Abstract
وقد استخدمت على نطاق واسع أجهزة الاستشعار مسرى مكروي الأنزيمية لقياس إشارات الخلية في الوقت الحقيقي. أكثر من استخدامها قد اقتصر على شرائح الدماغ والخلايا العصبية الثقافات. في الآونة الأخيرة، وقد تم تطبيق هذه التكنولوجيا إلى الأجهزة كلها. وقد أحرز تقدم في تصميم أجهزة الاستشعار ممكن قياس الإشارات الخلوية في الكلى في الجسم الحي perfused الدم. تسرد البروتوكولات الحالية الخطوات اللازمة لقياس ATP وH 2 O 2 الإشارات في الخلالي الكلى الفئران. وتستخدم تصميمين استشعار منفصلة للخارج الحي والبروتوكولات الجسم الحي. والمغلفة كلا النوعين من أجهزة الاستشعار مع biolayer الأنزيمية رقيقة فوق طبقة permselectivity لإعطاء الاستجابة بسرعة، أجهزة الاستشعار الحساسة وانتقائية. طبقة permselectivity يحمي إشارة من interferents في الأنسجة البيولوجية، وطبقة الأنزيمية تستخدم للتفاعل محفز متتابعة من كيناز الجلسرين والجلسرين-3-فوسأوكسيديز الفوسفات في وجود ATP لإنتاج H 2 O 2. مجموعة من أجهزة الاستشعار المستخدمة في السابق الدراسات المجراة الكشف عن مزيد من تحليلها عن طريق أكسدة H 2 O 2 على البلاتين / الايريديوم (PT-IR) سلك كهربائي. أجهزة الاستشعار للدراسات في الجسم الحي وتقوم بدلا من ذلك على الحد من H 2 O 2 على الوسيط الذهب المطلي القطب مصممة للالأنسجة perfused الدم. تم الكشف عن التغييرات تركيز النهائية amperometry الوقت الحقيقي تليها معايرة لتركيزات معروفة من تحليلها. بالإضافة إلى ذلك، خصوصية إشارة amperometric يمكن التأكد من خلال إضافة الانزيمات مثل الكاتلاز وآبيراز التي كسر H 2 O 2 و ATP تبعا لذلك. هذه المجسات أيضا تعتمد بشكل كبير على المعايرة دقيقة قبل وبعد كل تجربة. البروتوكولات التاليين تضع دراسة كشف في الوقت الحقيقي من ATP وH 2O 2 في أنسجة الكلى، ويمكن تعديل أيضا على تمديد الطريقة الموصوفة لاستخدامها في المستحضرات البيولوجية الأخرى أو الهيئات كلها.
Introduction
وكانت أجهزة الاستشعار مسرى مكروي الأنزيمي (المشار إليها أيضا باسم أجهزة الاستشعار في هذا المخطوط) أداة قيمة لدراسة العمليات الإشارات الحيوية في الخلايا والأنسجة الحية. أجهزة الاستشعار بتوفير المزيد من قرار الزمني والمكاني من الخلايا الجزيئات يشير في تركيزات ذات الصلة من الناحية البيولوجية. بدلا من أخذ العينات وتحليل سوائل خارج الخلية التي اتخذت في فترات على مدى فترات طويلة من الزمن، هذه المجسات تستجيب بالسرعة تتفاعل الانزيمات لتحليلها، وبالتالي إنتاج قياسات الوقت الحقيقي 1،2. كشف سريع من تركيزات فراغي من العوامل autocrine ونظير الصماوي، مثل البيورينات أو بيروكسيد الهيدروجين، وديناميات الإفراج عنهم يمكن استخدامها لإنشاء لمحة عن آثار المخدرات في الظروف العادية والمرضية 3. حاليا، كانت الغالبية العظمى من التطبيقات التي تستخدم أجهزة الاستشعار في الدماغ شرائح الأنسجة والثقافات خلية 4-10. البروتوكولات بالتفصيل في هذا الهدف مخطوطة لوضع الوسائل لقياس تركيزات بدقة في الوقت الحقيقي من التحاليل في الكلى كلها.
وقد وضعت البروتوكولات التالية لدراسة ATP الخلالي وH 2 O 2 الإشارات في الكلى. في البيئة المحلية في الكلى، وcatabolized خارج الخلية ATP بسرعة عن طريق ectonucleotidases الذاتية إلى مشتقاته (ADP، AMP والأدينوزين). أجهزة الاستشعار المستخدمة هنا هي انتقائية للغاية إلى ATP على البيورينات أخرى أو ATP منتجات التحلل 11. وهذا يوفر ميزة كبيرة لأنها تتيح رصد دقيق لتركيزات ثابتة وديناميكية الإفراج ATP وظيفة إشارات لها. يتم قياس تركيز ATP الخلالي باستخدام مزيج من اثنين من الميكروية، جهاز استشعار ATP وجهاز استشعار لاغية. جهاز استشعار لاغية في تركيبة مع تطبيقات الكاتالاز قادر على كشف الخلالي H 2 O 2 تركيزات 12. البروتوكولات التالية تستخدم اثنين من تصاميم مختلفة من الحرفيRS التي لها خصائص الأمثل إما خارج الجسم الحي أو في التطبيقات الجسم الحي.
وتقوم كل من التصاميم على تفاعل محفز متتابعة من كيناز الجلسرين والجلسرين أوكسيديز-3-فوسفات الواردة في طبقة استشعار الأنزيمية وتحركها من وجود ATP. في مجموعة من أجهزة الاستشعار المستخدمة في السابق الدراسات المجراة، H 2 O 2، وناتج التفاعل الأنزيمي النهائي، تم الكشف عنها بواسطة الأكسدة على البلاتين / الايريديوم (PT-IR) سلك كهربائي. أجهزة استشعار للدراسات في الجسم الحي وتقوم بدلا من ذلك على H 2 O 2 تخفيض على الوسيط الذهب المطلي القطب مصممة للالأنسجة perfused الدم. هو مبين في الشكل رقم 1 هو مخطط كل من البروتوكولات المذكورة في هذه المخطوطة. جهاز استشعار لاغية مطابق لالمقابل استشعار ATP لها إلا أنها تفتقر إلى الانزيمات ملزمة. لذلك، بالإضافة إلى الكشف عن H 2 O 2 مع إنزيم الكاتلاز، والشرق الأوسط وأفريقيا استشعار لاغيةسورس التدخلات غير محددة. يتم حساب تركيزات ATP عن طريق طرح الكشف عن اغية التدخلات غير محددة وخلفية H 2 O 2 من إشارة استشعار ATP. العديد من أجهزة الاستشعار وتتوفر أيضا تجاريا للكشف عن التحاليل الأخرى بما في ذلك الأدينوزين، ionosine، هيبوزانتين، أستيل كولين، الكولين، الصوديوم، الجلوكوز، اللاكتات، د-سيرين للخارج الحي التطبيقات أو الأدينوزين، ionosine، وهيبوزانتين في الجسم الحي عندما يقترن اغية المقابلة أجهزة الاستشعار.
