) een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van dynamische processen signalering in levende cellen en weefsels is. De sensoren zorgen voor meer temporele en ruimtelijke resolutie van cell signaling moleculen in biologisch relevante concentraties. In plaats van bemonstering en analyse extracellulaire vloeistoffen genomen met tussenpozen gedurende lange tijdsperioden, deze sensoren antwoorden zo snel als de enzymen reageren op de analyt, onder vorming van real-time metingen 1,2. Snelle detectie van interstitiële concentraties van autocriene en paracriene factoren, zoals purinen of waterstofperoxide en de dynamiek van de vrijgave kan worden gebruikt om een profiel vast te stellen voor de effecten van drugs in normale en pathologische condities 3. Momenteel is de meerderheid van de applicaties met behulp van sensoren in hersenweefsel plakjes en celculturen 4-10 geweest. De protocollen beschreven in dit manuscript doelroepen om real-time concentraties analyten geheel nieren nauwkeurig te meten.
De volgende protocollen werden ontwikkeld om interstitiële ATP en H 2 O 2 signalering in nieren bestuderen. In de natuurlijke omgeving van de nier, wordt extracellulair ATP snel gekataboliseerd door endogene ectonucleotidases in zijn derivaten (ADP, AMP en adenosine). De hier gebruikte sensoren zijn zeer selectieve ATP boven andere purines of ATP afbraakproducten 11. Dit biedt een groot voordeel omdat het maakt nauwkeurige controle van de constante en dynamische concentraties ATP vrijgave en de signaleringsfunctie. Interstitiële ATP concentratie wordt gemeten met de combinatie van twee micro-elektroden, een ATP sensor en een sensor Null. De Null sensor in combinatie met catalase toepassingen kan interstitiële detecteren H 2 O 2 concentraties 12. De volgende protocollen gebruik maken van twee verschillende ontwerpen van Sensors die optimale eigenschappen voor zowel ex vivo en in vivo toepassingen.
Beide ontwerpen zijn gebaseerd op de achtereenvolgende katalytische omzetting van glycerol kinase en glycerol-3-fosfaat oxidase in een sensor enzymatische laag en wordt aangedreven door de aanwezigheid van ATP. In de set van sensoren die worden gebruikt in de ex vivo studies, H 2 O 2, het uiteindelijke enzymatische reactie product, wordt gedetecteerd door oxidatie over een platina / iridium (Pt-Ir) draadelektrode. Sensoren voor in vivo studies in plaats daarvan gebaseerd op H 2 O 2 korting op een mediator beklede gouden electrode ontworpen voor bloed geperfuseerde weefsel. Weergegeven in figuur 1 is een schema van beide protocollen in dit manuscript beschreven. De Null sensor identiek is met het overeenkomstige ATP sensor behalve het mist de gebonden enzymen. Daarom, in aanvulling op de detectie van H 2 O 2 met catalase enzym, de Null sensor meagelen niet-specifieke storingen. ATP concentraties worden berekend door de niet-specifieke Null gedetecteerde storingen en achtergrond H 2 O 2 van het ATP sensorsignaal. Meerdere sensoren zijn ook commercieel beschikbaar voor andere analyten zoals adenosine, ionosine, hypoxanthine, acetylcholine, choline, glutamaat, glucose, lactaat, d-serine voor ex vivo toepassingen of adenosine, ionosine en hypoxanthine voor in vivo detecteren wanneer deze is gekoppeld met de bijbehorende Null sensor.
Het vermogen van de sensor om nauwkeurig te detecteren analyten afhankelijk van de juiste pre- en post kalibraties 13. Dit zorgt ervoor dat de analyse verklaart de drift in sensorgevoeligheid die tijdens gebruik in biologische weefsels. De sensor heeft een depot van glycerol die wordt gebruikt als een reagens in de sensor enzymatische reacties. Als de sensor niet wordt gebruikt in bad oplossingen die glycerol, zal het uitspoelen tijd. Kortere rOpnam tijden zijn dan nodig om de sensor drift minimaliseren. Bovendien sensor aangroei van endogene proteasen en eiwitfragmenten kan sterk verminderen de gevoeligheid van de sensoren 14.
De onderhavige manuscript stelt het gebruik van micro-electrode enzymatische biosensoren voor ex vivo en in vivo nieren preparaten. Real-time te analyseren kwantificering biedt ongekend detail van cellulaire signalering die nieuwe inzichten in de mechanismen van nierziekten en farmacologische middelen kunnen onthullen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De volgende dierlijke procedures gehandeld op grond van de NIH Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren. Voorafgaande goedkeuring werd verkregen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC).
OPMERKING: Herziening van de sensor instructies van de fabrikant moet worden gedaan tijdens het experiment ontwerp en voorafgaand aan het gebruik ervan. Naar aanleiding van deze instructies optimale resultaten bij gebruik van de sensoren.
1. Sensor Calibration
- Bereid verse stamoplossingen vóór de start van het experiment.
- Maak Buffer A met 10 mM NaPi-buffer, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2 en 2 mM glycerol. Breng de pH op 7,4 met NaOH. Bewaren bij 2-8 ° C.
- Met een voorraad ATP-concentratie (100 mM) bewaard bij -20 ° C, een frisse 10 mM ATP ijkoplossing door toevoeging van 10 ul bouillon aan 90 ui buffer A.
