Abstract
Ферментные биосенсоры микроэлектродные широко используются для измерения внеклеточных сигнальных в режиме реального времени. Большинство их использование было ограничено срезах мозга и культурах клеток нейронов. В последнее время эта технология была применена в целых органов. Достижения в конструкции датчика сделали возможным измерение клеточной сигнализации в крови-перфузии в естественных почек. Список Настоящие протоколы шаги, необходимые для измерения АТФ и H 2 O 2 сигнализации в интерстиции почек крыс. Два отдельных конструкций датчиков используются для экс виво и ин виво протоколов. Оба типа датчика покрыта тонким ферментативной бислоя на вершине селективной проницаемости слоя, чтобы дать малым временем отклика, чувствительный и селективные биосенсоры. Селективна проницаемость слой защищает сигнал от мешающих в биологической ткани, а также ферментативное слой использует последовательный каталитическую реакцию глицерина киназы и глицерол-3-фосФейт оксидазы в присутствии АТФ, чтобы произвести H 2 O 2. Набор датчиков, используемых для экс естественных условиях исследования дальше обнаружено анализируемого окислением H 2 O 2 на платиновом / иридий (Ir Pt-) провода электрода. Датчики для исследований в естественных условиях, а не на основе являются по сокращению H 2 O 2 на посредника покрытием золотого электрода, предназначенного для крови-перфузии тканей. Окончательные изменения концентрации обнаруживаются в реальном времени амперометрии последующим калибровки от известных концентраций анализируемого вещества. Кроме того, специфичность амперометрического сигнала может быть подтверждена путем добавления ферментов, таких как каталаза и апиразы которые расщепляют Н 2 О 2 и АТФ, соответственно. Эти датчики также в значительной степени полагаться на точных калибровок до и после каждого эксперимента. Следующие два протокола установления изучение режиме реального времени обнаружения АТФ и H 2О 2 в тканях почек, и может быть дополнительно модифицированы, чтобы расширить описанного способа для использования в других биологических препаратов или целых органов.
Introduction
Ферментативный микроэлектродные биосенсоры (также ссылается в качестве датчиков в настоящем рукописи) были ценным инструментом для изучения динамических процессов сигнализации в живых клеток и тканей. Датчики обеспечивают повышенную временную и пространственную разрешающую способность сигнальных молекул клеточных биологически значимых концентрациях. Вместо отбора проб и анализа внеклеточной жидкости, принимаемые с интервалами в течение длительных периодов времени, эти датчики реагируют так быстро, как их ферменты реагируют с анализируемым, тем самым производя измерения в реальном времени 1,2. Быстрое обнаружение интерстициальных концентраций аутокринных и паракринных факторов, как пуринов или перекиси водорода, и динамика их выпуска могут быть использованы для создания профиля для эффектов лекарственных средств в нормальных и патологических условиях 3. В настоящее время большинство приложений, использующих датчики были в мозговых срезах тканей и клеточных культур 4-10. Протоколы, описанные в этой рукописи цельюсоздавать средства для точного измерения в реальном времени концентрации анализируемых веществ в целых почек.
Следующие протоколы были разработаны для изучения интерстициальный АТФ и Н 2 О 2 сигнализации в почках. В родной среде почки, внеклеточный АТФ быстро катаболизируется эндогенными ectonucleotidases в его производных (АДФ, АМФ и аденозина). Датчики, используемые здесь, обладают высокой селективностью к АТФ по сравнению с другими пуринов или АТФ продуктов разложения 11. Это дает большое преимущество, так как позволяет точный мониторинг постоянных и динамических концентраций выпуска АТФ и ее функции сигнализации. Интерстициальный АТФ концентрация измеряется с использованием сочетания двух микроэлектродов, датчик АТФ и Null датчик. Нулевой датчик в сочетании с приложениями каталазы в состоянии обнаружить интерстициальный H 2 O 2 концентрации 12. Следующие протоколы используют два различных конструкций SensoRS, которые имеют характеристики оптимальных для экс либо естественных или в естественных условиях применения.
Обе конструкции на основе последовательного каталитической реакции глицерина киназы и глицерол-3-фосфат-оксидазы, содержащейся в датчик ферментативного слоя и приводится в присутствии АТФ. В наборе датчиков, используемых в Экс Vivo исследований, H 2 O 2, окончательный ферментативного продукта реакции, обнаружено окислением на платиновом / иридий (Ir Pt-) провода электрода. Датчики для исследований в естественных условиях, а не на основе являются на H 2 O 2 на снижение посредника покрытием золотого электрода, предназначенного для крови-перфузии тканей. Показанный на рисунке 1 представлена схема обоих протоколов, описанных в этой рукописи. Нулевой датчик идентичен соответствующей датчика АТФ за исключением того, не хватает связанные ферменты. Таким образом, в дополнение к обнаружению H 2 O 2 с ферментом каталаза, Нулевой MEA датчикаSures неспецифические помехи. Концентрации АТФ рассчитывается путем вычитания Нулевой обнаружены неспецифические помехи и фоновый H 2 O 2 по сигналу датчика АТФ. Несколько датчиков также коммерчески доступны для обнаружения других аналитов в том числе аденозина, ionosine, гипоксантин, ацетилхолина, холин, глутамат, глюкозы, лактата, D-серин для бывших естественных условиях применения или аденозина, ionosine и гипоксантин для в естественных условиях, когда в паре с соответствующим Null Датчик.