قدرة جهاز استشعار للكشف عن أدق التحاليل تتوقف على ما قبل السليم والمعايرة ما بعد 13. وهذا يضمن أن التحليل يمثل الانجراف في حساسية الاستشعار التي تحدث أثناء الاستخدام في الأنسجة البيولوجية. أجهزة الاستشعار يحمل مستودع من الجلسرين الذي يتم استخدام كاشف في التفاعلات الأنزيمية الاستشعار. إذا لم يتم استخدام أجهزة الاستشعار في حلول حمام تحتوي على الجلسرين، وسوف تزول مع الزمن. أقصر صمرات تسجيل مفيدة ضرورية للحد من انجراف استشعار ذلك الحين. استشعار بالإضافة إلى ذلك قاذورات التي كتبها البروتياز الذاتية وشظايا البروتين يمكن أن يقلل كثيرا من حساسية من أجهزة الاستشعار 14.
المخطوطة الحالية تنص على استخدام أجهزة الاستشعار مسرى مكروي الأنزيمية للخارج الحي والاستعدادات الكلى الجسم الحي. يوفر في الوقت الحقيقي تحليلها الكمي بتفاصيل غير مسبوقة من الإشارات الخلوية التي قد تكشف عن رؤى جديدة في آليات أمراض الكلى وكلاء الدوائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
إجراءات الحيوانات التالية انضمت إلى دليل المعاهد الوطنية للصحة للرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. تم الحصول على موافقة مسبقة من اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC).
وينبغي أن يتم استعراض تعليمات الشركة الاستشعار خلال تصميم التجربة وقبل استخدامها: ملاحظة. وباتباع هذه التعليمات تنتج أفضل النتائج عند استخدام أجهزة الاستشعار.
1. الاستشعار المعايرة
- إعداد الحلول الأسهم الجديدة قبل بدء التجربة.
- إنشاء مخزن وتحتوي على 10 ملي NaPi العازلة، 100 ملي كلوريد الصوديوم، 1 ملم MgCl 2، و 2 ملي الجلسرين. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم. تخزين في 2-8 ° C.
- باستخدام تركيز الأسهم ATP (100 ملم) المخزنة في -20 ° C، إنشاء الطازجة 10 ملي ATP حل المعايرة عن طريق إضافة الأوراق المالية 10 ميكرولتر إلى 90 ميكرولتر من العازلة A.
- ترطيب استشعار ATP عن طريق وضع طرفها (الشكل 2) في رانه الإماهة غرفة تحتوي على مخزن A لمدة 10 دقيقة على الأقل في 2-8 ° C.
ملاحظة: بعد الإماهة، لا ينبغي أن يتعرض أجهزة الاستشعار في الهواء لأكثر من 20 ثانية أو ربما يتم تخفيض حساسية الاستشعار. إذا كان متوقعا التعرض الطويل للهواء، وتراجع استشعار لفترة وجيزة في حل من الجلسرين. ويمكن استخدام أجهزة الاستشعار لتجارب متعددة ولكن هذه يجب أن تحدث في نفس اليوم الذي استشعار الإماهة. يمكن تخزين أجهزة الاستشعار في غرفة الإماهة مع العازلة A لمدة تصل إلى 24 ساعة. - بدوره على قناة potentiostat المزدوج (الشكل 3) وبدء برنامج نظام التسجيل.
- إعداد غرفة المعايرة مع 3 مل من العازلة A. مكان القطب المرجعية في غرفة المعايرة. اتخاذ كل أجهزة الاستشعار من غرفة الإماهة، ثم إرفاقه مناور وأدخله في حل غرفة المعايرة.
ملاحظة: استخدام سيليكون المغلفة طبق بتري القياسية باعتباره غرفة المعايرة. تنفيذ جميع المعايرة والحادي والعشرينudies في قفص فاراداي على طاولة الهواء المختبر عالية الأداء للحد من الضوضاء إشارة خلال التسجيلات amperometry (الشكل 4). المعايرة تتم الأفضل أقرب إلى بدء جمع البيانات ممكن. لتقديم الطلبات في الجسم الحي الوقت الأمثل للمعايرة وخلال فترة النقاهة بعد جراحة الحيوان. - فيفو السابقين المعايرة
- أداء voltammetry دوري في غرفة المعايرة من قبل ركوب الدراجات أجهزة الاستشعار من -500 إلى +500 بالسيارات بالسيارات بمعدل 100 فولت / ثانية لمدة 10 دورات. هذا يحسن كثيرا من حساسية من أجهزة الاستشعار. انظر الشكل 5 للآثار لوحظ من 10 دورات.
- استقطاب أجهزة الاستشعار ل+600 بالسيارات بعد الدورة الأخيرة. وأجهزة الاستشعار الحالية الاضمحلال إلى الخط المقارب. ويتحقق القراءة ثابتة بعد مدة لا تقل عن 5 دقائق. تسجيل القراءة الصفر.
- في الجسم الحي معايرة أجهزة الاستشعار
- عدم تنفيذ voltammetry دوري على المجراة الحرفيروبية. بدلا من ذلك، استقطاب أجهزة الاستشعار في غرفة المعايرة لمدة 30 ثانية إلى +500 بالسيارات. ثم تعيين potentiostat إلى 0 بالسيارات والسماح للاستشعار الحالي ليرتفع إلى الخط المقارب. وأجهزة الاستشعار الحالية تأخذ 2 دقيقة على الأقل إلى الخط المقارب. تسجيل القراءة الصفر.
- على التوالي إضافة كميات محددة من حل ATP الى غرفة لإنتاج خط معايرة تضم مجموعة الكشف المطلوب. الحل ATP تنتج ذروة حادة في إشارة الاستشعار في البداية، تليها تسوس كما ينشر على ATP بالتساوي في جميع أنحاء الغرفة. قيم الإشارات سجل مرة واحدة على مستوى إشارة قد استقرت بعد كل إضافة للاعبي التنس المحترفين. أرقام 6A و 7 تظهر آثار واقترح تركيزات ATP لكل من خارج الجسم الحي والدراسات المجراة على التوالي.