- Hydrateren de ATP sensor door het plaatsen van de punt (figuur 2) in tHij rehydratatie kamer die buffer A gedurende ten minste 10 minuten bij 2-8 ° C.
OPMERKING: Na rehydratatie de sensoren niet bloot aan lucht langer dan 20 sec of de gevoeligheid van de sensor kan worden verminderd. Als lange blootstelling aan lucht worden verwacht, dompel de sensor kort in een oplossing van glycerol. De sensoren kunnen worden gebruikt voor meerdere experimenten maar deze moet gebeuren op dezelfde dag als sensor rehydratatie. De sensoren kunnen worden opgeslagen in de rehydratie kamer met buffer A tot 24 uur. - Schakel de tweekanaals potentiostaat (figuur 3) en start de opname-systeemsoftware.
- Bereid een kalibratiekamer met 3 ml buffer A. Plaats de referentie-elektrode in de kalibratiekamer. Neem elke sensor uit de rehydratie kamer, dan hechten aan de manipulator en steek deze in de kalibratie kamer oplossing.
OPMERKING: Gebruik een standaard siliconen gecoate petrischaal als een kalibratie kamer. Voer alle kalibraties en studies in een kooi van Faraday op een high-performance lab lucht tafel signaal lawaai tijdens de amperometrie opnamen (figuur 4) te verminderen. Ijkingen best zo dicht mogelijk bij het begin van de gegevensverzameling mogelijk. Voor in vivo toepassingen de optimale tijd voor de kalibratie tijdens het dier na de operatie herstelperiode. - Ex vivo kalibratie
- Voer cyclische voltammetrie in de kalibratie kamer door fietsen de sensoren van -500 mV tot 500 mV bij een snelheid van 100 mV / sec gedurende 10 cycli. Dit verbetert sterk de gevoeligheid van de sensoren. Zie Figuur 5 voor de waargenomen uit de 10 cycli sporen.
- Polariseren de sensoren om 600 mV na de laatste cyclus. De sensor stroom zal vervallen tot een asymptoot. Een stabiele meting wordt verkregen na minimaal 5 min. Noteer de nul lezen.
- In vivo sensorkalibratie
- Laat de cyclische voltammetrie niet uit te voeren op de in vivo sensors. In plaats daarvan polariseren de sensor in de kalibratie kamer voor 30 sec tot 500 mV. Stel de potentiostaat tot 0 mV en laat de sensorstroom stijgen tot een asymptoot. De sensor stroom zal minstens 2 min naar asymptoot. Noteer de nul lezen.
- Achtereenvolgens set hoeveelheden ATP-oplossing toe te voegen in de kamer om een kalibratie lijn omvat een gewenste detectiebereik te produceren. De ATP-oplossing produceert een scherpe piek in het sensorsignaal aanvankelijk, gevolgd door een verval als ATP diffundeert gelijkmatig door de kamer. Record signaal waarden zodra het signaal niveau is gestabiliseerd na elke ATP toevoeging. Figuren 6A en 7 tonen sporen en stelde ATP concentraties voor zowel ex vivo en in vivo studies, respectievelijk.
NB: Het is belangrijk de selectiviteit van de elektrodes te bevestigen met behulp van aaseters van de analyten. Het huidige protocol gebruikt apyrase om de specificiteit van de ATP-sensor en catalase voor de H <testensub> 2 O 2 signaal (figuur 6B). Als geneesmiddelen worden toegediend, dienen metingen van hun reactiviteit met de sensoren worden vastgesteld vóór de studie. - Voeg 3 ul van apyrase uit een voorraad van 2 mg / ml (89 UN / mg) om specificiteit van de ATP sensor (actuele door ATP beroep te reduceren tot het nulniveau (figuur 7) te testen.
- Voeg 3 ul van catalase uit een voorraadoplossing van 2 mg / ml (100 UN / mg) om de specificiteit van de nul-sensor (de stroom door H 2 O 2 beroep te reduceren tot de nulwaarde) testen.
2. Animal Chirurgie Voor Sensor Studies
- Chirurgie voor ex vivo
- Verdoven van het proefdier met isofluraan (5% inductie, 1,5 tot 2,5% onderhoud) / medische kwaliteit O 2 of een andere goedgekeurde methode. 15 '12 dieren moeten voortdurend worden gecontroleerd om een adequaat niveau van anesthesie te garanderen. Ststaat ademfrequentie en teen knijpen reactie worden gebruikt om de juiste verdoving bevestigen.
Opmerking: Euthanaseren het dier volgens de goedgekeurde IACUC protocollen. Bij de voltooiing van alle niet-survival procedures euthanaseren diep verdoofde dieren door thoracotomie induceren pneumothorax aan de humane ondergang van het dier 12 te waarborgen. - Plaats de rat op een temperatuur-gecontroleerde chirurgische tafel in een liggende positie. Met behoud van een goede verdoving diepte, maakt een incisie van ongeveer 5 cm in lijn met de linker nier en de distale abdominale aorta bloot te leggen.
- Wikkel een ligatuur rond de buikholte en de superieure mesenteriale slagaders, en de abdominale aorta boven deze slagaders, maar niet ligeren. Wikkel twee ligaturen rondom de abdominale aorta onder de nierslagaderen.
