Abstract
효소 미세 바이오 센서가 널리 실시간으로 세포 외 시그널링을 측정하는 데 사용되어왔다. 그 사용의 대부분은 뇌 조각 및 신경 세포 배양에 국한되고있다. 최근에,이 기술은 전체 기관에 적용되었다. 센서 설계의 발전은 혈액 관류 생체 신장에서의 세포 신호의 측정을 가능하게했다. 본 프로토콜은 쥐의 신장 간질의 ATP와 H 2 O 2 신호를 측정하는 데 필요한 단계를 나열합니다. 두 개의 개별 센서 디자인에 대한 생체 외 및 생체 내 프로토콜을 사용한다. 센서의 두 가지 유형은 빠른 응답, 민감하고 선택적 바이오 센서를 제공하기 위해 침투 선택성 층 위에 얇은 효소 biolayer로 코팅되어있다. 침투 선택성 층은 생체 조직 내의 간섭 물질로부터의 신호를 보호하고, 효소 층은 글리세롤 키나제 및 글리세롤 -3- 진료 기관 연합의 연속 촉매 반응을 이용하는ATP의 존재 phate 다제는 H 2 O 2를 생성한다. 생체 연구에 사용되는 센서의 세트는 더 백금 / 이리듐 (PT-IR) 와이어 전극에 H 2 O 2의 산화에 의한 분석을 감지했습니다. 생체 내 연구 센서 대신 혈액 관류 조직을 위해 설계 매개 코팅 금 전극 상 H 2 O (2)의 감소에 기초한다. 최종 농도 변화를 분석 알려진 농도로 보정 한 다음 실시간 amperometry에 의해 감지됩니다. 또한, 전류 측정 신호의 특이성은 O 2와 H 2 ATP 대응 분해 같은 카탈라제 등의 효소와 apyrase의 첨가에 의해 확인 될 수있다. 이 센서는 이전과 각 실험 후 정확한 교정에 크게 의존하고있다. 다음 두 프로토콜은 ATP와 H 2의 실시간 검출에 대한 연구를 확립신장 조직에서의 O 2를, 또한 다른 생물학적 제제 또는 전체 기관에서 사용하기위한 상술 한 방법을 확장하도록 변형 될 수있다.
Introduction
(또한 본 원고에서 센서로 참조) 효소 미세 바이오 센서는 세포와 조직 생활에 동적 신호 전달 과정을 연구하기위한 유용한 도구가되고있다. 센서는 생물학적으로 관련 농도에서 세포 신호 분자의 시공간적 해상도를 증가 제공합니다. 대신 샘플링하고 장시간 간격에서 찍은 세포 외 체액을 분석하는 그들의 효소 분석 물에 반응으로, 이들 센서하여 실시간 측정 1,2- 제조, 빠르게 반응한다. 퓨린 또는 과산화수소 및 그들의 방출 역학 같은자가 분비 및 주변 분비 인자의 농도의 격자 간 고속 검출은 정상 및 병리학 적 상태 (3)에 약물의 효과에 대한 프로파일을 구축하는 데 사용될 수있다. 현재의 센서를 사용하는 애플리케이션의 대부분은 뇌 조직 슬라이스 및 세포 배양 4-10에왔다. 이 논문의 목적에 자세히 프로토콜정확하게 전체 신장의 분석을 실시간으로 농도를 측정하는 수단을 설치한다.
다음 프로토콜은 간질 ATP와 H 신장 2 O 2 신호를 연구하기 위해 개발되었다. 신장의 네이티브 환경에서 세포 외 ATP 빠르게 그 유도체 (ADP, AMP 및 아데노신)로 내인성 ectonucleotidases에 의해 이화됩니다. 여기에 사용 된 센서는 다른 퓨린 또는 ATP 분해물 11 위에 ATP에 매우 선택적이다. 이 ATP 릴리스 및 신호 함수의 상수 및 동적 농도를 정확하게 모니터링 할 수 이것은 큰 장점을 제공합니다. 간질 ATP 농도는 두 개의 마이크로 전극의 조합, ATP 센서 및 null 센서를 사용하여 측정된다. 카탈라제 애플리케이션과 함께 널 센서 간질 H 2 O 2 농도 12을 검출 할 수있다. 다음 프로토콜은 열차의 두 개의 서로 다른 디자인을 사용하여중 생체 또는 생체 내 응용 프로그램에서 최적의 특성을 가지고 RS.
두 가지 설계는 효소 센서 층에 함유 글리세롤 키나제 및 글리세롤 -3- 인산 옥시 다제의 연속 촉매 반응에 기초하고 있으며 ATP의 존재에 의해 구동된다. 생체 외 연구에 사용 된 센서의 세트, H 2 O 2, 최종 효소 반응 생성물에서, 백금 / 이리듐 (PT-IR), 와이어 전극의 산화에 의해 검출된다. 생체 내 연구를위한 센서 대신에 혈액 관류 조직을 위해 설계 중재자 코팅 된 금 전극에 2 O 2의 감소 (H)을 기반으로합니다. 이 논문에 기술 된 두 프로토콜의 방식은 그림 1에서 보여진다. 이 효소 결합 결여 제외 널 센서는 해당 센서 ATP와 동일하다. 따라서, 카탈라제 효소로 H 2 O (2)의 검출에 더하여, 널 센서 MEAsures 비특이적 간섭. ATP 농도는 널이 비특이적 간섭과 ATP 센서 신호로부터 배경 H 2 O 2를 감지 빼서 계산한다. 여러 센서는 해당 널 (null)와 결합 할 때 생체에 대한 아데노신, ionosine, 하이포크 산틴, 아세틸 콜린, 콜린, 글루타민산, 포도당, 젖산, 생체 응용 프로그램이나 아데노신, ionosine을위한 D- 세린 및 하이포크 산틴을 포함하여 다른 분석을 감지 상업적으로 이용 가능하다 센서.