ملاحظة: من المهم للتأكد من الانتقائية من الأقطاب الكهربائية باستخدام الزبالين من التحاليل. هذا البروتوكول يستخدم آبيراز لاختبار خصوصية استشعار ATP والكاتالاز لH <دون> 2 O 2 إشارة (أرقام 6B). إذا الأدوية على أن تدار، ينبغي تحديد قياسات للتفاعل مع أجهزة الاستشعار قبل الدراسة. - إضافة 3 ميكرولتر من آبيراز من مخزون من 2 ملغ / مل (89 UN / ملغ) لاختبار خصوصية استشعار ATP (التيار تنتجها تطبيق ATP أن تخفض إلى مستوى الصفر (الشكل 7).
- إضافة 3 ميكرولتر من الكاتلاز من مخزون من 2mg / مل (100 UN / ملغ) لاختبار خصوصية من أجهزة الاستشعار لاغية (التيار التي تنتجها H 2 O 2 التطبيق يجب أن تخفض إلى القراءة صفر).
2. جراحة الحيوان للدراسات الاستشعار
- عملية جراحية لخارج الجسم الحي
- تخدير الحيوان التجريبي مع isoflurane (5٪ تحريض، 1،5-2،5٪ الصيانة) / الصف O الطبية 2 أو طريقة أخرى وافق 15 'يجب أن تراقب 12 الحيوانات بشكل مستمر لضمان مستوى مناسب من التخدير. سانتتستخدم قادرة التنفسي رد الفعل معدل وقرصة أخمص قدميه لتأكيد التخدير المناسب.
ملاحظة: الموت ببطء الحيوان وفقا لبروتوكولات IACUC المعتمدة. عند الانتهاء من جميع إجراءات عدم البقاء على قيد الحياة والموت ببطء الحيوانات الخدر بعمق بضع الصدر حمل استرواح الصدر للتأكد من زوال إنسانية لهذا الحيوان 12. - وضع الفئران على طاولة العمليات الجراحية التي تسيطر عليها درجة الحرارة في موقف ضعيف. مع الحفاظ على عمق التخدير المناسبة، وجعل شق خط الوسط من حوالي 5 سم وذلك تمشيا مع الكلية اليسرى وفضح الشريان الأورطي البطني البعيدة.
- لف رباط حول الاضطرابات الهضمية والشرايين المساريقي العلوي، والشريان الأورطي البطني فوق هذه الشرايين ولكن لا ligate. التفاف اثنين من الأربطة حول الشريان الأورطي البطني تحت الشرايين الكلوية.
- المشبك الشريان الأورطي البطني فوق الحروف المركبة. ربط انخفاض رباط. يقثطر الشريان الأورطي البطني مع أنابيب البولي ايثيلين (PE50). تأمين القسطرة مع ربطة الشريان الأورطي الثاني.
- إزالة المشبك وligate المساريقي والاضطرابات الهضمية الشرايين. يروي الكلى في 6 مل / دقيقة مع هانكس محلول الملح المتوازن في RT لمدة 2-3 دقيقة حتى يتم المقشر الكلى تماما.
- استئصال الكلى والقسطرة، متصلة جزء من الشريان الأورطي. وضع الكلى إلى 3 مل طبق بتري مملوءة بمحلول حمام.
ملاحظة: لا يمكن أن يؤديها بروتوكول التجربة في RT. يحتوي الحل حمام في ملي: 145 كلوريد الصوديوم، 4.5 بوكل، 2 MgCl 2، 1 CaCl 2، 10 HEPES، ودرجة الحموضة 7.35 تعديلها مع هيدروكسيد الصوديوم.
- تخدير الحيوان التجريبي مع isoflurane (5٪ تحريض، 1،5-2،5٪ الصيانة) / الصف O الطبية 2 أو طريقة أخرى وافق 15 'يجب أن تراقب 12 الحيوانات بشكل مستمر لضمان مستوى مناسب من التخدير. سانتتستخدم قادرة التنفسي رد الفعل معدل وقرصة أخمص قدميه لتأكيد التخدير المناسب.
- عملية جراحية لفي الجسم الحي
- تخدير الفئران باستخدام بروتوكولات IACUC المعتمدة. لفي الجسم الحي تحليل تخدير الفئران مع الكيتامين (20 ملغ / كغ IM) وinactin (50 ملغ / كغ الملكية الفكرية). يجب مراقبة الحيوانات باستمرار لضمان مستوى مناسب من التخدير. وتستخدم مجموعة مستقرة التنفسي رد الفعل معدل وقرصة أخمص قدميه لتأكيد التخدير المناسب.
- بعد عمق التخدير الصحيح هو الحصول علىالطبعه، وضع الفئران في موقف ضعيف على سطح الارض يمكن التحكم بدرجة حرارته تقع على الطاولة الهواء. وينبغي مسخن المياه السطحية والحفاظ على 36 ° C.
- مع الحفاظ على عمق التخدير المناسبة، وجعل شق خط الوسط حوالي 5 سم وذلك تمشيا مع الكلى.
- استخدام الخيط قدرة على الصمود وترسيخ الأنسجة الجلدية وتحت الجلد بحيث الكلى بالكامل مرئيا. وضع الكلى في كوب الكلى للحد من أي حركة القطع الأثرية.
- استخدام ضخ الرابع من 2٪ BSA: 0.9٪ كلوريد الصوديوم في 1 مل / 100 ز / ساعة عبر الوريد الوداجي للحفاظ على حجم الدم. يقني؛ يدخل القنية كل من الحالب لجمع البول. العلاقات مكان حول المساريقي والاضطرابات الهضمية الشرايين متفوقة وأبهري البعيدة للتلاعب ضغط التروية الكلوي (أرقام 10A).
- إذا كان مطلوبا تطبيق كلاء الدوائية خلال التجارب المجراة، يوصى بإدخال قسطرة الخلالي (أرقام 10B
الإعداد 3. الحصول على البيانات
- فتح البرنامج الحصول على البيانات وتحديد قطبية لها على حد سواء خارج الجسم الحي وفي التجارب المجراة على بأكسيد الألومنيوم إيجابي. وضع برنامج لحفظ البيانات كرمز ASCII.
- ضع micromanipulators لالإدراج السريع للأجهزة الاستشعار في الكلى.
ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم التحقيق وهمية تعلق على micromanipulator للمساعدة في تحقيق موضع المطلوب من أجهزة الاستشعار. - فيفو السابقين الحصول على البيانات
- يروي الكلى مع الحل حمام (من 2.1.6) عن طريق الشريان الأورطي مقنى بمعدل ثابت من 650 ميكرولتر / دقيقة. باستخدام مقص جراحي، وإزالة بعناية الكبسولة الكلى، وهو أمر ضروري لإدخال جهاز الاستشعار.
- تأمين الكلى مع الأربطة المطاطية مربوطة على الكلى وتعلق على طبق المغلفة سيليكون مع دبابيس.
- وضع القطب إشارة على مقربة من الكلى في طبق بتري مع طرفها المغمورة فيحل العازلة.
- في الحصول على البيانات الجسم الحي
- وضع الكلى في كوب الكلى. اعتمادا على سلالة وعمر الحيوان استخدام حجم الكأس التي يحمل الكلى فضفاضة الشكل 8 عروض بمرتين من الكؤوس الكلى. تستخدم أكواب مماثلة للنهج الفسيولوجية المختلفة التي تركز على تحليل وظائف الكلى مثل بزل مجهري الخ 16.
ملاحظة: إن موقف كوب الكلى أمر بالغ الأهمية لإزالة الضوضاء الميكانيكية التي تنتجها التنفس الحيوان، ولكن لا ينبغي أن تتداخل مع أو منع نضح الكلى أو تدفق البول. - سماح 45 دقيقة من وقت الانتعاش قبل تنفيذ جمع البيانات.
- باستخدام إبرة 26-30G، وجعل ثقب ثقب في الموقع المطلوب وعمق من أجهزة الاستشعار في الكلى. وصمة عار ثقب السطح لإزالة الدم ناضح. إضافة حل الجلسرين على سطح الكلى. وهذا يمنع السطح الكلى من الجفاف أثناء التجربة. إزالة أول مستشعر من غرفة الإماهة وإرفاقه micromanipulator. بسرعة، في غضون 20 ثانية، وإدراج القطب في الحفرة التي تم إنشاؤها حديثا في الكلى. كرر الخطوات من 3،5-3،9 لاستشعار فارغة.
- إدراج القطب المرجعية في الكلى، ما يقرب من 1 سم من من أجهزة الاستشعار.
- وضع الكلى في كوب الكلى. اعتمادا على سلالة وعمر الحيوان استخدام حجم الكأس التي يحمل الكلى فضفاضة الشكل 8 عروض بمرتين من الكؤوس الكلى. تستخدم أكواب مماثلة للنهج الفسيولوجية المختلفة التي تركز على تحليل وظائف الكلى مثل بزل مجهري الخ 16.
- بدوره على potentiostat وتفعيل برنامج تسجيل على الكمبيوتر. الشكل 9 يظهر الإعداد النهائي للخارج الحي الحصول على البيانات الكلى. يوضح الشكل 10 الإعداد النهائي للحصول على البيانات الكلى في الجسم الحي مع القسطرة المدرجة.
تحليل 4. البيانات
- استيراد ملف بيانات ASCII إلى المنشأ أو أي برامج أخرى مماثلة.
- تركيز العلاقة الحالية
- استخدام الخطية وظيفة تناسب / استقراء لبناء تركيز الخطي (محور السينية) للتيار (ص -axis) علاقة للATP أو H 2 O 2 المعايرة (أرقام 6 و 7).
خطي خط مناسبا: ص = MX + ب
- استخدام الخطية وظيفة تناسب / استقراء لبناء تركيز الخطي (محور السينية) للتيار (ص -axis) علاقة للATP أو H 2 O 2 المعايرة (أرقام 6 و 7).
- مساواة التيار الى تركيز
- طرح آثار يقاس من أجهزة الاستشعار لاغية من تلك من أجهزة الاستشعار ATP للحصول على التيار الفعلي التي تنتجها ATP داخل الخلايا.
- تحويل القيم ATP في السلطة الفلسطينية التي حصلت عليها amperometry إلى نانومتر باستخدام معادلة المعايرة بالتفصيل في 4.2.1. تحديد تركيز التتبع البيانات تطرح من أجهزة الاستشعار ATP عن طريق استيراد كل تيار المعدل في "س" قيمة وحل لص (تركيز الحليلة).
- وبالمثل، حساب H 2 O 2 تركيز من معادلة المعايرة لها إذا لزم الأمر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تصميم مسرى مكروي جهاز الاستشعار البيولوجي الأنزيمية يسمح للكشف في الوقت الحقيقي من التحاليل في الكلى كلها. ويتضح تصميم تجربة العام إما خارج الجسم الحي أو الدراسات المجراة في الشكل 1. وأجهزة الاستشعار المستخدمة وتختلف الإجراءات الجراحية اعتمادا على ما إذا كانت الدراسة هو الجسم الحي السابقين أو في الجسم الحي.
للحصول على نتائج قابلة للتكرار، ما قبل دقيقة والمعايرة ما بعد حاسمة. ويبين الشكل 6A أثر التمثيل في إشارة يرى من خارج الحي استشعار ATP خلال المعايرة. لاحظ أن آبيراز بسرعة القضاء على إشارة ATP. كان الكاتالاز أي تأثير على إشارة ATP ويدل على خصوصيته إلى H 2 O 2 يخلق (الشكل 6B). تنتج إجراء المعايرة نوبة الخطي الذي يستخدم لحساب التغيرات الدينامية من ATP (6A الشكل، اللوحة اليمنى). وفي السادسفو معايرة أجهزة الاستشعار تنتج أي أثر مماثلة لتلك التي لاستشعار خارج الحي. ومع ذلك، فإن هذا الاستشعار بالكشف عن التخفيض بدلا من التيارات المؤكسدة وعلى هذا النحو التيار ينتج سالبة. معايرة هذه المجسات كما تنتج نوبة الخطي في مجموعة ،3-80 ميكرومتر (الشكل 7A اللوحة اليمنى). وأظهرت خصوصية في الجسم الحي استشعار لاعبي التنس المحترفين على المنتجات البيورين أخرى في الشكل 7B.