- Klem de abdominale aorta boven de ligaturen. Bind de lagere ligatuur. Katheteriseren de abdominale aorta met een polyethyleen buis (PE50). Zet de katheter met de tweede aorta ligatuur.
- Verwijder de klem en ligeren de mesenteriale en coeliakie slagaders. Perfuseren van de nier bij 6 ml / min met Hanks gebalanceerde zoutoplossing bij kamertemperatuur 2-3 min tot de nier volledig geblancheerd.
- Accijnzen de nier en de katheter, verbonden gedeelte van de aorta. Plaats de nier in een 3 ml petrischaal gevuld met badoplossing.
Opmerking: Experiment protocol kan bij kamertemperatuur worden uitgevoerd. De badoplossing bevat in mM: 145 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, pH 7,35 ingesteld met NaOH.
- Verdoven van het proefdier met isofluraan (5% inductie, 1,5 tot 2,5% onderhoud) / medische kwaliteit O 2 of een andere goedgekeurde methode. 15 '12 dieren moeten voortdurend worden gecontroleerd om een adequaat niveau van anesthesie te garanderen. Ststaat ademfrequentie en teen knijpen reactie worden gebruikt om de juiste verdoving bevestigen.
- Chirurgie voor in vivo
- Verdoven van de rat met behulp van goedgekeurde IACUC protocollen. Voor in vivo analyse verdoven de ratten met ketamine (20 mg / kg im) en inactine (50 mg / kg ip). Dieren moeten voortdurend worden gecontroleerd om een adequaat niveau van anesthesie te garanderen. Een stabiele ademhaling en teen knijpen reactie worden gebruikt om de juiste verdoving bevestigen.
- Na een goede verdoving diepte is te verkrijgened, plaats de rat in een liggende positie op een temperatuur-gecontroleerde geaard oppervlak ligt aan de lucht tafel. De ondergrond moet worden voorverwarmd en gehandhaafd op 36 ° C.
- Met behoud van goede verdoving diepte, maakt een incisie van ongeveer 5 cm overeenkomstig de nieren.
- Gebruik een hechting te buigen en verankeren de huid en onderhuids weefsel, zodat het hele nier zichtbaar. Plaats de nier in een nier cup elke beweging artefacten te minimaliseren.
- Gebruik een intraveneuze infusie van 2% BSA: 0,9% NaCI bij 1 ml / 100 g / uur via de jugulaire ader bloedvolume te handhaven. Canule beide urineleiders voor urine collectie. Plaats de banden rond de superieure mesenteriale en coeliakie slagaders en de distale aorta voor het manipuleren van renale perfusie druk (figuur 10A).
- Indien de toepassing van farmacologische middelen is vereist tijdens de in vivo experimenten, is het inbrengen van een katheter interstitiële aanbevolen (figuren 10B
3. Data Acquisition Setup
- Open het data acquisitie programma en stel de polariteit zowel ex vivo en in vivo experimenten om anodische positief. Stel het programma om gegevens op te slaan als ASCII-code.
- Plaats de micromanipulators snel inbrengen van de sensoren in de nieren.
OPMERKING: U kunt ook gebruik maken van een dummy sonde verbonden aan de micromanipulator te helpen bereiken van de gewenste plaatsing van sensoren. - Ex vivo data-acquisitie
- Perfuseren de nieren badoplossing (van 2.1.6) via de aorta canule met een constante snelheid van 650 ul / min. Met behulp van chirurgische schaar, verwijder voorzichtig de nier capsule, die nodig is voor de sensor inbrengen is.
- Zet de nieren met elastiekjes vastgebonden over de nieren en aan de siliconen beklede schaal met pinnen.
- Plaats de referentie-elektrode nabij de nieren in de petrischaal met ondergedompelde inde bufferoplossing.
- In vivo data acquisitie
- Plaats de nier in een nier cup. Afhankelijk van de soort en de leeftijd van het dier gebruik een gewenst kopje dat de nier losjes houdt. Figuur 8 toont twee maten nier cups. Soortgelijke cups worden gebruikt voor verschillende fysiologische benaderingen gericht op de analyse van nierfunctie zoals micropuncture etc 16.
Opmerking: De positie van de nier cup is cruciaal voor de mechanische geluid van het dier ademhaling verwijderen maar mag niet verstoren of blokkeren nier perfusie of urinestroom. - Sta 45 min van herstel tijd voor het uitvoeren van het verzamelen van gegevens.
- Met een 26-30G naald, maak een gaatje op de gewenste locatie en diepte van de sensor in de nier. Dep het oppervlak gat straalde bloed te verwijderen. Voeg glycerol oplossing aan het oppervlak van de nier. Dit voorkomt dat de nier oppervlak uitdroogt tijdens het experiment. Verwijder de eerste sensor van de rehydratie kamer en bevestig deze aan de micromanipulator. Snel, binnen 20 seconden, plaats de elektrode in de vers gemaakt gat in de nier. Herhaal stap 3,5-3,9 voor de nul sensor.
- Plaats de referentie-elektrode in de nier, ongeveer 1 cm vanaf de sensoren.
- Plaats de nier in een nier cup. Afhankelijk van de soort en de leeftijd van het dier gebruik een gewenst kopje dat de nier losjes houdt. Figuur 8 toont twee maten nier cups. Soortgelijke cups worden gebruikt voor verschillende fysiologische benaderingen gericht op de analyse van nierfunctie zoals micropuncture etc 16.