Способность датчика для точного обнаружения аналитов зависит от правильного до и после калибровки 13. Это гарантирует, что анализ учитывает дрейфа чувствительности датчика, которое происходит во время использования в биологических тканях. Датчик имеет депо глицерина, который используется в качестве реагента в датчике ферментативных реакций. Если датчик не используется в ванной растворов, содержащих глицерин, он смоет течением времени. Короче гecording пояс, то необходимо минимизировать дрейф датчика. Кроме того датчик загрязнения эндогенными протеазами и белковых фрагментов может значительно уменьшить чувствительность датчиков 14.
Настоящее рукопись устанавливает использование ферментных биосенсоров для микроэлектродов экс естественных условиях и в естественных условиях подготовки в почках. В режиме реального времени анализируемого количественного обеспечивает беспрецедентную деталь клеточной сигнализации, которые могут выявить новые для понимания механизмов заболеваний почек и фармакологических агентов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Следующие процедуры животных придерживались Руководство NIH по уходу и использованию лабораторных животных. До утверждения была получена из уходу и использованию комитета Институциональные животных (IACUC).
ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор инструкциями изготовителя датчика должно быть сделано во время проектирования эксперимента и до их использования. Следуя этим инструкциям будет производить оптимальные результаты при использовании датчиков.
1. Калибровка датчика
- Готовят свежие растворы перед началом эксперимента.
- Создание буфера А, содержащего 10 мМ буфера Näpi, 100 мМ NaCl, 1 мМ MgCl 2 и 2 мМ глицерина. Доводят рН до 7,4 с помощью NaOH. Хранить при температуре 2-8 ° С.
- Использование концентрации АТФ акций (100 мм) хранили при -20 ° С, создать новый 10 мМ АТФ калибровочный раствор добавлением 10 мкл запаса до 90 мкл буфера А.
- Увлажняет датчик АТФ путем размещения его наконечник (рисунок 2) в тон регидратации камеру, содержащую буфер А, по крайней мере 10 мин при температуре 2-8 ° С.
Примечание: После регидратации, датчики не должны подвергаться воздействию воздуха в течение более 20 секунд, или чувствительность датчика может быть уменьшено. Если длительные выдержки в воздухе, как ожидается, погрузить датчик кратко в растворе глицерина. Датчики могут быть использованы для различных экспериментов, но они должны произойти в тот же день в качестве датчика регидратации. Датчики могут быть сохранены в камере регидратации буфером А до 24 ч. - Включите двойной потенциостата канала (рис 3) и начать системную запись программного обеспечения.
- Подготовка калибровочной камеры с 3 мл буфера А. Место электрода сравнения в калибровочной камеры. Возьмите каждый датчик от регидратации камеры, затем приложите его к манипулятору и вставьте его в калибровке камеры решения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стандартный силиконовым покрытием Петри в калибровочной камеры. Выполняйте все калибровки и улudies в клетке Фарадея на высокопроизводительной лабораторном столе воздуха для снижения шума сигнала во время записи амперометрии (рисунок 4). Калибровка лучше сделать как можно ближе к началу сбора данных, как это возможно. Для применения в естественных условиях оптимальное время для калибровки в течение периода восстановления животных после операции. - Экс естественных калибровки
- Выполнение циклической вольтамперометрии в калибровочной камеры на велосипеде датчиков от -500 мВ до +500 мВ при скорости 100 мВ / с в течение 10 циклов. Это значительно повышает чувствительность датчиков. На рисунке 5 следов, наблюдаемых от 10 циклов.
- Поляризовать сенсоры +600 мВ после последнего цикла. Датчик тока будет распадаться на асимптоты. Устойчивый чтение достигается после минимум 5 мин. Запишите нулевой чтение.
- В естественных условиях калибровки датчика
- Не выполняйте циклической вольтамперометрии на естественных Senso вRS. Вместо этого, поляризовать датчик в калибровочной камеры в течение 30 сек до +500 мВ. Затем установите потенциостата 0 мВ и дайте датчик тока подняться на асимптоты. Датчик тока займет по меньшей мере 2 мин, чтобы асимптоты. Запишите нулевой чтение.
- Последовательно добавьте комплект количество раствора АТФ в камеру для получения калибровочной линии, охватывающей желаемый диапазон обнаружения. Раствор АТФ производит острый пик в сигнале датчика первоначально, после чего распада как АТФ, диффундирует равномерно по всей камере. Значения сигналов Запись только уровень сигнала стабилизировалась после каждого АТФ того. 6А и 7 показывают следы и предложил концентрации АТФ для обоих экс естественных условиях и в естественных условиях исследования, соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы подтвердить селективность электродов с помощью мусорщиков из веществ. Настоящее протокол, используемый апираза для проверки специфичности датчика АТФ и каталазы для H <суб> 2 О 2 сигнала (рис 6В). Если препараты для введения, измерения их реакционной датчиками должно быть определено до начала исследования. - Добавить 3 мкл апиразы из запаса 2 мг / мл (89 ООН / мг), чтобы проверить специфичность датчика АТФ (ток, произведенный путем применения АТФ должны свести к нулевому уровню (рисунок 7).