النهج وصفها هنا يسمح لنا بقياس المستويين القاعدية من المواد المحلية والتغيرات الحادة ردا على ضخ المخدرات 12. هو مبين في الشكل 11 لانج التغيرات في تركيز الذاتية الخلالي من H 2 O 2 في الفئران المقاومة للملح وحساسية للملح II التي يسببها. لهذه التجارب، تم perfused الكلى المعزولة حديثا من سبراج داولي (SD) أو دال (SS) الفئران حساسية للملح مع 1 ميكرومتر انج الثاني تحت تدفق الصفحي ثابت (650 ميكرولتر / دقيقة). كما SHOسفل في الشكل 11، آنغ II الحث على الافراج حاد في H 2 O 2 في الكلى من كلا SD والجرذان SS. ومع ذلك، فإن السعة القصوى لكل استجابة ومرتفعة بشكل ملحوظ في الفئران SS، وخصوصا عندما تم تغذية الحيوانات مع اتباع نظام غذائي الملح العالية 12. هو مبين في الشكل (12) هو تطبيق التمثيل في أجهزة الاستشعار في الجسم الحي. ضخ الكاتالاز (5 ميكروغرام / مل) تماما كتل H 2 O 2 إشارة الكشف عنها بواسطة جهاز الاستشعار البيولوجي. وتوضح هذه التجارب على استخدام أجهزة الاستشعار الأنزيمية محددة جنبا إلى جنب مع تقنية amperometric للكشف عن مستويات القاعدية من المواد المحلية والقياسات في الوقت الحقيقي من إطلاق سراحهم ردا على التدخل الدوائي. التطبيقات الأخرى لهذا النهج لدراسة دور الإشارات purinergic وبيروكسيد الهيدروجين وتحسين معرفتنا وفهمنا من أمراض الكلى مثل حساسية للملح وارتفاع ضغط الدم، ثور الكلويالإجهاد idative وأمراض الكلى المزمنة.
يتم الشكل 1. تخطيطي من البروتوكولات. معايرة مع تحليلها من الفائدة واختبار خصوصيته مباشرة قبل بدء التجارب. وينبغي أن يتبع البروتوكول في الجسم الحي للتجارب الفسيولوجية المعقدة والجسم الحي السابقين للتطبيقات الدوائية. وينبغي أن يتم معايرة آخر تجربة وأخذها بعين الاعتبار خلال تحليل البيانات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 2. الأنزيمية مسرى مكروي الاستشعار، واثنين وتظهر أحجام الاستشعار المستخدمة في تطبيقات خارج الحي، 50 ميكرون و 125 ميكرون الأقطار. كل سلك استشعار يمتد إلى أنبوب شعري للاتصال موصل نهاية الذهب (لا يظهر). يظهر أقحم تلميح استشعار المغلفة مع الانزيمات لكشف ATP. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. مزدوجة القناة Potentiostat. القنوات potentiostat المسمى CH1 CH2 و. 1) CH1 الاتصال استشعار ATP و 2) CH2 وخالية استشعار اتصال 3) الاتصالات التي تقترن كهربائيا إلى القطب المرجعية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الحمار = "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> 
الرقم 4. إعداد أجهزة الاستشعار. يتم تنفيذ الحصول على البيانات في قفص فاراداي للحد من الضوضاء الكهربائية وعلى طاولة المختبر عالية الأداء لسطح عمل خالية من الاهتزاز. 1) يستخدم جدول الجراحية التي تسيطر عليها درجة الحرارة إلى الحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان خلال التجارب الفسيولوجية 2) هي التي تعلق على micromanipulators لمحولات تصاعد المغناطيسي لتحديد المواقع مرونة من أجهزة الاستشعار خلال التجربة 3) وهناك حاجة إلى مصدر الضوء عن العمليات الجراحية وأجهزة الاستشعار الإدراج 4 ) قناة مزدوجة potentiostat 5) حامل لأجهزة الاستشعار. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
p_upload / 53059 / 53059fig5.jpg "/>
الرقم 5. voltammetry دوري للحصول على الدراسات المجراة سابقا، ويجري استشعار voltammetry دوري لمدة 10 دورات بين -0.5 و 0.5 V قبل بروتوكول المعايرة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 6. Amperometry معايرة للفيفو السابقين. (A) تستخدم المعايرة إضافة تركيزات ATP المعروفة في حل الحمام. المقابلة القيم amperometric المسجلة على مستوى الخط المقارب (تتبع الأسود). التيارات الحصول على خلق معادلة المعايرة. يظهر مثال على اللوحة اليمنى. تتبع الأحمر هو كوريهالإقليم الشمالي من أجهزة الاستشعار لاغية الذي يستجيب فقط إضافة H 2 O 2. يتم معايرة (B) مستشعر لاغية مع إضافة المعروف H 2 O 2 تركيزات (الأسهم الحمراء) إلى حل حمام والخطوط المقاربة تسجل القيم amperometric (الأسهم السوداء رقيقة). إضافة الكاتالاز إلى حل حمام (السهم الاسود الكثيف) النتائج في تسوس الحالي السريع. وتظهر اللوحة اليمنى خالية المعادلة معايرة أجهزة الاستشعار. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم، الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7. Amperometry معايرة ل؛ تتم في فيفو معايرة في الجسم الحي أقطاب بطريقة مماثلة لتلك التي تفصيلا في السابق الدراسات المجراة باستثناء ردود الفعل تخفيض تسبب عكس الحالي (القطبية). (A) إضافة تركيزات ATP المعروف تنتج تيار amperometric على استشعار ATP (تتبع الأسود) ولكن ليس له تأثير على استشعار لاغية (تتبع الأحمر). إضافة آبيراز يسقط التيار من أجهزة الاستشعار ATP. وأكد (B) خصوصية من أجهزة الاستشعار ATP من خلال إضافة 10 ميكرومتر وكلاء مختلفة purinergic (UTP، UDP والأدينوزين). مزيد من التطبيقات ATP توفر تيار amperometric اكتشاف مستقر. (C) صورة مجهرية من أجهزة الاستشعار في الجسم الحي على أساس الوسيط الذهب المطلي الكهربائي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا فيقوإعادة.