- Zet de potentiostaat en activeert het opnameprogramma op de computer. Figuur 9 toont de uiteindelijke opstelling van de ex vivo nier data acquisitie. Figuur 10 toont de uiteindelijke opstelling van de in vivo nier data acquisitie met een ingebrachte katheter.
4. Data Analysis
- Importeer het ASCII-gegevensbestand in Origin of enige andere gelijksoortige software.
- Concentratie huidige relatie
- Gebruik de lineaire fit / extrapoleren functie om een lineaire concentratie (x-as) te bouwen om de huidige (y-as) relatie voor de ATP of H 2 2 kalibratiepunten (figuren 6 en 7).
lineaire fit lijn: y = mx + b
- Gebruik de lineaire fit / extrapoleren functie om een lineaire concentratie (x-as) te bouwen om de huidige (y-as) relatie voor de ATP of H 2 2 kalibratiepunten (figuren 6 en 7).
- Gelijk de stroom concentratie
- Trek de gemeten sporen van de null sensor van die van de ATP sensor om de werkelijke stroom door intracellulair ATP verkrijgen.
- Omzetten van de ATP-waarden in pA verkregen door amperometrie aan nm met behulp van de kalibratie vergelijking beschreven in 4.2.1. Bepaal de concentratie van de data afgetrokken spoor van de ATP sensor door de invoer van elke ingestelde stroom in de "x" waarde en het oplossen van y (de concentratie analyt).
- Evenzo berekent H 2 O 2 concentratie van de kalibratievergelijking indien nodig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het ontwerp van de micro-elektrode enzymatische biosensor maakt het real-time detectie van analyten geheel nieren. Het algemene experiment ontwerp voor zowel ex vivo en in vivo studies wordt geïllustreerd in figuur 1 .De sensors gebruikt en de chirurgische procedures verschillen naargelang de studie is ex vivo of in vivo.
Om reproduceerbare resultaten nauwkeurig pre- en post kalibraties verkrijgen cruciaal. Figuur 6A toont een representatief spoor van het signaal vanuit de ex vivo ATP sensor tijdens kalibratie. Merk op dat apyrase snel geëlimineerd de ATP-signaal. Catalase had geen invloed op het ATP-signaal en toont de specificiteit aan H 2 O 2 ontstaat (figuur 6B). De kalibratieprocedure produceert een lineaire aanpassing die wordt gebruikt om de dynamische veranderingen van ATP (Figuur 6A, rechter paneel) te berekenen. In vivo sensorkalibratie produceert een vergelijkbaar spoor met die van de ex vivo sensor. Echter, deze sensor detecteert reductieve plaats van oxidatieve stromen en als zodanig de stroom die negatief is. Kalibratie van deze sensoren produceert ook een lineaire fit in een 0,3-80 pM range (figuur 7A rechter paneel). Specificiteit van in vivo sensor ATP boven andere purine producten wordt getoond in figuur 7B.
De hier beschreven aanpak laat toe om zowel de basale niveaus van endogene stoffen en acute veranderingen in reactie op de toediening van het geneesmiddel 12 meten. Getoond in Figuur 11 is Ang II geïnduceerde veranderingen in interstitiële endogene concentratie van H 2 O 2 in zoutresistente en zoutgevoelige ratten. Voor deze experimenten werden vers geïsoleerde nieren uit Sprague Dawley (SD) of Dahl zoutgevoelige (SS) rat geperfuseerd met 1 uM Ang II onder constante laminaire stroming (650 pl / min). Zoals shown in figuur 11, Ang II induceert de acute release van H 2 O 2 in nieren van zowel SD en SS ratten. Echter, de maximale amplitude van elke reactie significant verhoogd bij ratten SS, vooral wanneer de dieren werden gevoed met een hoog zoutdieet 12. Getoond in Figuur 12 is een representatief toepassing van de biosensoren in vivo. De infusie van katalase (5 ug / ml) blokkeert volledig de H 2 O 2 gedetecteerd door de biosensor. Deze experimenten tonen het gebruik van specifieke enzymatische biosensoren combinatie met amperometrische techniek voor de detectie van basale niveaus van endogene substanties en real-time metingen waarop zij in reactie op farmacologische interventie. Verdere toepassingen van deze benadering om de rol van purinerge signalisatie en waterstofperoxide te bestuderen onze kennis van nierziekten zoals zoutgevoelige hypertensie verbeteren, renale oxidative stress en chronische nierziekte.