- Добавить 3 мкл каталазы из запаса 2 мг / мл (100 ООН / мг), чтобы проверить специфику нулевой датчика (ток, создаваемый H 2 O 2 приложение должно свести к нулевой чтения).
2. Животное хирургии для датчика исследований
- Хирургия для экс естественных условиях
- Обезболить экспериментального животного изофлураном (5% индукции, от 1,5 до 2,5% техническое обслуживание) / медицинского класса O 2 или другого утвержденного метода. 15 '12 Животные должны быть под постоянным контролем, чтобы обеспечить адекватный уровень анестезии. Улицасостоянии дыхательной скорость реакции и ног щепотку используются для подтверждения надлежащего анестезии.
Примечание: Эвтаназии животное в соответствии с утвержденными протоколами IACUC. По завершении всех процедур, не выживания эвтаназии глубоко анестезировали животных торакотомии вызывая пневмоторакс, чтобы обеспечить гуманное кончину животного 12. - Поместите крысу на контролируемой температурой операционном столе в положении лежа на спине. Сохраняя правильную глубину анестезирующего, сделать срединный разрез приблизительно 5 см в соответствии с левой почки и выставить дистального брюшной аорты.
- Оберните лигатуры вокруг целиакией и брыжеечных артерий превосходными, и брюшной аорты выше этих артерий, но не перевязывать. Обертка два лигатуры вокруг брюшной аорты ниже почечных артерий.
- Зажмите брюшной аорты выше лигатуры. Свяжите нижнюю лигатуры. Катетер брюшной аорты с полиэтиленовой трубкой (PE50). Закрепите катетер со второй аорты лигатуры,
- Снимите зажим и перевязывать брыжейки и целиакией артерии. Заливать почку на 6 мл / мин с Hanks Balanced Salt Solution при комнатной температуре в течение 2-3 мин, пока почки не полностью побледнел.
- Акцизный почку и катетер, соединенный часть аорты. Поместите почку в 3 мл чашке Петри заполнены раствором ванны.
Примечание: Протокол эксперимента могут быть выполнены при комнатной температуре. Решение ванна содержит в мм: 145 NaCl, 4,5 KCl, MgCl 2 2, 1 CaCl 2, 10 HEPES, рН 7,35 регулируется NaOH.
- Обезболить экспериментального животного изофлураном (5% индукции, от 1,5 до 2,5% техническое обслуживание) / медицинского класса O 2 или другого утвержденного метода. 15 '12 Животные должны быть под постоянным контролем, чтобы обеспечить адекватный уровень анестезии. Улицасостоянии дыхательной скорость реакции и ног щепотку используются для подтверждения надлежащего анестезии.
- Хирургия для в естественных условиях
- Обезболить крысу, используя утвержденные протоколы IACUC. Для анализа в естественных анестезию крыс с кетамином (20 мг / кг внутримышечно) и Инактин (50 мг / кг внутрибрюшинно). Животные должны быть под постоянным контролем, чтобы обеспечить адекватный уровень анестезии. Стабильная скорость реакции дыхательной и ног щепотку используются для подтверждения надлежащего анестезии.
- После надлежащего глубина анестезии получитьред поместите крысу в лежачем положении на регулируемой температурой заземленной поверхности, расположенной на столе воздуха. Поверхность должна быть предварительно нагревали и поддерживали при 36 ° С.
- В то время как поддержание надлежащего глубину анестезирующего, сделать срединный разрез приблизительно 5 см в соответствии с почками.
- Используйте шов, чтобы отвлечь и якорь кожный и подкожные ткани, так что весь почки видна. Поместите почку в чашке почек, чтобы минимизировать любые артефакты движения.
- Использование внутривенной инфузии 2% BSA: 0,9% NaCl в 1 мл / 100 г / ч через яремную вену для поддержания объема крови. Иглу как мочеточники для сбора мочи. Место галстуки вокруг верхней брыжеечной артерии и целиакией и дистальной аорты для манипуляции почек давления перфузии (рис. 10А)
- Если применение фармакологических агентов требуется в ходе экспериментов в естественных условиях, вставка из интерстициального катетера рекомендуется (цифры 10B
Настройка 3. Сбор данных
- Откройте программу сбора данных и установить его полярность для обоих экс естественных условиях и в естественных экспериментов в анодной Позитивный. Установите программу для сохранения данных в качестве кода ASCII.
- Расположите микроманипуляторами для быстрой вставки из датчиков в почки.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, используйте фиктивный зонд, прикрепленный к микроманипулятора, чтобы помочь достичь желаемого размещение датчиков. - Экс естественных сбора данных
- Заливать почку раствором ванны (с 2.1.6) через канюлированную аорты с постоянной скоростью 650 мкл / мин. Использование хирургические ножницы, аккуратно снимите капсулу почки, которая необходима для установки сенсора.
- Безопасный почку с резинками, привязанными за почки и подключенных к силиконовым покрытием блюдо с булавками.
- Поместите электрод близко к почке в чашке Петри с его кончик погружен вбуферный раствор.