الرقم 8. الكؤوس الكلى. وفي دراسات في الجسم الحي، وتعقد الكلى لا تزال تستخدم المقاوم للصدأ أكواب الكلى الصلب هو مبين. تستخدم بمرتين من الكؤوس لاستيعاب الكلى الحجم. هذه الكؤوس تقلل من القطع الأثرية الحركة التي تم إنشاؤها بواسطة التنفس الحيوان. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 9. فيفو السابقين الكلى معزولة وPerfused. يتم وضع الكلى معزولة في طبق 1) بتري المغلفة مع سي سميكةأسفل licone لدبوس الإدراج 2) ومقنى الشريان الكلوي وتعلق على ضخ حقنة لنضح المستمر خلال التجربة 3) جهاز استشعار ATP، 4) وأجهزة الاستشعار لاغية تندس في الكلى 5) يوضع القطب المرجع بالقرب من الكلى المغمورة في حل حمام. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 10. في فيفو الدم الكلى Perfused. (A) تتعرض الكلية اليسرى ووضعها في كوب الكلى، يبقى الكلية اليمنى سليمة داخل الحيوان. يتم إدراج كل من أجهزة الاستشعار في الكلى. هي التي غرست كلوريد الصوديوم عن طريق الوريد الوداجي القثطار لمواجهة تسببت في فقدان السوائل ب: BSAذ تندس كبير خط منتصف شق (B) مثال من التجربة في الجسم الحي مع القسطرة الخلالي زرع للتطبيقات الدوائية مباشرة 1) يقام الكلى بنسبة فنجان الكلى 2) استشعار ATP 3) جهاز استشعار لاغية و4) القطب المرجعي إلى السطح البطني في الكلى 5) القسطرة زرعها في الكلى وتعلق على مضخة تحوي للدفعات الدوائية الصفحي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم، الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 11. مثال تحليل فيفو من H 2 فرعية> O 2 في الكلى. يسبب انج II نضح H 2 O 2 الافراج في قشرة الكلى الفئران. (A) التغييرات في الوقت الحقيقي للمتوسط H 2 O 2 تركيز (تظهر القضبان الرمادية الخطأ المعياري) من إجمالي N = 8 تطبيقات (4 الكلى من 4 الفئران مختلفة). الحانات على رأس تمثل تطبيق انج II. (ب) H أقصى 2 O 2 قيم تركيز السعة خلال نضح انج الثاني للسبراغ داولي (SD) ودال حساسية للملح (SS) الفئران التي تغذت على وجبات منخفضة وعالية الملح، على التوالي. * - P <0.05 مقابل الفئران SD. ويتم تكييف هذا الرقم من 12 إشارة بإذن. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
/files/ftp_upload/53059/53059fig12.jpg "/>
الرقم 12. وفي تحليل فيفو من H 2 O 2. مثال للتقييم في الجسم الحي من خلالي H 2 O 2 تركيز في النخاع من الفئران SS تغذية اتباع نظام غذائي منخفض الملح (كما هو موضح في الشكل 10B). أنتجت تطبيق الخلالي من الكاتالاز عن طريق القسطرة زرع للفاصل 5 دقائق حصار كامل للH 2 O 2 في إشارة إلى النخاع الكلوي. الحد من الكاتلاز، من فشل من قبل تدفق الدم الكلوي، أدى إلى انتعاش جزئي للإشارة، الذي تم حظره مرة أخرى عن طريق تطبيق الكاتالاز إضافي (10 دقيقة). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد وضعت البروتوكولات الحالية لتعزيز والقرار الزماني والمكاني للATP وH 2 O 2 الإشارات على الكلى-perfused الدم خارج الجسم الحي معزولة، perfused والحية. الاختلافات بين البروتوكولات وأجهزة الاستشعار المستخدمة هنا توفر الحصول على البيانات الأمثل لأي كلاء الدوائية أو الدراسات الفسيولوجية. تتكون بروتوكولات 1) استشعار المعايرة، 2) إجراء العمليات الجراحية، 3) إعداد الحصول على البيانات، و4) تحليل البيانات. أنها تمكن القياسات في الوقت الحقيقي من التحاليل للعديد من الظروف التجريبية. وسيؤدي ذلك إلى مزيد من الضوء على أمراض الكلى وتطوير علاجات دوائية أكثر فعالية. نحن هنا تستخدم أجهزة استشعار لتحليل ATP وH 2 O 2. ومع ذلك، وأجهزة استشعار للمواد أخرى متوفرة أيضا ويمكن استخدامها. تم تطبيق البروتوكولات المذكورة هنا لدراسة ATP وH 2 O 2 في الكلى الفئران، ولكن في نفس methoيمكن بسهولة د تعديلها لتطبيقها في الفئران. وبالتالي، فإن هذا النهج لديه إمكانات كبيرة بالنظر إلى وفرة من نماذج القوارض الوراثية.
وقد تم تطوير التصميم الأساسي لهذه الأجهزة مسرى مكروي الأنزيمية في عام 1960 من قبل كلارك وليون 2. بعد التطوير الأولي من أجهزة الاستشعار، تم إحراز تقدم في كل من التصميم 17-19 والتطبيقات 20. Llaudet آخرون 21،22 طور التصميم الرئيسي للاعبي التنس المحترفين أجهزة الاستشعار المستخدمة في البروتوكولات الحالية في حين تستخدم أساليب من Cosneir وآخرون. (23) لطلاء الانزيم. وقد كشفت هذه المجسات ATP يشير في عدد من العمليات الفسيولوجية بما في ذلك الإفراج ATP من الخلايا النجمية في الدماغ 8، وتنظيم التنفس 4،24، والهيكل العظمي والعضلات شرين تنظيم 25. مؤخرا تم استخدام بروتوكول فيفو السابقين لقياس ATP يشير في الكلى 12. والهدف من هذه المخطوطة طالصورة لتوفير توجيهات ورؤى فعالة للكشف عن المواد المحلية مثل ATP في الكلى.
أجهزة الاستشعار مسرى مكروي الأنزيمية لها مزايا عديدة أكثر من الوسائل الحالية لقياس التحاليل المجراة. ومع ذلك، يجب استخدام احتياطات خاصة لهذا النهج كما في أي طريقة أخرى جديدة. التحقق من صحة مع نهج مستقر يوفر الثقة في البيانات التي تم الحصول عليها. على سبيل المثال، تم إجراء قياسات microdialysis كما هو موضح سابقا 26،27. لم يلاحظ أي فرق كبير بين تراكيز الذروة التي تحددها أجهزة الاستشعار وتلك التي تم الحصول عليها من عينات غسيل الكلى 12. الحد من microdialysis هو أنه يقيس فقط مستويات ثابتة للدولة من تحليلها. على هذا النحو، لا يمكن أن يتحقق تقييم التغيرات الديناميكية في الخلايا مما يشير فقط مع استخدام أجهزة الاستشعار مسرى مكروي الأنزيمية. مواصفات المصنع من أوقات الاستجابة استشعار تختلف بين أجهزة الاستشعارأنواع. خارج الحي أجهزة الاستشعار لديها وقت الاستجابة من 5-10 ثانية، وأجهزة الاستشعار في الجسم الحي من 30-35 ثانية للصعود إشارة 10-90٪. آثار المعايرة (أرقام 6 و 7) تدل على قرار وقت إضافة الحليلة / إزالة. لكل من أجهزة الاستشعار وmicrodialysis النهج، مطلوب استخدام إنزيمات معينة لمنع إشارة التي تنتجها تحليلها لضمان خصوصية.