Figuur 1. Schematische voorstelling van de protocollen. Kalibratie met analyt en het testen van de specificiteit wordt gedaan onmiddellijk vóór het begin van de experimenten. De in vivo protocol moet worden gevolgd voor complexe fysiologische experimenten en ex vivo farmacologische toepassingen. Bericht experiment kalibratie moet worden gedaan en tijdens de data-analyse in aanmerking genomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Enzymatische micro-elektrode sensor. De tweesensorcapaciteiten voor ex vivo toepassingen zijn vertegenwoordigd, 50 um en 125 um diameter. Elke sensor draad zich uitstrekt in een capillair buisje te verbinden met een gouden eindverbindingsorgaan (niet getoond). Inzet toont een sensor tip bekleed met enzymen voor ATP-detectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Dual Channel Potentiostaat. De potentiostaat kanalen gelabeld CH1 en CH2. 1) CH1 het ATP-sensor aansluiting en 2) CH2 de Null sensor aansluiting 3) verbindingen die elektrisch worden gekoppeld aan de referentie-elektrode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
ass = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> 
Figuur 4. Sensor Setup. Het data acquisitie wordt uitgevoerd in een kooi van Faraday om elektrische ruis en een krachtige labotafel een trillingvrij werkoppervlak. 1) Een temperatuurgestuurde operatietafel gebruikt voor dierlijk lichaamstemperatuur tijdens fysiologische proeven 2 te handhaven) het micromanipulators worden tijdens experiment 3) een lichtbron nodig voor chirurgische procedures en sensor inbrengen 4 magnetische montage adapters voor flexibele positionering van de sensoren bevestigd ) dual channel potentiostaat 5) houder voor de sensoren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
p_upload / 53.059 / 53059fig5.jpg "/>
Figuur 5. Cyclische voltammetrie. Voor ex vivo studies, sensor cyclische voltammetrie wordt uitgevoerd voor 10 cycli tussen -0,5 en 0,5 V voorafgaand aan de kalibratie-protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Amperometrie kalibratie voor Ex Vivo. (A) Calibration gebruikt de toevoeging van bekende concentraties ATP om de badoplossing. Overeenkomstige amperometrische waarden opgenomen op het asymptoot niveau (zwart trace). De verkregen stromen creëren een kalibratievergelijking. Een voorbeeld wordt weergegeven op het rechter paneel. Het rode spoor is de current van de Null sensor die reageert alleen de toevoeging van H 2 O 2. (B) Het Null sensor wordt gekalibreerd met de toevoeging van bekende H 2 O 2 concentraties (rode pijl) aan de badoplossing en asymptoten amperometrische waarden worden geregistreerd (dunne zwarte pijlen). Toevoeging van catalase aan de badoplossing (dikke zwarte pijl) resulteert in snelle stroomafbouw. De rechter paneel toont de Null sensorkalibratie vergelijking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7. Kalibratie van amperometrie;. In vivo kalibratie van de elektrodes in vivo wordt uitgevoerd op soortgelijke wijze met die beschreven in de ex vivo studies behalve reductiereacties veroorzaken tegenstroom (polariteit). (A) Toevoeging van bekende concentraties van ATP produceert een amperometrische stroom op de ATP sensor (zwarte sporen), maar heeft geen effect op de Null sensor (rood trace). Toevoeging van apyrase dooft de stroom van de ATP sensor. (B) De specificiteit van het ATP sensor wordt bevestigd door de toevoeging van 10 uM van verschillende purinerge middelen (UTP, UDP en adenosine). Verdere toepassingen van ATP een stabiel detecteerbaar amperometrische stroom. (C) Microfoto van de in vivo sensoren op basis van een mediator gecoat gouden elektrode. Klik hier om een grotere versie van deze Figu bekijkenopnieuw.
Figuur 8. Nier Cups. In de in vivo studies, nieren worden gehouden steeds met behulp van de roestvrij stalen nier cups getoond. Twee groottes van koppen gebruikt om nier formaatvariant tegemoet. Deze bekers verminderen de beweging artefacten die worden gegenereerd door de ademhaling van het dier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9. Ex Vivo Geïsoleerd en doorbloed Nier. Is De geïsoleerde nier geplaatst in een 1) petrischaal bedekt met een dikke silicone bodem voor pin inbrengen 2) van de nierslagader wordt een canule en bevestigd aan een spuit pomp voor een constante perfusie tijdens experiment 3) het ATP-sensor, 4) en Null sensor in de nier 5) de referentie-elektrode wordt geplaatst in de buurt van de nier ondergedompeld gestoken in het bad oplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10. In Vivo Blood geperfuseerd nier. (A) De linker nier wordt blootgesteld en in een beker nier, de rechter nier blijft intact in het dier. Beide sensoren worden in de nier. BSA: NaCl wordt toegediend via de gecatheteriseerd halsader aan het tegengaan van de vochtverlies veroorzaakt by de grote middellijn incisie (B) Voorbeeld van het in vivo-experiment met een geïmplanteerde interstitiële katheter voor directe farmacologische toepassingen 1) de nier wordt gehouden door een nier cup 2) ATP sensor 3) Null sensor en 4) referentie electrode ingevoegd in het ventrale oppervlak van de nier 5) katheter geïmplanteerd in de nier en gekoppeld aan een peristaltische pomp voor laminaire farmacologische infusies. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 11. Ex Vivo Analyse van H 2 sub> O 2 in de nier. Ang II perfusie veroorzaakt H 2 O 2 afgifte in de rat niercortex. (A) Real time veranderingen van de gemiddelde H 2 O 2 concentratie (grijze balken tonen de standaardfout) van in totaal N = 8 toepassingen (4 nieren uit 4 verschillende ratten). Bars op de top vertegenwoordigen Ang II applicatie. (B) Het maximale H 2 O 2 concentratie amplitudewaarden in Ang II perfusie van Sprague Dawley (SD) en Dahl zoutgevoelige (SS) ratten die een lage en hoge zout diëten, respectievelijk. * - P <0,05 versus SD-ratten. Het cijfer is aangepast van referentie 12 met toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