- В естественных условиях приобретения данных
- Поместите почку в чашке почек. В зависимости от штамма и возраста животного использовать размер чашки, который содержит почки слабо. Рисунок 8 показывает два размера чашки почек. Похожие чашки используются для различных физиологических подходов, ориентированных на анализ функции почек, таких как micropuncture т.д. 16.
Примечание: Положение чашку почек имеет решающее значение для удаления механических шумов, производимых животных дыхания, но не должен мешать или блокировать перфузии почек или поток мочи. - Разрешить 45 мин времени восстановления перед выполнением сбора данных.
- С помощью иглы 26-30G, сделать отверстие прокола в нужном месте и глубине датчика в почках. Промокните поверхность отверстие для удаления выделяющихся кровь. Добавить растворе глицерина на поверхности почки. Это позволит предотвратить поверхность почки от высыхания во время эксперимента. Удалить первый датчик от регидратации камеры и прикрепить ее к микроманипулятора. Быстро, в течение 20 сек, вставить электрод в только что созданном отверстие в почках. Повторите шаги 3,5-3,9 для нулевого датчика.
- Вставьте электрод в почках, около 1 см от от датчиков.
- Поместите почку в чашке почек. В зависимости от штамма и возраста животного использовать размер чашки, который содержит почки слабо. Рисунок 8 показывает два размера чашки почек. Похожие чашки используются для различных физиологических подходов, ориентированных на анализ функции почек, таких как micropuncture т.д. 16.
- Включите потенциостата и активировать программу записи на компьютере. Рисунок 9 показывает конечный настройку экс естественных условиях приобретения данных почек. Рисунок 10 показывает конечный настройку в естественных условиях приобретения данных с почечной вставленной катетера.
Анализ данных 4.
- Импорт файла данных ASCII в происхождения или любого другого аналогичного программного обеспечения.
- Концентрация тока отношение
- Используйте линейную функцию подходят / экстраполировать построить линейную концентрацию (ось х) для тока (ось Y) отношения в АТФ или H 2 O 2 точки (6 и 7).
линейная подгонка линия: у = х + Ь
- Используйте линейную функцию подходят / экстраполировать построить линейную концентрацию (ось х) для тока (ось Y) отношения в АТФ или H 2 O 2 точки (6 и 7).
- Приравнять ток концентрации
- Вычитание измеренных следы датчика нулевой от датчика АТФ, чтобы получить фактический ток, создаваемый внутриклеточного АТФ.
- Преобразование значения АТФ в Па полученные амперометрии в нМ при помощи уравнения калибровки, описанную в 4.2.1. Определить концентрацию вычитается следа данных датчика АТФ путем импорта каждого доводитс тока в значение "х" и решения для у (концентрации анализируемого вещества).
- Аналогичным образом, вычислить H 2 O 2 концентрации от ее уравнение калибровки, если это необходимо.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Дизайн ферментативной микроэлектродов биосенсора позволяет обнаруживать в реальном времени анализируемых веществ в целых почек. Общий дизайн эксперимент либо экс естественных условиях или в естественных условиях исследования показано на рис 1 .the датчиков, используемых и хирургические процедуры различаются в зависимости от того, в исследовании является экс естественных условиях или в естественных условиях.
Для получения воспроизводимых результатов, точный до и после калибровки имеют решающее значение. 6А показана репрезентативная след сигнала видно из экс естественных датчика АТФ во время калибровки. Обратите внимание, что апираза быстро устранены сигнал ATP. Каталазы не имели никакого эффекта на сигнал АТФ и демонстрирует свою специфику в H 2 O 2 он создает (рис 6В). Процедура калибровки производит линейную аппроксимацию, которая используется для вычисления динамических изменений АТФ (фиг.6А, правая панель). В VIКалибровка датчика во- производит аналогичную след, что и экс естественных датчика. Тем не менее, этот датчик обнаруживает восстановительное вместо окислительных потоков и, таким образом ток, создаваемый отрицательно. Калибровка этих датчиков также производит линейную аппроксимацию в диапазоне от 0,3 до 80 мкм (7А правая панель). Специфика датчика в естественных условиях с СПС по сравнению с другими продуктами пуриновых показано на рисунке 7B.
Описанный здесь подход позволяет измерять как базальные уровни эндогенных веществ и острых изменений в ответ на вливание наркотиков 12. Показанный на рисунке 11 в Анг II-индуцированной изменения интерстициальной эндогенного концентрации Н 2 О 2 в солёнолюбивых и чувствительные к соли крыс. В этих экспериментах, свежевыделенные почки от Sprague Dawley (SD) или Dahl чувствительные к соли (SS) крысам вливают 1 мкМ Ang II под постоянным ламинарным потоком (650 мкл / мин). Как шоWn на рисунке 11, АТ II вызывает острую выпуск Н 2 О 2 в почках из обоих SD и SS крыс. Тем не менее, максимальная амплитуда каждого ответ был значительно повышен в СС крыс, особенно когда животных кормили с высоким содержанием соли 12. Показанный на рисунке 12 является представителем применение биосенсоров в естественных условиях. Настой каталазы (5 мкг / мл) полностью блокирует Н 2 О 2 сигнала при биосенсора. Эти эксперименты иллюстрируют использование специфических ферментативных биосенсоров в сочетании с амперометрического метода для обнаружения базальных уровней эндогенных веществ и измерений в реальном времени их выпуска в ответ на фармакологического вмешательства. Дальнейшие применения этого подхода для изучения роли пуринергической сигнализации и перекиси водорода будет улучшить наше знание и понимание почечных патологий, таких как чувствительные к соли гипертонии, почечной быкidative стресс и хроническая болезнь почек.