البروتوكولات وصفها لديها العديد من التحديات. كما هو الحال مع أي الإدراج الاستشعار في الأنسجة، ويحدث تلف الأنسجة. هذا يمكن تفعيل مسارات الإشارات التي قد تؤثر على القياسات 28. للحد من تلف الخلايا، ستكون هناك حاجة إلى أجهزة الاستشعار أرق. ومع ذلك، فإنه من الصعب اختراق كبسولة الكلى مع أجهزة الاستشعار وهكذا يتم استخدام الإبر لجعل ثقب دخول صغير. هي مجسات رقيقة أكثر عرضة للثني وتعطيل طلاء على الإدراج. أجهزة الاستشعار قطرها أكبر وأكثر مقاومة الانحناء وresultaالضرر الشمالي للمن الطلاء. الشكل (3) يوضح جهاز استشعار رقيقة وسميكة. بالإضافة إلى مقاومة أجهزة الاستشعار سميكة على الانحناء، وأنها تحتوي على طبقة أكثر سمكا من الطلاء، وتوفير مزيد من الحماية للطبقة الأنزيمية. كان القلق من تلف الأنسجة الناجمة عن استخدام أجهزة الاستشعار سميكة أقل بكثير في الكلى مما سيكون عليه في أنسجة المخ. ويقترب عمق الإدراج ويجب التأكد من صحتها الموضع النهائي بعد الانتهاء من القياسات على الكلى. تقدير بين القشرة والنخاع الطبقات باستخدام جهاز استشعار طول الحافة بمثابة دليل الإدراج وغير كافية كما غيض الاستشعار هو 0.5 ملم وقشرة الكلى 2-3 مم. قاذورات من أجهزة الاستشعار يحدث أيضا بمعدل أكبر في الدم، وبالتالي الحد من استخدام أجهزة الاستشعار في فترة طويلة في بروتوكولات الجسم الحي لتجربة واحدة. أسفرت تسجيل أوقات 1-1 ساعة ونصف إلا في الانجراف استشعار صغير. المعايير الرئيسية عند تقييم أداء جهاز استشعار انخفاض هو انخفاض الحساسيةلتحليلها أثناء عملية المعايرة. زيادة الضجيج الكهربائي وعدم الاستقرار من خط الأساس الحالية يمكن أن يشير أيضا إلى أن الطرف استشعار معطوب. لقياسات دقيقة للاعبي التنس المحترفين، يتعين على أجهزة استشعار (ATP وخالية) يكون الضجيج والاستقرار خصائص مماثلة لمزيد من الطرح للإشارة. خلاف ذلك، واحدة من أجهزة الاستشعار ويجب استبداله. لانخفاض مستوى الضجيج والكشف عن تجمعات صغيرة من تحليلها، ويقترح استخدام أجهزة استشعار جديدة لكل حيوان.
عدة خطوات حاسمة للنتائج التجريبية الناجحة. أجهزة الاستشعار هشة للغاية ويجب التعامل معها بعناية لتجنب إتلاف طرف الاستشعار. أيضا، بعد الإماهة، لا ينبغي أن يتعرض أجهزة الاستشعار في الهواء لأكثر من 20 ثانية. مطلوبة التسجيلات الضوضاء المنخفضة للكشف بنجاح الإشارات البيولوجية في الأنسجة. لهذا الغرض، لا بد من الجدول الهواء المختبر عالية الأداء وأسس الكهربائية المناسب. إضافة الكميات الدقيقة لتحليلها الدرجي الخطوات المعايرة هو ضروري لدقة تحديد تركيز في التجارب. وتحقيق المقاصة جيدة في الكلى في الجسم الحي السابقين جراحات الكلى يؤدي إلى التسجيلات الناجحة. استخدام الإنزيمات آبيراز والكاتالاز في المعايرة والتجارب يسمح لتقييم استشعار حساسية غير محددة ويؤكد القياسات.
هذه البروتوكولات توفر تتعزز بشكل كبير من التفصيل من إشارات الخلية في الكلى. تحسن الحساسية والدقة الزمنية التي تتيحها أجهزة الاستشعار قد تسمح لنا لحل التغييرات في ATP يشير في الحالات المرضية وبعد التلاعب الدوائية التي كانت غير قابلة للكشف في وقت سابق. بروتوكول في الجسم الحي هو مناسب تماما للدراسات فسيولوجية معقدة في حين خارج الجسم الحي هو الأمثل لدراسة التطبيقات الدوائية على الكلى. تصميم أجهزة الاستشعار في الجسم الحي المستخدمة هنا يمكن مقاومة غير مسبوقة ضد التدخل في BLالعود-perfused الأنسجة. مجتمعة، هذه المجسات توفر كمية كبيرة من التطبيقات التي كانت في السابق غير ممكن مع البروتوكولات والتقنيات الموجودة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
قدمت أجهزة استشعار لتسجيل الفيديو من هذه المخطوطة التي كتبها ساريسا الطبية المحدودة (كوفنتري، المملكة المتحدة).