정확하게 분석 물을 검출하는 센서의 기능은 적절한 교정 전후 13에 의존한다. 이 분석은 생물학적 조직의 사용 중에 발생하는 센서의 감도의 편차를 차지하는 것을 보장한다. 센서는 센서 효소 반응에서 시약으로서 사용되는 글리세롤의 저장소를 보유하고있다. 센서를 포함하는 조 글리세롤 용액에 사용되지 않는 경우, 시간이 지남에 따라 세척한다. 짧은 Recording 시간은 센서 드리프트를 최소화 할 필요가있다. 또한 크게 센서 (14)의 감도를 감소시킬 수있는 내인성 단백질 분해 효소 및 단백질 절편으로 오염 센서.
본 원고는 생체 외 및 생체 신장에 효소 제제 미세 바이오 센서의 사용을 설정한다. 실시간 분석 정량 신장 질환 및 약리 에이전트의 메커니즘에 새로운 통찰력을 공개 할 수 세포 신호 전달의 전례가없는 세부 사항을 제공합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드에 부착 된 다음 동물 절차. 이전 승인 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)로부터 얻은 것입니다.
참고 : 센서 제조업체 지침의 검토는 실험 설계 및 사용 전에 동안 수행해야합니다. 센서를 사용하는 경우이 지침을 따르는 것은 최적의 결과를 생성합니다.
1. 센서 교정
- 실험 시작 전에 신선한 원액을 준비한다.
- 10 mM의 NAPI 버퍼, 100 mM의 NaCl을, 1 밀리미터의 MgCl 2, 2 mM의 글리세롤을 포함하는 버퍼를 작성합니다. NaOH를 사용하여 7.4으로 산도를 조정합니다. 2-8 ℃에서 보관하십시오.
- -20 ℃에서 보관 콘텐츠 ATP 농도 (100 mm)를 사용하여, 버퍼 A. 90 μL에 10 μL 스톡을 첨가하여 10 mM의 ATP 신선한 교정 액을 만들
- T에의 팁 (그림 2)을 배치하여 ATP 센서를 재수2-8 ℃에서 적어도 10 분 동안 버퍼를 포함하는 그 재수 챔버.
주 : 재수 후, 센서는 20 초 동안 공기에 노출되지 않아야하거나, 센서의 감도가 감소 될 수있다. 공기에 장시간 노출이 예상되는 경우, 글리세롤의 솔루션으로 간단히 센서를 찍어. 센서는 여러 실험을 위해 사용될 수 있지만, 이들은 센서 재수 같은 날에 발생한다. 센서는 최대 24 시간 동안 완충액 A와 재수 화 챔버 내에 저장 될 수있다. - 듀얼 채널 텐쇼 (그림 3)의 전원을 켜고 녹화 시스템 소프트웨어를 시작합니다.
- 버퍼 A. 찾는 3 ㎖ 교정 챔버로 기준 전극과 교정 챔버를 준비한다. 다음, 재수 실에서 각 센서를 가지고 조작에 부착하고 교정 실 솔루션에 삽입합니다.
참고 : 교정 실 같은 표준 실리콘 코팅 된 배양 접시를 사용합니다. 모든 교정과 일을 수행고성능 실험실 공기 테이블에 패러데이 케이지 udies는 amperometry 녹음 (그림 4) 동안 신호의 노이즈를 줄일 수 있습니다. 교정은 가장 가능한 데이터 수집의 시작에 가깝게 수행됩니다. 생체 내 응용을 위해 교정을위한 최적의 시간은 동물의 수술 후 회복 기간이다. - 예 생체 내 교정
- 10 사이클 100 mV / 초의 속도에서 +500 MV에 -500 mV 이상 센서를 순환시킴으로써 교정 챔버 내의 순환 전압 전류 법을 수행한다. 이것은 크게 센서의 감도를 향상시킨다. 10 사이클에서 관찰 된 흔적은 그림 5를 참조하십시오.
- 마지막주기 후 600 MV에 센서를 극화. 센서 전류 점근선에 소멸한다. 꾸준한 독서는 최소 5 분 후에 얻을 수있다. 제로 값을 기록한다.
- 생체 센서 교정
- 생체 열차에 순환 전압 전류를 수행하지 마십시오RS. 대신, MV +500 30 초 동안 챔버 내의 교정을 편광 센서. 그 다음에 0 MV 텐쇼를 설정하고, 센서 전류 점근선까지 상승 할 수있다. 센서 전류는 점근선에 적어도 2 분 소요됩니다. 제로 값을 기록한다.
- 연속적으로 원하는 검출 범위를 포괄 검량선을 제조 챔버로 ATP 용액의 양 세트를 추가한다. ATP가 챔버 전체에 고르게 확산로서 ATP 용액 붕괴 뒤에 처음 센서 신호에서 날카로운 피크를 생성한다. 기록 신호 값은 신호 레벨이되면. 각 ATP 첨가 후도 6a 및도 7 트레이스 안정화 각각 생체 내 연구 모두에 대한 생체 외 및 ATP의 농도를 제안했다.
주 : 분석 물 거제를 사용하여 전극의 선택성을 확인하는 것이 중요하다. 본 프로토콜은 H <대한 ATP 센서와 카탈라아제의 특이성을 테스트 apyrase 사용서브> 2 O 2 신호 (도 6B). 약물이 투여되는 경우, 센서와의 반응성 측정을 연구하기 전에 결정되어야한다. - ATP 센서 (제로 수준 (그림 7)로 감소한다 ATP 응용 프로그램에 의해 생성 된 전류의 특이성을 테스트하기 위해 2 ㎎ / ㎖ (89 UN / mg)의 재고에서 apyrase의 3 μl를 추가합니다.