/files/ftp_upload/53059/53059fig12.jpg "/>
Figuur 12. In vivo analyse van H 2 O 2. Voorbeeld van de in vivo evaluatie van interstitiële H 2 O 2 concentratie in de medulla van een SS rat gevoed met een zoutarm dieet (zie figuur 10B). De interstitiële toepassing van catalase via een geïmplanteerde catheter voor 5 min interval produceerde een volledige blokkade van de H 2 O 2 signaal in de renale medulla. Vermindering van katalase, van uitspoeling door renale bloedstroom, resulteerde in een gedeeltelijk herstel van het signaal, die weer werd geblokkeerd door een extra catalase applicatie (10 min). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De huidige protocollen werden ontwikkeld om verbeterde temporele en ruimtelijke resolutie van ATP te bieden en H 2 O 2 signalering voor ex vivo geïsoleerde, geperfuseerd en in vivo bloed geperfundeerde nieren. De verschillen tussen de protocollen en de hier gebruikte sensoren zorgen voor een optimale data-acquisitie voor zowel farmacologische middelen of fysiologische studies. De protocollen bestaan uit 1) sensorkalibratie, 2) chirurgische ingreep, 3) data-acquisitie setup, en 4) data-analyse. Zij kan de real-time metingen van analyten voor tal van experimentele omstandigheden. Dit zal leiden tot meer inzicht in nierziekten en de ontwikkeling van efficiëntere farmacologische behandelingen. Hier gebruikten we de sensoren ATP en H 2 O 2 te analyseren. Echter, sensoren voor andere stoffen zijn ook beschikbaar en kunnen worden gebruikt. De hier beschreven protocollen werden op ATP en H 2 O 2 bestuderen rattennieren, maar dezelfde method kan gemakkelijk worden aangepast voor toepassing bij muizen. Zo, deze aanpak heeft een groot potentieel gezien de overvloed aan genetische diermodellen.
Het basisontwerp van enzymatische micro-electrode biosensoren ontwikkeld in 1960 door Clark en Lyon 2. Na de initiële ontwikkeling van biosensoren, hebben vooruitgang geboekt in zowel het ontwerp 17-19 en toepassingen 20. Llaudet et al. 21,22 ontwikkeld principeontwerp van de ATP sensors gebruikt in de onderhavige protocollen tijdens het gebruik van werkwijzen van Cosneir et al. 23 voor het enzym coating. Deze sensoren hebben ATP signalering gedetecteerd in een aantal fysiologische processen met inbegrip van ATP vrijkomt uit hersenastrocyten 8, regulering van ademhaling 4,24 en skeletspier arteriole regulering 25. Onlangs is gebruikt de ex vivo protocol ATP signalering in nieren 12 meten. Het doel van dit manuscript is effectieve richtingen en inzichten voor de detectie van endogene stoffen zoals ATP in nieren verschaffen.
Enzymatische micro-elektrode biosensoren hebben vele voordelen boven bestaande middelen voor het meten van analyten in vivo. Echter, moeten speciale voorzorgsmaatregelen worden gebruikt voor deze aanpak als voor alle andere nieuwe methode. Validatie met een gevestigde aanpak geeft vertrouwen in de verkregen gegevens. Zo werden microdialyse metingen uitgevoerd zoals eerder beschreven 26,27. Geen significant verschil werd waargenomen tussen de piekconcentraties bepaald door de sensors en die verkregen uit de monsters 12 dialyse. De beperking van microdialyse is dat het meet alleen steady-state niveaus van analyt. Als zodanig kan de beoordeling van de dynamische veranderingen in cell signaling alleen mogelijk door het gebruik van de micro-elektrode enzymatische biosensoren. De fabriek specificaties van de sensor responstijden verschillen tussen sensortypes. Ex vivo sensoren een reactietijd van 5-10 sec en in vivo sensoren 30-35 seconden voor het signaal van 10 naar 90%. De kalibratie sporen (figuren 6 en 7) tonen de tijdsresolutie van analyt toevoegen / verwijderen. Voor beide benaderingen sensor microdialyse, is het gebruik van specifieke enzymen om het signaal dat door analyten blok moeten specificiteit te garanderen.
De beschreven protocollen hebben verschillende uitdagingen. Zoals bij elke sensor inbrengen in weefsel gaat weefselbeschadiging optreedt. Dit kan signaleringsroutes die de meting kunnen beïnvloeden 28 geactiveerd. Om de cel schade te minimaliseren, zou dunner sensoren nodig zijn. Het is echter moeilijk de nier capsule dringen de sensoren zo naalden worden gebruikt om een kleine ingang gat. Dunne sensoren hebben meer kans om te buigen en verstoren hun coating op inbrengen. Grotere sensoren diameter resistenter buigen en resultant schade aan hun coating. Figuur 3 toont een dunne en dikke sensor. Naast weerstand van de dikke sensor te buigen, zij een dikkere laag coating, een betere bescherming voor de enzymatische laag. De zorg van weefselschade veroorzaakt door het gebruik dikke sensoren aanzienlijk minder nieren dan in hersenweefsel zijn. De insteekdiepte wordt benaderd en de definitieve plaatsing moet worden gecontroleerd nadat metingen aan de nieren zijn voltooid. Schatting tussen de schors en merg lagen met behulp van de sensor tip lengte als een insertie gids en is het voldoende als de sensor tip is 0,5 mm en de nier cortex is 2-3 mm dik. Vervuiling van de sensor komt ook met een grotere snelheid in het bloed, waardoor beperking van het gebruik sensor lange in vivo protocollen bij één experiment. Opnametijden 1 tot 1 ½ uur resulteerde in slechts een kleine sensor drift. De belangrijkste criteria bij de beoordeling van de verminderde prestaties van de sensor is de lage gevoeligheidde analyt tijdens kalibratie. Verhoogde elektrische ruis en instabiliteit van de basislijn stroom kan ook aangeven dat de sensor tip beschadigd. Voor nauwkeurige metingen van ATP, moeten beide sensoren (ATP en Null) hebben soortgelijke ruis en stabiliteitseigenschappen verder aftrekken van het signaal. Anders is een sensor worden vervangen. Voor lage ruis en detectie van lage concentraties analyt, wordt het gebruik van nieuwe sensoren voor elk dier voorgesteld.