Acknowledgments
نحن نقدر ساريسا الطبية الحيوية لعملهم في تطوير أجهزة الاستشعار المستخدمة في هذا المخطوط. وأيد هذا البحث من قبل الوطني للقلب والرئة والدم المعهد يمنح HL108880 (A. Staruschenko)، HL 116264 (A. كاولي) وHL 122662 (A. Staruschenko وA. كاولي)، وهو مشروع ممول من كلية الطب في لجنة شؤون البحث العلمي ويسكونسن # 9306830 (O. Palygin) والنهوض و# برنامج البحوث والتعليم صحة ويسكونسن 9520217، والباحث الصغير منحة من مؤسسة الوطنية للكلى (O. Palygin).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sensor Kit | Sarissa Biomedical | SBK-ATP-05-125 | The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes. Also included with the kit is the user's choice of sensors. |
| Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-ATP-05-125 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissagold ATP Biosensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-ATP-10-50 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissaprobe null sensor 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-NUL-20-125 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissagold null sensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-NUL-10-50 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissaprobe ATP Manual | Sarissa Biomedical | http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf | |
| Faraday cage | TMC | ||
| Dual channel potentiostat | Digi-Ivy | DY2021 | Type II Faraday cage |
| Data acquisition program | Digi-Ivy | DY2000 | |
| Perfusion pump | Razel Scientific Instruments | Model R99E | |
| Fiber optic illuminator | Schott | ACE 1 | |
| micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| micromanipulator magnetic stand | Narishige | GJ-8 | |
| air table | TMC | 63-500 | |
| isoflurane ventilator | LEI Medical | M2000 | |
| 3 ml petri dish | Fisher Scientific | S3358OA | |
| needle | Santa Cruz | 26-30 G | |
| pins | Standard dissection pins | ||
| catheter | Polyethylene tubing (PE50) | ||
| catheter tissue glue | Vetbond | 1469SB | |
| suture | Look | SP117 | |
| rubber bands | any 2-4 mm wide rubber bands | ||
| silicone | Momentive | RTV-615 Clear 1# | |
| clamp | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| standard dissection kit | Kit should include scalpel and dissection sissors | ||
| Kidney Cup | Of own design | ||
| standard chemicals | Sigma-Aldrich | ||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | 100 mM ATP solution |
| hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A7646 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| isoflurane | Clipper | 10250 | |
| inactin | Sigma-Aldrich | T133 | |
| ketamine | Clipper | 2010012 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 |
References
- Palygin, O., Staruschenko, A. Detection of endogenous substances with enzymatic microelectrode biosensors in the kidney. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 305, 89-91 (2013).
- Clark, L. C., Lyons, C. Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery. Ann N Y Acad Sci. 102, 29-45 (1962).
- Haruyama, T. Micro- and nanobiotechnology for biosensing cellular responses. Adv Drug Deliv Rev. 55, 393-401 (2003).
- Huckstepp, R. T., et al. Connexin hemichannel-mediated CO2-dependent release of ATP in the medulla oblongata contributes to central respiratory chemosensitivity. J Physiol. 588, 3901-3920 (2010).
- Lopatar, J., Dale, N., Frenguelli, B. G. Minor contribution of ATP P2 receptors to electrically-evoked electrographic seizure activity in hippocampal slices: Evidence from purine biosensors and P2 receptor agonists and antagonists. Neuropharmacology. 61, 25-34 (2011).
- Avshalumov, M. V., Chen, B. T., Marshall, S. P., Pena, D. M., Rice, M. E. Glutamate-dependent inhibition of dopamine release in striatum is mediated by a new diffusible messenger, H2O2. J Neurosci. 23, 2744-2750 (2003).
- Frenguelli, B. G., Wigmore, G., Llaudet, E., Dale, N. Temporal and mechanistic dissociation of ATP and adenosine release during ischaemia in the mammalian hippocampus. J. Neurochem. 101, 1400-1413 (2007).
- Lalo, U., et al. Exocytosis of ATP from astrocytes modulates phasic and tonic inhibition in the neocortex. PLoS Biol. 12, e1001747 (2014).
- Heinrich, A., Ando, R. D., Turi, G., Rozsa, B., Sperlagh, B. K+ depolarization evokes ATP, adenosine and glutamate release from glia in rat hippocampus: a microelectrode biosensor study. Br.J Pharmacol. 167, 1003-1020 (2012).
- Dale, N. Purinergic signaling in hypothalamic tanycytes: potential roles in chemosensing. Semin Cell Dev Biol. 22, 237-244 (2011).
- Gourine, A. V., Llaudet, E., Dale, N., Spyer, K. M. Release of ATP in the ventral medulla during hypoxia in rats: role in hypoxic ventilatory response. J Neurosci. 25, 1211-1218 (2005).
- Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H2O2 release in freshly isolated kidneys. Am J Physiol Renal Physiol. , (2013).
- Thome-Duret, V., Gangnerau, M. N., Zhang, Y., Wilson, G. S., Reach, G. Modification of the sensitivity of glucose sensor implanted into subcutaneous tissue. Diabetes Metab. 22, 174-178 (1996).
- Wilson, G. S., Gifford, R. Biosensors for real-time in vivo measurements. Biosens. Bioelectron. 20, 2388-2403 (2005).
- Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-Channel Analysis of TRPC Channels in the Podocytes of Freshly Isolated Glomeruli. Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).
- Stockand, J. D., Vallon, V., Ortiz, P. In vivo and ex vivo analysis of tubule function. Compr Physiol. 2, 2495-2525 (2012).
- Turner, A. P. Biosensors: Fundamentals and applications - Historic book now open access. Biosens. Bioelectron. 65C, A1 (2014).
- Kauffmann, J. M., Guilbault, G. G. Enzyme electrode biosensors: theory and applications. Methods Biochem Anal. 36, 63-113 (1992).
- Barlett, P. N., Cooper, J. M. A review of the immobilization of enzymes in electropolymerized films. J Electroanal Chem. 362, 1-12 (1993).
- Kano, K., Morikage, K., Uno, B., Esaka, Y., Goto, M. Enzyme microelectrodes for choline and acetylcholine and their applications. Anal Chim Acta. 299, 69-74 (1994).
- Llaudet, E., Hatz, S., Droniou, M., Dale, N. Microelectrode biosensor for real-time measurement of ATP in biological tissue. Anal Chem. 77, 3267-3273 (2005).
- Llaudet, E., Botting, N. P., Crayston, J. A., Dale, N. A three-enzyme microelectrode sensor for detecting purine release from central nervous system. Biosens Bioelectron. 18, 43-52 (2003).
- Cosnier, S., Lepellec, A., Guidetti, B., Isabelle, R. -L. Enhancement of biosensor sensitivity in aqueous and organic solvents using a combination of poly(pyrrole-ammonium) and poly(pyrrole-lactobionamide) films as host matrices. J Electroanal Chem. 449, 165-171 (1998).
- Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329, 571-575 (2010).
- Kluess, H. A., Stone, A. J., Evanson, K. W. ATP overflow in skeletal muscle 1A arterioles. J. Physiol. 588, 3089-3100 (2010).
- Nishiyama, A., Jackson, K. E., Majid, D. S., Rahman, M., Navar, L. G. Renal interstitial fluid ATP responses to arterial pressure and tubuloglomerular feedback activation during calcium channel blockade. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290, H772-H777 (2006).
- Jin, C., et al. Effects of renal perfusion pressure on renal medullary hydrogen peroxide and nitric oxide production. Hypertension. 53, 1048-1053 (2009).
- Khan, A. S., Michael, A. C. Invasive consequences of using micro-electrodes and microdialysis probes in the brain. Trends Anal. Chem. 22, 503-508 (2003).