- (2 O 2 응용 프로그램이 제로 독서로 감소한다 (H)에 의해 생성 된 전류) 널 센서의 특이성을 테스트하기 위해 2 ㎎ / ㎖의 재고 (100 UN / mg)을에서 카탈라아제의 3 μl를 추가합니다.
센서 연구 2. 동물 수술
- 생체 수술
- 이소 플루 란 (5 % 유도, 1.5 %, 2.5 유지) / 의료용 O 2 또는 다른 승인 된 방법으로 실험 동물을 마취. (12) 동물이 지속적으로 마취의 적절한 수준을 보장하기 위해 모니터링해야합니다 (15)를 제공합니다. 세인트수 호흡과 발가락 핀치 반응은 적절한 마취를 확인하는 데 사용됩니다.
승인 IACUC 프로토콜에 따라 동물을 안락사 :합니다. 모든 비 생존 절차의 완료시 동물 (12)의 인간적인 소멸을 위해 기흉 개흉술을 유도하여 깊게 마취 동물을 안락사. - 앙와위에서 온도 조절 수술대에 쥐를 놓습니다. 적절한 마취 깊이를 유지하면서, 왼쪽 신장에 부합하는 약 5cm의 정중선을 절개하고 원위 복부 대동맥을 노출.
- 복강 및 상 장간막 동맥, 이러한 동맥 위의 복부 대동맥 주위에 끈을 감싸하지만 결찰하지 않습니다. 신장 동맥 아래 복부 대동맥 주위에 두 개의 합자를 감싸.
- 합자 위의 복부 대동맥을 클램프. 낮은 합자 넥타이. 폴리에틸렌 관 (PE50)와 복부 대동맥을 카테 테르를 꽂다. 두 번째 대동맥 결찰로 카테터를 고정.
- 클램프를 제거하고 장간막과 복강 동맥을 결찰. 신장이 완전히 희게 때까지 2-3 분 동안 실온에서 행크스 균형 염 용액 6 ml / 분으로 신장을 관류.
- 대동맥의 일부를 접속 신장 및 카테터를, 절제. 목욕 솔루션으로 가득 3 ㎖ 페트리 접시에 신장을 놓습니다.
주 : 실험 프로토콜은 RT에서 수행 될 수있다. (145)의 NaCl, 4.5의 KCl, 2의 MgCl 2, 1 염화칼슘 2, 10 HEPES, NaOH로 pH를 조정 7.35 : 목욕 솔루션은 mm 단위가 포함되어 있습니다.
- 이소 플루 란 (5 % 유도, 1.5 %, 2.5 유지) / 의료용 O 2 또는 다른 승인 된 방법으로 실험 동물을 마취. (12) 동물이 지속적으로 마취의 적절한 수준을 보장하기 위해 모니터링해야합니다 (15)를 제공합니다. 세인트수 호흡과 발가락 핀치 반응은 적절한 마취를 확인하는 데 사용됩니다.
- 생체 수술
- 승인 IACUC 프로토콜을 사용하여 랫트를 마취. 생체 분석을 위해 케타민와 쥐 (20 ㎎ / ㎏ 임) 및 inactin (50 ㎎ / ㎏ IP)을 마취. 동물은 계속적으로 마취 적절한 수준을 보장하기 위해 모니터링되어야한다. 안정된 호흡과 발가락 핀치 반응은 적절한 마취를 확인하는 데 사용됩니다.
- 적절한 마취 깊이는 취득 후에드, 공기 테이블에있는 온도 조절 접지면에 앙와위에서 쥐를 놓습니다. 표면을 예열하고 36 ℃로 유지되어야한다.
- 적절한 마취 깊이를 유지하면서, 신장에 맞춰 중간 선 절개를 약 5cm합니다.
- 편향 및 전체 신장이 보이도록 피부와 피하 조직을 고정하는 봉합사를 사용한다. 움직임 아티팩트를 최소화하기 위해 신장 컵에서 신장을 놓습니다.
- 혈액량을 유지 경정맥을 통하여 1 ㎖ / 100g의 / hr이고 0.9 %의 NaCl : 2 % BSA의 IV 주입을 사용한다. 소변 수집을위한 두 요관을 Cannulate. 장소 장간막과 복강 동맥 주변의 관계 및 신장 관류 압 (도 10a)의 조작을위한 원심 aortal.
- 약학 제제의 적용은 생체 내 실험을하는 동안 필요하다면, 간질 카테터 삽입 (도 10B 추천
3. 데이터 수집 설정
- 데이터 수집 프로그램을 열고 모두 생체과 양극 긍정적으로 생체 실험에서 극성을 설정합니다. ASCII 코드로 데이터를 저장하는 프로그램을 설정합니다.
- 신장에 센서의 빠른 삽입을위한 미세 조작기를 놓습니다.
참고 : 또는 센서의 원하는 위치를 달성 할 수 있도록 미세 조작기에 부착 된 더미 프로브를 사용합니다. - 생체 데이터 취득
- / 분으로 650 μL의 일정한 속도로 대동맥을 통해 캐 뉼러 (2.1.6)에서 욕조 용액 신장을 관류. 수술 가위를 사용하여 조심스럽게 센서 삽입에 필요한 신장 캡슐을 제거합니다.
- 고무 밴드 신장을 통해 묶여 핀과 실리콘 코팅 접시에 부착와 신장을 고정합니다.
- 그 팁에 빠져들와 페트리 접시에 신장에 가까운 기준 전극을 배치완충 용액.