Verschillende stappen zijn cruciaal voor een succesvolle experimentele resultaten. De sensoren zijn erg kwetsbaar en moeten zorgvuldig worden behandeld om te voorkomen dat schade aan de sensor tip. Ook na rehydratatie, de sensoren niet bloot aan de lucht langer dan 20 sec. Lage geluidsniveau opnamen zijn vereist voor een succesvolle detectie van biologische signalen in weefsels. Voor dat doel is een high-performance lab lucht tafel en de juiste elektrische aarding nodig. De toevoeging van de exacte hoeveelheden analyt during de kalibratie stappen nodig voor een nauwkeurige concentratie bepaling in experimenten. Het bereiken van goede clearing van de nier in ex vivo nier operaties zal resulteren in een succesvolle opnames. Het gebruik van enzymen apyrase en catalase in kalibraties en experimenten maakt de beoordeling van de sensor-specifieke gevoeligheid en bevestigt de metingen.
Deze protocollen bieden sterk verbeterd detail van extracellulaire signalering in de nieren. De verbeterde gevoeligheid en temporele resolutie geboden door de sensoren kunnen we veranderingen in ATP signalering in ziektetoestanden en na farmacologische manipulatie die voorheen niet detecteerbaar waren opgelost. De in vivo protocol is geschikt voor complexe fysiologische studies terwijl ex vivo optimaal is voor de studie van farmacologische toepassingen op nieren. Het ontwerp van de in vivo sensor hier gebruikt maakt ongekende weerstand tegen inmenging in blood-doorbloed weefsel. Samen vormen deze sensoren bieden een groot aantal toepassingen die eerder mogelijk bestaande protocollen en technieken waren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sensoren voor de video-opname van dit manuscript werden door Sarissa Biomedical Limited (Coventry, Verenigd Koninkrijk).
Acknowledgments
Wij waarderen Sarissa Biomedical voor hun werk in de ontwikkeling van de bij de huidige manuscript sensoren. Dit onderzoek werd gesteund door de National Heart, Lung, and Blood Institute verleent HL108880 (A. Staruschenko), HL 116.264 (A. Cowley) en HL 122.662 (A. Staruschenko en A. Cowley), een project gefinancierd door de Medical College of Commissie Wisconsin Onderzoeks zaken # 9306830 (O. Palygin) en Het bevorderen van een gezondere Wisconsin Research and Education Program # 9.520.217, en de Young Investigator Grant van de National Kidney Foundation (O. Palygin).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sensor Kit | Sarissa Biomedical | SBK-ATP-05-125 | The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes. Also included with the kit is the user's choice of sensors. |
| Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-ATP-05-125 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissagold ATP Biosensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-ATP-10-50 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissaprobe null sensor 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-NUL-20-125 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissagold null sensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-NUL-10-50 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissaprobe ATP Manual | Sarissa Biomedical | http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf | |
| Faraday cage | TMC | ||
| Dual channel potentiostat | Digi-Ivy | DY2021 | Type II Faraday cage |
| Data acquisition program | Digi-Ivy | DY2000 | |
| Perfusion pump | Razel Scientific Instruments | Model R99E | |
| Fiber optic illuminator | Schott | ACE 1 | |
| micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| micromanipulator magnetic stand | Narishige | GJ-8 | |
| air table | TMC | 63-500 | |
| isoflurane ventilator | LEI Medical | M2000 | |
| 3 ml petri dish | Fisher Scientific | S3358OA | |
| needle | Santa Cruz | 26-30 G | |
| pins | Standard dissection pins | ||
| catheter | Polyethylene tubing (PE50) | ||
| catheter tissue glue | Vetbond | 1469SB | |
| suture | Look | SP117 | |
| rubber bands | any 2-4 mm wide rubber bands | ||
| silicone | Momentive | RTV-615 Clear 1# | |
| clamp | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| standard dissection kit | Kit should include scalpel and dissection sissors | ||
| Kidney Cup | Of own design | ||
| standard chemicals | Sigma-Aldrich | ||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | 100 mM ATP solution |
| hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A7646 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| isoflurane | Clipper | 10250 | |
| inactin | Sigma-Aldrich | T133 | |
| ketamine | Clipper | 2010012 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 |
References
- Palygin, O., Staruschenko, A. Detection of endogenous substances with enzymatic microelectrode biosensors in the kidney. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 305, 89-91 (2013).