Рисунок 1. Схема протоколов. Калибровка с анализируемого вещества и тестирования его специфику делается непосредственно перед началом экспериментов. Протокол в естественных условиях должны соблюдаться для сложных физиологических экспериментов и экс естественных условиях для фармакологических приложений. Калибровка сообщение эксперимент должно быть сделано и принято во внимание при анализе данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Ферментативный Микроэлектродные Датчик. Дваразмеры датчика, используемого для бывших естественных условиях применения приведены, 50 мкм и 125 мкм диаметров. Каждый провод датчика проходит в капиллярной трубке для подключения к разъему золота конечного (не показан). Врезка показывает наконечник датчика, покрытую ферментов для обнаружения АТФ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Двухканальный Потенциостат. Потенциостата каналы помечены CH1 и CH2. 1) CH1 соединение датчика АТФ и 2) CH 2 нулевая датчик Подключение 3) соединения, которые электрически соединены с опорным электродом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
задницу = "jove_content" FO: Keep-together.within-странице = "всегда"> 
Рисунок 4. Установка датчика. Сбор данных выполняется в клетки Фарадея, чтобы уменьшить электрический шум и на лабораторном столе высокоэффективной для безвибрационного рабочей поверхности. 1) с регулируемой температурой хирургическое таблица используется для поддержания температуры тела животного в течение физиологических опытов 2) микроманипуляторами прикреплены к магнитной установки переходников для гибкого позиционирования датчиков в ходе эксперимента 3) источник света, необходимого для хирургических процедур и вставки датчика 4 ) двойного потенциостат 5 канал) Держатель для датчиков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
p_upload / 53059 / 53059fig5.jpg "/>
Рисунок 5. Циклической вольтамперометрии. Для бывших естественных исследований, датчик циклической вольтамперометрии проводится в течение 10 циклов между -0.5 и 0.5 V до протокола калибровки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6. Амперометрия Калибровка Ex Vivo. (А) Калибровка использует добавление известных концентраций АТФ к решению ванны. Корреспондент амперометрические значения, записанные на уровне асимптотой (черный след). Токи, полученные создать уравнение калибровки. Пример показан на правой панели. Красный след является Налинт Нулевой датчик, который реагирует только добавление H 2 O 2. (B) Нулевой датчик калибруется с добавлением известной H 2 O 2 концентрации (красные стрелки) к решению ванны и асимптот амперометрические значения записанных (тонкие черные стрелки). Добавление каталазы в раствор ванны (густой черный стрелка) приводит к быстрому распаду тока. На правой панели показывает Null уравнение калибровки датчика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7. Амперометрия Калибровка;. In Vivo Калибровка в естественных электродов выполняется аналогично тому, что подробно описано в бывших естественных условиях исследования, кроме восстановительных реакций вызвать обратный ток (полярность). (A) добавление известных концентраций АТФ производит амперометрический ток на датчик АТФ (черный след), но не имеет никакого влияния на Null датчика (красный след). Добавление апиразы гасит ток датчика АТФ. (В) Специфичность датчика АТФ подтверждается добавлением 10 мкМ различных пуринергическими агентов (UTP, UDP и аденозина). Дальнейшие применения АТФ обеспечить стабильную детектируемого амперометрического тока. (С) Микрофотография датчиков в естественных, основанных на посредника покрытием золотого электрода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное FIGUчисло рейнольдса
Рисунок 8. Почки Кубки. В исследованиях в естественных условиях, почек проводятся до сих пор используют чашки стали в почках нержавеющей показано на рисунке. Два размеры чашки используются для размещения изменение размера почки. Эти чашки уменьшить артефакты движения, которые генерируются при дыхании животного. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
9. Пример Vivo выделен и перфузировались почек. Выделенную почку помещают в чашку 1) Петри, покрытых толстым сиlicone дно для вставки контакт 2) почечной артерии канюлю и прикреплен к шприцевой насос для постоянной перфузии в ходе эксперимента 3) датчика АТФ, 4) и нуль датчика вставлены в почках 5) электрод расположен вблизи почек погруженной в раствор ванны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