- 생체 데이터 취득에
- 신장 컵에서 신장을 놓습니다. 동물의 변형 및 연령에 따라. 느슨하게 신장 보유 컵의 크기를도 8을 사용하여 신장 컵의 크기를 두 도표. 유사 컵 그러한 micropuncture 등 16 신장 기능의 분석에 집중 다른 생리적 접근을 위해 사용된다.
신장 컵의 위치는 동물의 호흡에 의해 생성 된 기계적인 노이즈를 제거하는 것이 중요하지만, 방해 또는 신장 관류 또는 소변의 흐름을 차단하지 않아야합니다. - 데이터 수집을 수행하기 전에 복구 시간이 45 분을 허용한다.
- 26-30G 바늘을 사용하여, 신장에서 센서의 위치 및 소정의 깊이에 천공 구멍을 만든다. 스며 혈액을 제거하기 위해 표면에 구멍을시킨다. 신장의 표면에 글리세롤 솔루션을 추가합니다. 이 실험 기간 동안 마르지 신장 표면을 방지 할 수 있습니다. 재수 실에서 제 1 센서를 제거하고는 미세 조작기에 연결합니다. 신속, 20 초 이내에, 신장에서 갓 만든 구멍에 전극을 삽입합니다. 반복 널 센서 3.5-3.9 단계를 반복합니다.
- 센서에서, 신장에 약 1cm를 기준 전극을 삽입합니다.
- 신장 컵에서 신장을 놓습니다. 동물의 변형 및 연령에 따라. 느슨하게 신장 보유 컵의 크기를도 8을 사용하여 신장 컵의 크기를 두 도표. 유사 컵 그러한 micropuncture 등 16 신장 기능의 분석에 집중 다른 생리적 접근을 위해 사용된다.
- 텐쇼의 전원을 켜고 컴퓨터에 기록 프로그램을 활성화합니다. (9) 생체 신장 데이터 수집의 마지막 설정을 보여줍니다. (10)가 삽입 된 카테터와 생체 신장 데이터 수집의 마지막 설정을 보여줍니다.
4. 데이터 분석
- 기원 또는 임의의 다른 유사한 소프트웨어에 ASCII 데이터 파일을 가져.
- 농도 현재 관계
- 전류에 선형 농도 (X- 축)을 구축하기 위해 ATP 또는 H 2 (Y시킴으로써 행한다)의 관계를 선형 피팅 / 외삽 기능을 사용하여 2 교정 점 (도 6 및도 7).
선형 피팅 라인 : Y = MX + B
- 전류에 선형 농도 (X- 축)을 구축하기 위해 ATP 또는 H 2 (Y시킴으로써 행한다)의 관계를 선형 피팅 / 외삽 기능을 사용하여 2 교정 점 (도 6 및도 7).
- 농도 전류 동일시
- 세포 내 ATP에 의해 생성 된 실제 전류를 얻기 위해 ATP 센서들로부터 널 센서의 측정 흔적을 뺀다.
- 4.2.1에 설명 된 교정 방정식을 사용하여 nm의 amperometry에 의해 얻어진 포장 된 ATP 값을 변환합니다. "X"값으로 각각 조정 전류를 가져 오기 및 Y (분석의 농도)에 대한 해결하여 ATP 센서의 감산 데이터 트레이스의 농도를 결정합니다.
- 필요한 경우 유사하게, 그것의 교정 식 H 2 O 2 농도를 계산한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
효소 미세 바이오 센서의 설계는 전체 신장의 분석 물질의 실시간 검출 할 수있다. 어느 생체 외 또는 생체 내 연구에서 일반적인 실험 디자인이 사용될도 1 국지적 센서에 도시되고, 수술 절차는 연구 하는가에 따라 달라 생체 외 또는 생체 내에서이다.
재현 가능한 결과, 정확한 사전 및 사후 교정을 얻으려면입니다 중요.도 6a는 교정하는 동안 생체 ATP 센서에서 본 신호의 대표 추적을 보여줍니다. 신속하게 apyrase 참고 ATP 신호를 제거. 카탈라제는 ATP 신호에 미치는 영향은 없습니다이 생성 H 2 O 2 (그림 6B)에 그 특이성을 보여줍니다. 교정 과정에서 VI. ATP의 동적 변경 (도 6A, 오른쪽 패널)을 계산하는 데 사용되는 선형 피팅을 생산VO 센서 교정은 생체 센서와 유사한 트레이스를 생성한다. 그러나,이 센서는 대신에 산화 환원 전류의 검출과 같은 현재의 제조 부정적이다. 이러한 센서의 교정은 0.3-80 μm의 범위에서 선형 피팅 (그림 7A 오른쪽 패널)를 생산하고 있습니다. 다른 퓨린 제품을 통해 ATP에 생체 센서의 특이성은도 7b에 표시됩니다.
여기에 설명 된 접근 방식은 우리가 약물 주입 (12)에 대한 응답으로 내인성 물질 및 급성 변화의 두 기저 수준을 측정 할 수 있습니다. 중앙 그림 11에 표시된 소금 내성과 소금에 민감한 쥐에서 H 2 O 2의 격자 간 내생 농도의 변화 II가 유도. 이 실험을 위해, 스프 라그 돌리 (SD) 또는 달 소금에 민감한 (SS) 쥐에서 갓 격리 신장은 일정 층류 (650 μL / 분)에서 1 μm의 중앙 II로 관류 하였다. 웃음으로WN 그림 11에서, 중앙 II는 SD와 SS 쥐 모두에서 신장의 H 2 O 2의 급성 방출을 유도한다. 그러나, 각 응답의 최대 진폭이 크게 동물 고염식이 12 먹였다 특히 SS 쥐들에서 증가 하였다. 생체 내에서 바이오 센서의 대표적인 애플리케이션은도 12에 도시. 카탈라아제 (5 μg의 / ㎖) 바이오 센서에 의해 감지 완전히 차단 H 2 O 2 신호의 주입. 이들 실험은 약물 학적 중재에 응답하여 내인성 물질 및 그 해제의 실시간 측정의 기초 수준의 검출을위한 전류 측정 기법과 결합 된 특정 효소 바이오 센서의 사용을 예시한다. 이 방법의 또 다른 응용 프로그램이 소금에 민감한 고혈압 같은 신장 병리에 대한 지식과 이해를 향상시킬 수 퓨린 신호 및 과산화수소의 역할을 연구, 신장 황소idative 스트레스와 만성 신장 질환.