- Clark, L. C., Lyons, C. Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery. Ann N Y Acad Sci. 102, 29-45 (1962).
- Haruyama, T. Micro- and nanobiotechnology for biosensing cellular responses. Adv Drug Deliv Rev. 55, 393-401 (2003).
- Huckstepp, R. T., et al. Connexin hemichannel-mediated CO2-dependent release of ATP in the medulla oblongata contributes to central respiratory chemosensitivity. J Physiol. 588, 3901-3920 (2010).
- Lopatar, J., Dale, N., Frenguelli, B. G. Minor contribution of ATP P2 receptors to electrically-evoked electrographic seizure activity in hippocampal slices: Evidence from purine biosensors and P2 receptor agonists and antagonists. Neuropharmacology. 61, 25-34 (2011).
- Avshalumov, M. V., Chen, B. T., Marshall, S. P., Pena, D. M., Rice, M. E. Glutamate-dependent inhibition of dopamine release in striatum is mediated by a new diffusible messenger, H2O2. J Neurosci. 23, 2744-2750 (2003).
- Frenguelli, B. G., Wigmore, G., Llaudet, E., Dale, N. Temporal and mechanistic dissociation of ATP and adenosine release during ischaemia in the mammalian hippocampus. J. Neurochem. 101, 1400-1413 (2007).
- Lalo, U., et al. Exocytosis of ATP from astrocytes modulates phasic and tonic inhibition in the neocortex. PLoS Biol. 12, e1001747 (2014).
- Heinrich, A., Ando, R. D., Turi, G., Rozsa, B., Sperlagh, B. K+ depolarization evokes ATP, adenosine and glutamate release from glia in rat hippocampus: a microelectrode biosensor study. Br.J Pharmacol. 167, 1003-1020 (2012).
- Dale, N. Purinergic signaling in hypothalamic tanycytes: potential roles in chemosensing. Semin Cell Dev Biol. 22, 237-244 (2011).
- Gourine, A. V., Llaudet, E., Dale, N., Spyer, K. M. Release of ATP in the ventral medulla during hypoxia in rats: role in hypoxic ventilatory response. J Neurosci. 25, 1211-1218 (2005).
- Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H2O2 release in freshly isolated kidneys. Am J Physiol Renal Physiol. , (2013).
- Thome-Duret, V., Gangnerau, M. N., Zhang, Y., Wilson, G. S., Reach, G. Modification of the sensitivity of glucose sensor implanted into subcutaneous tissue. Diabetes Metab. 22, 174-178 (1996).
- Wilson, G. S., Gifford, R. Biosensors for real-time in vivo measurements. Biosens. Bioelectron. 20, 2388-2403 (2005).
- Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-Channel Analysis of TRPC Channels in the Podocytes of Freshly Isolated Glomeruli. Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).
- Stockand, J. D., Vallon, V., Ortiz, P. In vivo and ex vivo analysis of tubule function. Compr Physiol. 2, 2495-2525 (2012).
- Turner, A. P. Biosensors: Fundamentals and applications - Historic book now open access. Biosens. Bioelectron. 65C, A1 (2014).
- Kauffmann, J. M., Guilbault, G. G. Enzyme electrode biosensors: theory and applications. Methods Biochem Anal. 36, 63-113 (1992).
- Barlett, P. N., Cooper, J. M. A review of the immobilization of enzymes in electropolymerized films. J Electroanal Chem. 362, 1-12 (1993).
- Kano, K., Morikage, K., Uno, B., Esaka, Y., Goto, M. Enzyme microelectrodes for choline and acetylcholine and their applications. Anal Chim Acta. 299, 69-74 (1994).
- Llaudet, E., Hatz, S., Droniou, M., Dale, N. Microelectrode biosensor for real-time measurement of ATP in biological tissue. Anal Chem. 77, 3267-3273 (2005).
- Llaudet, E., Botting, N. P., Crayston, J. A., Dale, N. A three-enzyme microelectrode sensor for detecting purine release from central nervous system. Biosens Bioelectron. 18, 43-52 (2003).
- Cosnier, S., Lepellec, A., Guidetti, B., Isabelle, R. -L. Enhancement of biosensor sensitivity in aqueous and organic solvents using a combination of poly(pyrrole-ammonium) and poly(pyrrole-lactobionamide) films as host matrices. J Electroanal Chem. 449, 165-171 (1998).
- Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329, 571-575 (2010).
- Kluess, H. A., Stone, A. J., Evanson, K. W. ATP overflow in skeletal muscle 1A arterioles. J. Physiol. 588, 3089-3100 (2010).
- Nishiyama, A., Jackson, K. E., Majid, D. S., Rahman, M., Navar, L. G. Renal interstitial fluid ATP responses to arterial pressure and tubuloglomerular feedback activation during calcium channel blockade. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290, H772-H777 (2006).
- Jin, C., et al. Effects of renal perfusion pressure on renal medullary hydrogen peroxide and nitric oxide production. Hypertension. 53, 1048-1053 (2009).
- Khan, A. S., Michael, A. C. Invasive consequences of using micro-electrodes and microdialysis probes in the brain. Trends Anal. Chem. 22, 503-508 (2003).