10. В естественных крови перфузировались почек. (А) Левая почка подвергается и помещают в чашку почек, правую почку остается неповрежденной внутри животного. Оба датчика вставлены в почках. БСА: NaCl придают с помощью катетеризации яремной вены, чтобы противодействовать потеря жидкости вызвано бу большой средней линии разрез (Б) Пример эксперимента в естественных условиях с имплантированным интерстициальной катетера для прямых фармакологических приложений 1) почка, проводимых чашки почек 2) датчик АТФ 3) Null датчика и 4) электрода вставляются в вентральной поверхности почки 5) катетера, имплантированного в почках и прикрепленной к перистальтического насоса для ламинарных фармакологических вливаний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 11. Пример Vivo Анализ H 2 суб> О 2 в почках. Анг II перфузии приводит H 2 O 2 релиз в коре головного мозга крыс почек. (А) Реальные изменения временные среднего H 2 O 2 концентрация (серые столбики показывают стандартную ошибку) в общей сложности N = 8 приложений (4 из 4 почки разных крыс). Бары в верхней представляют приложение Анг II. (B) максимальная H 2 O 2 значения амплитуды во время концентрация Ang II перфузии Sprague Dawley (SD) и Даль чувствительные к соли (ПС) крыс, получавших низкие и высокие диеты соль, соответственно. * - Р <0,05 по сравнению с SD крыс. На рисунке взято из ссылки 12 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
/files/ftp_upload/53059/53059fig12.jpg "/>
Рисунок 12. В Vivo анализа H 2 O 2. Пример оценки в естественных условиях интерстициального H концентрация 2 О 2 в мозговом веществе в СС крысы подается с низким содержанием соли диета (как показано на рисунке 10b). Интерстициальная применение каталазы с помощью имплантированного катетера в течение интервала 5 мин производится полная блокада Н 2 О 2 сигнала в почечной мозга. Сокращение каталазы, от размыва почечного кровотока, в результате частичному восстановлению сигнала, который снова был заблокирован с помощью дополнительного приложения каталазы (10 мин). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Настоящие протоколы были разработаны для обеспечения повышенной временное и пространственное разрешение АТФ и Н 2 О 2 сигнализации для экс естественных изолированных, перфузии и в естественных условиях кровь перфузии почек. Различия между протоколами и датчиков, используемых здесь обеспечивают оптимальную сбора данных либо для фармакологических агентов или физиологических исследований. Протоколы состоят из 1) калибровки датчика, 2) хирургическая процедура, 3) Настройка сбора данных, и 4) анализа данных. Они позволяют в режиме реального времени измерения аналитов для многочисленных экспериментальных условиях. Это приведет к более глубокому пониманию заболеваний почек и развития более эффективных фармакологических методов лечения. Здесь мы использовали датчики для анализа АТФ и H 2 O 2. Тем не менее, датчики для других веществ, также доступны и могут быть использованы. Протоколы, описанные здесь, были применены для изучения АТФ и H 2 O 2 в почках крыс, но то же самое метоd может быть легко отрегулирована для применения в мышах. Таким образом, этот подход имеет большой потенциал, учитывая обилие генетических моделей грызунов.
Базовая конструкция ферментативных микроэлектродов биосенсоров была разработана в 1960-х годах Кларк и Лионе 2. После первоначального развития биосенсоров, успехи были достигнуты в области проектирования и применения 17-19 20. Llaudet др. 21,22 разработал принцип конструкции СПС датчиков, используемых в настоящих протоколов при использовании методов из Cosneir соавт. 23 для фермента покрытием. Эти датчики обнаруженной сигнализации АТФ в ряде физиологических процессов, включая АТФ из астроцитов головного мозга 8, регулирование дыхания 4,24 и скелетных мышц артериол регулирования 25. Недавно экс естественных условиях протокол был использован для измерения сигналов АТФ в почках 12. Цель этого рукопись,с, обеспечивая эффективные направления и идеи для обнаружения эндогенных веществ, таких как АТФ в почках.
Ферментные биосенсоры микроэлектродные имеют много преимуществ по сравнению с существующими средствами измерения аналитов в естественных условиях. Тем не менее, особое внимание должно быть использован для этого подхода, что и для любого другого нового способа. Проверка с установленным подход обеспечивает уверенность в полученных данных. Например, были сделаны измерения микродиализ, как описано ранее 26,27. Никаких существенных различий не наблюдалось между пиковых концентраций определенных датчиков и результатами, полученными из образцов диализных 12. Ограничение микродиализа является то, что измеряет только стационарные уровни вещества. Таким образом, оценка динамических изменений в клеточной сигнализации может быть достигнуто только с использованием ферментативных микроэлектродов биосенсоров. Мануфактура характеристики времени реакции датчика отличаются между датчикомТипы. исключая виво датчики имеют время отклика 5-10 сек и в естественных датчиков 30-35 сек для подъема сигнала от 10 до 90%. Калибровочные следы (6 и 7) показывают, временное разрешение анализируемого добавления / удаления. Для обоих датчиком и микродиализные подходов, использование специфических ферментов, чтобы блокировать сигнал, создаваемый аналитов требуется обеспечить специфичность.