프로토콜의 그림 1. 도식. 관심의 분석과 특이성 테스트와 교정 실험의 시작 직전에 이루어집니다. 생체 프로토콜은 복잡한 생리 학적 실험과 약물 학적 응용 프로그램에 대한 생체 추적 관찰해야한다. 포스트 실험 교정 수행 및 데이터 분석시 고려되어야한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 효소 바께 미세 센서. 두생체 응용 프로그램에 사용되는 센서의 크기는 50 μm의 125 μm의 직경을 표시됩니다. 각각의 센서는 금 와이어 단부 커넥터에 연결하는 모세관 튜브 내로 연장 (미도시). 삽입 된 ATP 검출을위한 효소로 코팅 된 센서 팁을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 듀얼 채널 텐쇼. 채널 1과 채널을 표시 텐쇼 채널. 1) CH1 ATP 센서 연결 및 2) CH2 전기적 기준 전극에 연결된다 널 센서 연결 3) 연결. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
FO 엉덩이 = "jove_content"유지 - together.within 페이지 = "항상"> 
그림 4. 센서 셋업은. 데이터 수집은 전기적 잡음을 줄이기 위해 패러데이 케이지 및 무진동 가공면 고성능 실험실 테이블에서 수행된다. 1) 온도 조절 수술대를 미세 조작기가 광원은 수술 절차와 센서 삽입 4에 필요한 실험 3) 동안 센서의 유연한 위치 결정을위한 자기 장착 어댑터에 연결된) 생리 학적 실험 2 중에 동물의 체온을 유지하기 위해 사용되는 ) 듀얼 채널 텐쇼 5) 센서 홀더. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
p_upload / 53059 / 53059fig5.jpg "/>
그림 5. 순환 전압 전류 법은. 생체 연구의 경우, 센서 순환 전압 전류는 -0.5 전에 교정 프로토콜 0.5 V 사이에서 10 사이클을 실시한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 생체 외 Amperometry 대한 보정. (A)는 교정 욕 용액에 공지 된 ATP 농도의 첨가를 사용한다. 점근선 레벨 (블랙 추적)에 기록 전류 측정 값을 해당. 얻어진 전류는 교정 방정식을 만들 수 있습니다. 예는 오른쪽 패널에 표시됩니다. 빨간 추적은 curre입니다H 2 O 2의 첨가 반응 널 센서 NT. (B) 상기 널 센서 조 용액 및 전류 측정 값이 기록되는 점근선 (얇은 검은 화살표)에 알려진 H 2 O 2 농도 (적색 화살표)의 추가로 교정된다. 목욕 솔루션 (두꺼운 검은 색 화살표)에 카탈라아제의 추가는 빠른 현재의 붕괴가 발생합니다. 오른쪽 패널은 널 센서 보정 방정식을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7. 대한 Amperometry 교정]. 생체 전극의 생체 내 보정이 환원 반응을 제외한 생체 연구에서 그 상세에 유사한 방식으로 역방향 전류 (극성) 원인을 행한다. (A) 공지 된 ATP 농도의 첨가는 ATP 센서 (검은 색 트레이스)에 전류계 전류를 생성하지만 널 센서 (적색 트레이스)에 아무런 영향을 미치지 않는다. apyrase 첨가 ATP 센서의 전류를 소멸시킨다. (B) ATP 센서의 특이성은 다른 퓨린 제제 (UTP, UDP 및 아데노신) 10 μM의 첨가에 의해 확인된다. ATP의 또 다른 응용 프로그램은 안정된 검출 전류 측정 전류를 제공한다. 중재자 코팅 된 금 전극에 따라 생체 센서 (C)의 현미경 사진. 이 figu의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오다시.
그림 8. 신장 컵은. 생체 내 연구에서, 신장은 여전히 표시 스테인레스 스틸 신장 컵을 사용하여 개최됩니다. 컵의 크기는 두 개의 신장 크기 변화를 수용하기 위해 사용된다. 이 컵은 동물의 호흡에 의해 생성 된 운동 아티팩트를 줄일 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9. 예 생체 절연 및 관류 신장은. 격리 된 신장은 두꺼운 실리콘으로 코팅 1) 페트리 접시에 배치됩니다핀 삽입 2) 신동맥은 실험 3) ATP 센서 동안 일정하게 관류 용 시린지 펌프에 삽관 및 부착을위한 licone 하단에는, 4) 및 널 센서 신장 5) 기준 전극을 침지 신장 근처에 배치되어 삽입된다 목욕 솔루션으로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
생체 혈액 관류 신장에서 그림 10. 왼쪽 신장이 노출과 신장 컵에 위치 (A)는, 오른쪽 신장은 동물 내부에 그대로 유지됩니다. 두 센서는 신장에 삽입된다. BSA : 염화나트륨은 유체 손실이 B를 발생 대응하기 위해 카테터 경정맥을 통해 주입된다Y 1), 신장은 신장 컵 2) ATP 센서 (3)) 널 센서 4) 기준 전극에 의해 유지되는 직접적인 약리 애플리케이션 이식 간질 카테터와 생체 내 실험의 큰 중간 라인 절개 (B) 실시 예는 삽입 층류 약물 주입 용 연동 펌프에 신장에 이식 및 장착 된 신장 5) 카테터의 복부 표면에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
H 2의 그림 11. 생체 외 분석 서브> 신장 O (2). 중앙 II 관류는 H에게 쥐의 신장 피질에서 2 O 2 방출됩니다. (A) 평균의 실시간 변경 N = 8 응용 프로그램의 총 H 2 O 2 농도 (회색 막대는 표준 오차를 표시) (4 다른 쥐 4 신장). 상단 바 중앙 II 응용 프로그램을 나타냅니다. (나) 최대 H는 스프 라그 돌리 (SD)와 달 소금에 민감한 (SS) 쥐에 대한 중앙 II 관류 동안 2 O 2 농도의 진폭 값은 각각 낮은 및 높은 소금 다이어트를 공급. * - P <SD 쥐에 비해 0.05. 그림이 권한 참조 (12)로부터 구성된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
/files/ftp_upload/53059/53059fig12.jpg "/>
(그림 10B 참조) H의 생체 분석 간질 (H)의 생체 내 평가 2 O 2. 예 그림 12. SS 쥐의 골수에서 2 O 2 농도가 낮은 소금 다이어트를 공급. 5 분 간격 이식 카테터를 통해 카탈라아제의 간질 응용 프로그램은 신장 수질에서 H 2 O 2 신호의 완전한 봉쇄를 생산했다. 신장 혈액의 흐름에 의해 세척에서 카탈라아제의 감소, 추가 카탈라아제 응용 프로그램 (10 분)에 의해 다시 차단 된 신호의 부분 복구 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
본 프로토콜은 ATP의 향상된 시간과 공간 분해능을 제공하기 위해 개발 된 생체 관류, 격리 및 생체 내에서 혈액 관류 신장을위한 H 2 O 2 신호가. 여기에 사용되는 프로토콜과 센서 간의 차이는 약리학 적 또는 생리 학적 연구 제제 중 최적 데이터 수집을 제공한다. 프로토콜 1) 센서 교정, 2) 외과 적 절차, 3) 데이터 획득 설정, 4) 데이터 분석 이루어져있다. 이들은 수많은 실험 조건에 대한 분석 물질의 실시간 측정을 가능하게한다. 이것은 큰 신장 질환에 대한 통찰력과보다 효과적인 약물 치료의 발전으로 이어질 것입니다. 여기서 우리는 ATP와 H 2 O 2를 분석하는 센서를 사용했다. 그러나, 다른 물질 센서도 사용할 수 있습니다 및 사용할 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 래트 신장에서 ATP 및 H 2 O 2를 연구하기 위해 적용되지만 동일한 운전 방식 하였다D는 마우스에서 쉽게 어플리케이션을 조정할 수있다. 따라서이 방법은 유전자 설치류 모델의 풍요 로움을 고려하여 큰 잠재력을 가지고있다.
효소 미세 바이오 센서의 기본 디자인은 클라크와 리용 2에 의해 1960 년대에 개발되었다. 바이오 센서의 개발 초기에 이어 진행 모두 17-19 디자인 및 응용 (20)에서 이루어지고있다. Llaudet 외. (21, 22)는 효소 코팅 Cosneir 외. (23)로부터의 방법을 사용하면서 본 프로토콜에 사용 ATP 센서의 디자인 원리를 개발했다. 이들 센서는 뇌에서 아스트로 8 ATP 릴리스 4,24 호흡 조절 및 골격근 세동맥 규제 25 포함한 생리 프로세스의 숫자에 ATP 신호를 검출했다. 최근 생체 외 프로토콜 신장 12 ATP 신호를 측정하는 데 사용되어왔다. 이 원고 I의 목표S는 신장에서 내인성 ATP와 같은 물질의 검출을위한 효과적인 방향과 통찰력을 제공한다.
효소 미세 바이오 센서는 생체 내에서 분석 물을 측정하는 기존의 방법에 비해 많은 장점을 갖는다. 그러나, 특별한주의는 다른 새로운 방법으로이 방법을 사용해야합니다. 설립 방법과 검증 얻어진 데이터에 대한 신뢰를 제공합니다. 앞서 설명한 바와 같이 26, 27, 예를 들면, 미세 투석 측정 하였다. 큰 차이는 센서 및 투석 샘플 (12)로부터 얻은 결정 피크 농도 사이에 관찰되지 않았다. 미세 투석의 한계는 단지 분석 물의 정상 상태의 농도를 측정한다는 것이다. 이와 같이, 세포 신호의 동적 변화의 평가 만 효소 미세 바이오 센서를 이용하여 달성 될 수있다. 센서 응답 시간의 제조소 규격이 서로 다른 센서유형. 생체 외 센서는 50-10 초와 10-90% 신호 상승위한 30-35 초 생체 센서의 응답 시간을 갖는다. 교정 트레이스 (도 6 및 7) 분석 추가 / 제거의 시간 해상도를 보여준다. 센서 및 미세 투석 방법 모두, 분석에 의해 생성 된 신호를 차단하는 특정 효소의 사용은 특이성을 보장 할 필요가있다.