Описанные протоколы имеют несколько проблем. Как и с любым установки сенсора в ткани, повреждения тканей имеет место. Это может активировать сигнальные пути, которые могут повлиять на измерения 28. Чтобы свести к минимуму повреждение клеток, тонкие датчики будут необходимы. Тем не менее, трудно проникнуть в почечную капсулу с датчиками, так иглы используются, чтобы сделать небольшое отверстие входа. Тонкие датчики, более вероятно, чтобы согнуть и нарушить их покрытие на вставке. Датчики большего диаметра более устойчивы на изгиб и resultaNT повреждение их покрытия. Рисунок 3 показывает тонких и толстых датчик. В дополнение к сопротивлению толстом датчика к изгибу, что они содержат более толстый слой покрытия, обеспечивая повышенную защиту для ферментативного слоя. Беспокойство повреждения тканей, вызванные использованием толстых датчиков значительно меньше, чем в почках это было бы в ткани головного мозга. Глубина вставки приблизить окончательное размещение и должна быть проверена после измерения на почки будут завершены. Оценка между коркового и мозгового слоев, используя длину наконечника датчика в качестве руководства для вставки и достаточно, как наконечник датчика составляет 0,5 мм, а кора почек толщиной 2-3 мм. Засорение датчика также происходит с большей скоростью в крови, тем самым ограничивая использование датчика в пор в естественных условиях, чтобы протоколов одном эксперименте. Время записи от 1 до 1 ½ ч привело лишь небольшой дрейф датчика. Основными критериями при оценке снижение производительности датчика является низкая чувствительностьаналита в процессе калибровки. Увеличение электрического шума и нестабильность базовой тока может также указывать, что наконечник датчика поврежден. Для точного измерения АТФ, оба датчика (АТФ и NULL) должны иметь одинаковые шум и стабильность характеристик для дальнейшего вычитания сигнала. В противном случае, один из датчиков должен быть заменен. Для низким уровнем шума и обнаружения малых концентраций аналита, использование новых датчиков для каждого животного предложил.
Несколько шагов имеют решающее значение для успешных экспериментальных результатов. Датчики являются очень хрупкими и должны быть обработаны тщательно, чтобы избежать повреждения кончика датчика. Кроме того, после регидратации, датчики не должны быть на воздухе в течение более 20 секунд. Низкие записи шума требуются для успешного обнаружения биологических сигналов в тканях. Для этой цели, высокопроизводительный настольный лабораторный воздух и правильное электрическое заземление не требуется. Добавление точных количеств аналита мажорING шаги калибровки необходимо для точного определения концентрации в экспериментах. Достижение хорошего очистку почки в бывших естественных операций в почках может привести к успешных записей. Использование ферментов и каталазы апираза в калибровок и в экспериментах позволяет для оценки датчика неспецифической чувствительности и подтверждает результаты измерений.
Эти протоколы обеспечивают значительно повышена детализация внеклеточного сигнализации в почках. Улучшенная чувствительность и временное разрешение предоставлено датчиками может позволить нам решить изменения в АТФ сигнализации в болезненных состояний и следующие фармакологической манипуляции, которые были ранее обнаружить. Протокол в естественных условиях хорошо подходит для сложных физиологических исследований, а экс естественных условиях является оптимальным для изучения фармакологических приложений на почки. Конструкция датчика в естественных условиях, используемой здесь позволяет беспрецедентный сопротивление вмешательства в блООД-перфузии ткани. Взятые вместе, эти датчики предлагают большое количество приложений, которые ранее не были возможны с существующими протоколами и методами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Датчики для записи видео этой рукописи были предоставлены Sarissa биомедицинской Limited (Ковентри, Великобритания).
Acknowledgments
Мы ценим Sarissa Biomedical для их работы в разработке датчиков, используемых в настоящем рукописи. Это исследование было поддержано Национальным сердца, легких и крови институт предоставляет HL108880 (А. Staruschenko), HL 116264 (А. Коули) и HL 122662 (А. А. Staruschenko и Коули), проект финансируется в Медицинском колледже Комитет ГУ МВД Висконсин # 9306830 (О. Palygin) и Продвижение программу исследований и образования здоровой Висконсин # 9520217, и молодых исследователей Грант Национального фонда почек (О. Palygin).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sensor Kit | Sarissa Biomedical | SBK-ATP-05-125 | The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes. Also included with the kit is the user's choice of sensors. |
| Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-ATP-05-125 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissagold ATP Biosensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-ATP-10-50 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissaprobe null sensor 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-NUL-20-125 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissagold null sensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-NUL-10-50 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissaprobe ATP Manual | Sarissa Biomedical | http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf | |
| Faraday cage | TMC | ||
| Dual channel potentiostat | Digi-Ivy | DY2021 | Type II Faraday cage |
| Data acquisition program | Digi-Ivy | DY2000 | |
| Perfusion pump | Razel Scientific Instruments | Model R99E | |
| Fiber optic illuminator | Schott | ACE 1 | |
| micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| micromanipulator magnetic stand | Narishige | GJ-8 | |
| air table | TMC | 63-500 | |
| isoflurane ventilator | LEI Medical | M2000 | |
| 3 ml petri dish | Fisher Scientific | S3358OA | |
| needle | Santa Cruz | 26-30 G | |
| pins | Standard dissection pins | ||
| catheter | Polyethylene tubing (PE50) | ||
| catheter tissue glue | Vetbond | 1469SB | |
| suture | Look | SP117 | |
| rubber bands | any 2-4 mm wide rubber bands | ||
| silicone | Momentive | RTV-615 Clear 1# | |
| clamp | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| standard dissection kit | Kit should include scalpel and dissection sissors | ||
| Kidney Cup | Of own design | ||
| standard chemicals | Sigma-Aldrich | ||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | 100 mM ATP solution |
| hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A7646 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| isoflurane | Clipper | 10250 | |
| inactin | Sigma-Aldrich | T133 | |
| ketamine | Clipper | 2010012 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 |
References
- Palygin, O., Staruschenko, A. Detection of endogenous substances with enzymatic microelectrode biosensors in the kidney. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 305, 89-91 (2013).