설명 프로토콜은 몇 가지 문제가 있습니다. 조직에 어떤 센서 삽입과 마찬가지로, 조직 손상이 발생 않습니다. 이 측정에 영향을 미칠 수있다 (28) 신호 전달 경로를 활성화 할 수있다. 세포 손상을 최소화하기 위해 얇아 센서는 필요할 것이다. 그러나 바늘 작은 입구 구멍을 만들기 위해 사용되도록 센서 신장 캡슐을 관통하기가 어렵다. 얇은 센서는 구부러 가능성이 더 높습니다 및 삽입에 자신의 도장을 방해. 큰 직경의 센서보다 굽힘 저항 및 resulta 아르그들의 코팅. 그림 3에 NT 손상은 얇은 두께 센서를 보여줍니다. 굽힘 두꺼운 센서의 저항뿐만 아니라, 이들은 효소 층에 대한 보호를 제공하는 코팅의 두꺼운 층을 포함하고있다. 두께 센서를 사용으로 인한 조직 손상의 우려는 뇌 조직 것보다 신장에서 상당히 낮았다. 삽입 깊이는 근사하고 신장에서 측정이 완료된 후에, 최종 위치가 확인되어야한다. 센서 팁은 0.5 mm이고, 신장 피질 2-3 mm 두께 그대로 삽입 가이드로 센서 팁 길이를 이용하여 피질 및 수질 층 사이 추정은 충분하다. 센서의 오염은 또한 이렇게 한 생체 실험 프로토콜 긴 센서에서 사용을 제한하는, 혈액의 더 큰 비율로 발생한다. 1 ½의 시간 1의 녹화 시간은 단지 작은 센서 드리프트의 결과. 주요 기준 센서 저감 성능을 평가하는 것은 낮은 감도교정 과정에서 분석 물. 전기 노이즈 증가와 기준 전류의 불안정성도 센서 팁이 손상되는 것을 나타낼 수있다. ATP의 정확한 측정을 위해, 두 센서 (ATP와 널)는 신호의 추가 감산 비슷한 소음과 안정성 특성을 가져야한다. 그렇지 않으면, 센서 중 하나는 교체되어야한다. 저잡음과 분석 물의 농도의 작은 검출, 각 동물에 대한 새로운 센서의 사용이 제안된다.
몇 가지 단계가 성공적으로 실험 결과에 대한 중요하다. 센서는 매우 연약하고, 센서 팁을 손상을 방지하기 위해 신중하게 처리해야한다. 또한, 재수 화 후에, 센서는 20 초 동안 공기에 노출되지 않아야한다. 저소음 기록은 조직에서 생체 신호의 성공적인 검출을 위해 필요합니다. 그 목적을 위해, 고성능 랩 에어 테이블 및 적절한 전기적 접지가 필요하다. 분석 지속 시간의 정확한 양의 추가교정 단계를 보내고 것은 실험에서 정확한 농도 측정을위한 필요가있다. 생체 신장 수술에서 신장의 좋은 개간을 달성하는 것은 성공적인 녹음 발생합니다. 효소의 사용은 apyrase 및 교정에 카탈라아제 실험에서 비특이적 센서 감도의 평가를 허용하고 측정을 확인한다.
이러한 프로토콜은 크게 신장에서 세포 외 신호의 세부 사항을 강화 제공합니다. 센서에 의해 제공되는 향상된 감도와 시간 해상도는 우리가 질병 상태에서 신호 이전에 탐지했다 약리 조작을 다음과 ATP의 변화를 해결하기 위해 허용 할 수있다. 생체 것은 신장에 약물 응용 프로그램의 연구를위한 최적의 상태에서 생체 프로토콜은 복잡한 생리 학적 연구에 적합하다. 여기에 사용되는 생체 센서의 설계는 BL의 간섭에 대한 탁월한 내성을 가능하게조직을 짐 우드 - 관류. 종합적으로, 이러한 센서는 기존의 프로토콜 및 기술을 이전에 불가능했던 어플리케이션을 다량 제공.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
이 원고의 비디오 녹화 센서는 Sarissa 생명 한정판 (코번 트리, 영국)에 의해 제공되었다.
Acknowledgments
우리는 본 논문에 사용 된 센서를 개발에 자신의 작품에 대한 Sarissa의 생명을 주셔서 감사합니다. 이 연구는 국립 심장, 폐에 의해 지원되었다, 및 혈액 연구소는 HL108880 (A. Staruschenko)를 부여, HL 116,264 (A. 카 울리) 및 HL 122,662 (A. Staruschenko 및 A. 카 울리)의 의과 대학 재정 지원 사업 위스콘신 연구 업무위원회 # 9306830 (O. Palygin)과 건강한 위스콘신 연구 및 교육 프로그램 # 9520217를 전진, 국립 신장 재단의 젊은 연구자 그랜트 (O. Palygin).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sensor Kit | Sarissa Biomedical | SBK-ATP-05-125 | The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes. Also included with the kit is the user's choice of sensors. |
| Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-ATP-05-125 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissagold ATP Biosensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-ATP-10-50 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissaprobe null sensor 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-NUL-20-125 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissagold null sensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-NUL-10-50 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissaprobe ATP Manual | Sarissa Biomedical | http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf | |
| Faraday cage | TMC | ||
| Dual channel potentiostat | Digi-Ivy | DY2021 | Type II Faraday cage |
| Data acquisition program | Digi-Ivy | DY2000 | |
| Perfusion pump | Razel Scientific Instruments | Model R99E | |
| Fiber optic illuminator | Schott | ACE 1 | |
| micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| micromanipulator magnetic stand | Narishige | GJ-8 | |
| air table | TMC | 63-500 | |
| isoflurane ventilator | LEI Medical | M2000 | |
| 3 ml petri dish | Fisher Scientific | S3358OA | |
| needle | Santa Cruz | 26-30 G | |
| pins | Standard dissection pins | ||
| catheter | Polyethylene tubing (PE50) | ||
| catheter tissue glue | Vetbond | 1469SB | |
| suture | Look | SP117 | |
| rubber bands | any 2-4 mm wide rubber bands | ||
| silicone | Momentive | RTV-615 Clear 1# | |
| clamp | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| standard dissection kit | Kit should include scalpel and dissection sissors | ||
| Kidney Cup | Of own design | ||
| standard chemicals | Sigma-Aldrich | ||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | 100 mM ATP solution |
| hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A7646 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| isoflurane | Clipper | 10250 | |
| inactin | Sigma-Aldrich | T133 | |
| ketamine | Clipper | 2010012 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 |
References
- Palygin, O., Staruschenko, A. Detection of endogenous substances with enzymatic microelectrode biosensors in the kidney. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 305, 89-91 (2013).