- Clark, L. C., Lyons, C. Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery. Ann N Y Acad Sci. 102, 29-45 (1962).
- Haruyama, T. Micro- and nanobiotechnology for biosensing cellular responses. Adv Drug Deliv Rev. 55, 393-401 (2003).
- Huckstepp, R. T., et al. Connexin hemichannel-mediated CO2-dependent release of ATP in the medulla oblongata contributes to central respiratory chemosensitivity. J Physiol. 588, 3901-3920 (2010).
- Lopatar, J., Dale, N., Frenguelli, B. G. Minor contribution of ATP P2 receptors to electrically-evoked electrographic seizure activity in hippocampal slices: Evidence from purine biosensors and P2 receptor agonists and antagonists. Neuropharmacology. 61, 25-34 (2011).
- Avshalumov, M. V., Chen, B. T., Marshall, S. P., Pena, D. M., Rice, M. E. Glutamate-dependent inhibition of dopamine release in striatum is mediated by a new diffusible messenger, H2O2. J Neurosci. 23, 2744-2750 (2003).
- Frenguelli, B. G., Wigmore, G., Llaudet, E., Dale, N. Temporal and mechanistic dissociation of ATP and adenosine release during ischaemia in the mammalian hippocampus. J. Neurochem. 101, 1400-1413 (2007).
- Lalo, U., et al. Exocytosis of ATP from astrocytes modulates phasic and tonic inhibition in the neocortex. PLoS Biol. 12, e1001747 (2014).
- Heinrich, A., Ando, R. D., Turi, G., Rozsa, B., Sperlagh, B. K+ depolarization evokes ATP, adenosine and glutamate release from glia in rat hippocampus: a microelectrode biosensor study. Br.J Pharmacol. 167, 1003-1020 (2012).
- Dale, N. Purinergic signaling in hypothalamic tanycytes: potential roles in chemosensing. Semin Cell Dev Biol. 22, 237-244 (2011).
- Gourine, A. V., Llaudet, E., Dale, N., Spyer, K. M. Release of ATP in the ventral medulla during hypoxia in rats: role in hypoxic ventilatory response. J Neurosci. 25, 1211-1218 (2005).
- Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H2O2 release in freshly isolated kidneys. Am J Physiol Renal Physiol. , (2013).
- Thome-Duret, V., Gangnerau, M. N., Zhang, Y., Wilson, G. S., Reach, G. Modification of the sensitivity of glucose sensor implanted into subcutaneous tissue. Diabetes Metab. 22, 174-178 (1996).
- Wilson, G. S., Gifford, R. Biosensors for real-time in vivo measurements. Biosens. Bioelectron. 20, 2388-2403 (2005).
- Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-Channel Analysis of TRPC Channels in the Podocytes of Freshly Isolated Glomeruli. Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).
- Stockand, J. D., Vallon, V., Ortiz, P. In vivo and ex vivo analysis of tubule function. Compr Physiol. 2, 2495-2525 (2012).
- Turner, A. P. Biosensors: Fundamentals and applications - Historic book now open access. Biosens. Bioelectron. 65C, A1 (2014).
- Kauffmann, J. M., Guilbault, G. G. Enzyme electrode biosensors: theory and applications. Methods Biochem Anal. 36, 63-113 (1992).
- Barlett, P. N., Cooper, J. M. A review of the immobilization of enzymes in electropolymerized films. J Electroanal Chem. 362, 1-12 (1993).
- Kano, K., Morikage, K., Uno, B., Esaka, Y., Goto, M. Enzyme microelectrodes for choline and acetylcholine and their applications. Anal Chim Acta. 299, 69-74 (1994).
- Llaudet, E., Hatz, S., Droniou, M., Dale, N. Microelectrode biosensor for real-time measurement of ATP in biological tissue. Anal Chem. 77, 3267-3273 (2005).
- Llaudet, E., Botting, N. P., Crayston, J. A., Dale, N. A three-enzyme microelectrode sensor for detecting purine release from central nervous system. Biosens Bioelectron. 18, 43-52 (2003).
- Cosnier, S., Lepellec, A., Guidetti, B., Isabelle, R. -L. Enhancement of biosensor sensitivity in aqueous and organic solvents using a combination of poly(pyrrole-ammonium) and poly(pyrrole-lactobionamide) films as host matrices. J Electroanal Chem. 449, 165-171 (1998).
- Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329, 571-575 (2010).
- Kluess, H. A., Stone, A. J., Evanson, K. W. ATP overflow in skeletal muscle 1A arterioles. J. Physiol. 588, 3089-3100 (2010).
- Nishiyama, A., Jackson, K. E., Majid, D. S., Rahman, M., Navar, L. G. Renal interstitial fluid ATP responses to arterial pressure and tubuloglomerular feedback activation during calcium channel blockade. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290, H772-H777 (2006).
- Jin, C., et al. Effects of renal perfusion pressure on renal medullary hydrogen peroxide and nitric oxide production. Hypertension. 53, 1048-1053 (2009).
- Khan, A. S., Michael, A. C. Invasive consequences of using micro-electrodes and microdialysis probes in the brain. Trends Anal. Chem. 22, 503-508 (2003).