- Clark, L. C., Lyons, C. Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery. Ann N Y Acad Sci. 102, 29-45 (1962).
- Haruyama, T. Micro- and nanobiotechnology for biosensing cellular responses. Adv Drug Deliv Rev. 55, 393-401 (2003).
- Huckstepp, R. T., et al. Connexin hemichannel-mediated CO2-dependent release of ATP in the medulla oblongata contributes to central respiratory chemosensitivity. J Physiol. 588, 3901-3920 (2010).
- Lopatar, J., Dale, N., Frenguelli, B. G. Minor contribution of ATP P2 receptors to electrically-evoked electrographic seizure activity in hippocampal slices: Evidence from purine biosensors and P2 receptor agonists and antagonists. Neuropharmacology. 61, 25-34 (2011).
- Avshalumov, M. V., Chen, B. T., Marshall, S. P., Pena, D. M., Rice, M. E. Glutamate-dependent inhibition of dopamine release in striatum is mediated by a new diffusible messenger, H2O2. J Neurosci. 23, 2744-2750 (2003).
- Frenguelli, B. G., Wigmore, G., Llaudet, E., Dale, N. Temporal and mechanistic dissociation of ATP and adenosine release during ischaemia in the mammalian hippocampus. J. Neurochem. 101, 1400-1413 (2007).
- Lalo, U., et al. Exocytosis of ATP from astrocytes modulates phasic and tonic inhibition in the neocortex. PLoS Biol. 12, e1001747 (2014).
- Heinrich, A., Ando, R. D., Turi, G., Rozsa, B., Sperlagh, B. K+ depolarization evokes ATP, adenosine and glutamate release from glia in rat hippocampus: a microelectrode biosensor study. Br.J Pharmacol. 167, 1003-1020 (2012).
- Dale, N. Purinergic signaling in hypothalamic tanycytes: potential roles in chemosensing. Semin Cell Dev Biol. 22, 237-244 (2011).
- Gourine, A. V., Llaudet, E., Dale, N., Spyer, K. M. Release of ATP in the ventral medulla during hypoxia in rats: role in hypoxic ventilatory response. J Neurosci. 25, 1211-1218 (2005).
- Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H2O2 release in freshly isolated kidneys. Am J Physiol Renal Physiol. , (2013).
- Thome-Duret, V., Gangnerau, M. N., Zhang, Y., Wilson, G. S., Reach, G. Modification of the sensitivity of glucose sensor implanted into subcutaneous tissue. Diabetes Metab. 22, 174-178 (1996).
- Wilson, G. S., Gifford, R. Biosensors for real-time in vivo measurements. Biosens. Bioelectron. 20, 2388-2403 (2005).
- Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-Channel Analysis of TRPC Channels in the Podocytes of Freshly Isolated Glomeruli. Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).
- Stockand, J. D., Vallon, V., Ortiz, P. In vivo and ex vivo analysis of tubule function. Compr Physiol. 2, 2495-2525 (2012).
- Turner, A. P. Biosensors: Fundamentals and applications - Historic book now open access. Biosens. Bioelectron. 65C, A1 (2014).
- Kauffmann, J. M., Guilbault, G. G. Enzyme electrode biosensors: theory and applications. Methods Biochem Anal. 36, 63-113 (1992).
- Barlett, P. N., Cooper, J. M. A review of the immobilization of enzymes in electropolymerized films. J Electroanal Chem. 362, 1-12 (1993).
- Kano, K., Morikage, K., Uno, B., Esaka, Y., Goto, M. Enzyme microelectrodes for choline and acetylcholine and their applications. Anal Chim Acta. 299, 69-74 (1994).
- Llaudet, E., Hatz, S., Droniou, M., Dale, N. Microelectrode biosensor for real-time measurement of ATP in biological tissue. Anal Chem. 77, 3267-3273 (2005).
- Llaudet, E., Botting, N. P., Crayston, J. A., Dale, N. A three-enzyme microelectrode sensor for detecting purine release from central nervous system. Biosens Bioelectron. 18, 43-52 (2003).
- Cosnier, S., Lepellec, A., Guidetti, B., Isabelle, R. -L. Enhancement of biosensor sensitivity in aqueous and organic solvents using a combination of poly(pyrrole-ammonium) and poly(pyrrole-lactobionamide) films as host matrices. J Electroanal Chem. 449, 165-171 (1998).
- Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329, 571-575 (2010).
- Kluess, H. A., Stone, A. J., Evanson, K. W. ATP overflow in skeletal muscle 1A arterioles. J. Physiol. 588, 3089-3100 (2010).
- Nishiyama, A., Jackson, K. E., Majid, D. S., Rahman, M., Navar, L. G. Renal interstitial fluid ATP responses to arterial pressure and tubuloglomerular feedback activation during calcium channel blockade. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290, H772-H777 (2006).
- Jin, C., et al. Effects of renal perfusion pressure on renal medullary hydrogen peroxide and nitric oxide production. Hypertension. 53, 1048-1053 (2009).
- Khan, A. S., Michael, A. C. Invasive consequences of using micro-electrodes and microdialysis probes in the brain. Trends Anal. Chem. 22, 503-508 (2003).
