Abstract
Enzimatik mikroelektrot biyosensörler yaygın gerçek zamanlı olarak hücre dışı sinyal ölçmek için kullanılmıştır. Bunların kullanımı çoğu Beyin dilimleri ve nöronal hücre kültürleri ile sınırlı olmuştur. Son zamanlarda, bu teknoloji, bütün organlara uygulanmıştır. Sensör tasarımı gelişmeler kan ile perfüze vivo böbreklerde hücre sinyallemesinin ölçüm mümkün kılmıştır. Mevcut protokoller sıçan böbrek interstisyumda ATP ve H 2 O 2 sinyalizasyon ölçmek için gereken adımları listeler. İki ayrı bir sensör tasarımları ex vivo ve in vivo protokoller kullanılır. Sensörün Her iki tür de hızlı bir yanıt, duyarlı ve seçici biyosensörler vermek üzere bir seçici geçirgenliğe tabakanın üzerine ince bir enzimatik biolayer ile kaplanır. Seçici geçirgenliğe tabakası biyolojik dokuda interferents sinyal korur ve enzimatik tabakanın gliserol kinaz ve gliserol-3-Phos sıralı katalitik reaksiyon kullanırATP varlığında phate oksidaz H2O 2 üretmek. Ex vivo çalışmalar için kullanılan sensörler grubu ayrıca bir platin / iridyum (Pt-Ir) telidir ilgili H2O 2 oksidasyonu ile analiti tespit edildi. In vivo çalışmalar için sensörler yerine, kan ile perfüze doku için tasarlanmış bir mediatör kaplı altın elektrot üzerinde H2O 2 indirgenmesi dayanmaktadır. Nihai konsantrasyon değişiklikleri analit bilinen konsantrasyonlarına kalibrasyon ardından gerçek zamanlı amperometri ile tespit edilir. Buna ek olarak, amperometrik sinyalin spesifıkliği O 2 ve ATP buna H2 parçalayan örneğin katalaz gibi enzimler ve apiraz ilavesiyle kontrol edilebilir. Bu sensörler ayrıca önce ve her bir deney sonrasında doğru kalibrasyon temeline dayanmaktadır. Aşağıdaki iki protokol ATP ve H2 Gerçek zamanlı saptama çalışma oluşturulmasıBöbrek dokularında O 2, ve daha fazla başka biyolojik karışımların veya bütün organlarda kullanım için tarif edilen yöntem genişletmek için değiştirilebilir.
Introduction
(Aynı zamanda mevcut el yazması sensörleri olarak başvurulan) Enzimatik mikroelektrot biyosensör hücre ve dokuları, canlı, dinamik sinyal süreçleri incelemek için değerli bir araç olmuştur. Sensörler biyolojik ilgili konsantrasyonlarda hücre sinyal molekülleri zamansal ve uzaysal çözünürlüğü artmış sağlarlar. Bunun yerine örnekleme ve uzun süre boyunca aralıklarla alınan hücre dışı sıvıların analiz enzimleri analit tepki olarak, bu sensörler, böylece gerçek zamanlı ölçümleri 1,2 üreten, hızlı yanıt verir. Pürin ya da hidrojen peroksit ve bunların serbest bırakılması dinamikleri gibi otokrin ve parakrin faktörler, interstisyel konsantrasyonları hızlı tespiti, normal ve patolojik koşullarda 3 ilaçların etkileri için bir profil oluşturmak için de kullanılabilir. Şu anda, sensörler kullanılarak uygulamalar çoğunluğu beyin dokusu dilimleri ve hücre kültürlerinde 4-10 olmuştur. Bu yazının amacı ayrıntılı protokollerdoğru bütün böbreklerde analitlerin gerçek zamanlı konsantrasyonlarını ölçmek için araçlar kurar.
Aşağıdaki protokoller interstisyel ATP ve H böbrekte 2 O 2 sinyal incelemek için geliştirilmiştir. Böbreğin yerli ortamında, hücre dışı ATP hızla türevleri (ADP, AMP ve adenozin) içine endojen ectonucleotidases tarafından katabolize edilir. Burada kullanılan sensör diğer pürin ATP bozunma ürünleri üzerinde 11 ATP'ye son derece seçicidirler. ATP serbest bırakılması ve sinyal fonksiyonu sürekli ve dinamik konsantrasyonlarının doğru izlenmesini sağlayan bu büyük bir avantaj sunuyor. İnterstisyel ATP konsantrasyonu iki Mikroelektronlar kombinasyonu, bir ATP sensörü ve null sensörü kullanılarak ölçülür. Katalaz uygulamaları ile birlikte boş sensör interstisyel H 2 O 2 konsantrasyonu 12 tespit edebiliyor. Aşağıdaki protokoller senso iki farklı tasarımlar kullanınYa ex vivo veya in vivo uygulamalarda optimum özelliklere sahip rs.
Her iki tasarım bir sensör enzimatik katmanın içerdiği gliserol kinaz ve gliserol-3-fosfat oksidaz sıralı katalitik reaksiyon dayanır ve ATP mevcudiyetinde tarafından tahrik edilir. Ex vivo çalışmalarda kullanılan sensörlerin grubu, H2O 2, son enzimatik reaksiyon ürünü olarak bir platin / iridyum (Pt-Ir) telidir ilgili oksidasyonu ile tespit edilir. In vivo çalışmalar için sensörler yerine, kan ile perfüze doku için tasarlanmış bir mediatör kaplı altın elektrot üzerinde 2 O 2 redüksiyon H dayanmaktadır. Bu yazıda anlatılan her iki protokol şeması Şekil 1'de gösterilmektedir. Bu bağlanmış enzimler yoksun hariç boş sensör karşılık gelen ATP sensörü ile aynıdır. Bu nedenle, katalaz enzimi ile H2O 2 saptanmasına ek olarak, sıfır sensör meaSures nonspesifik müdahaleler. ATP konsantrasyonları Boş nonspesifik müdahaleler ve ATP sensörü sinyali arka plan H 2 O 2 algılandı çıkarılmasıyla hesaplanır. Çeşitli sensörleri ayrıca karşılık gelen Null ile eşleştirilmiş in vivo adenozin ionosine, hipoksantin, asetilkolin, kolin, glutamat, glikoz, laktat, ex vivo uygulamalar ya da adenozin ionosine d-serin ve hipoksantin gibi diğer analitler tespit etmek için ticari olarak temin edilebilir sensörü.
Doğru analitlerin tespit sensörün yeteneği düzgün öncesi ve sonrası kalibrasyon 13 bağlıdır. Bu analiz, biyolojik dokularda kullanım sırasında meydana sensör hassasiyeti sürüklenme hesapları sağlar. Sensör sensör enzimatik reaksiyonlarda reaktif madde olarak kullanılan bir gliserol depo tutar. Sensör gliserol içeren banyo çözümlerinde kullanılan değilse, zamanla yıkayın olacaktır. Shorter rayıt kez o zaman sensör kayması en aza indirmek için gereklidir. Ayrıca büyük sensörlerin 14 duyarlılığını azaltabilir endojen proteazlar ve protein parçaları ile kirlenme sensör.
Mevcut elyazması ex vivo ve in vivo böbrek hazırlıklarında enzimatik mikroelektrot biyosensörler kullanımını kurar. Gerçek zamanlı analit ölçümü böbrek hastalıkları ve farmakolojik ajanların mekanizmalarına yeni bakış açıları ortaya çıkarabilir hücresel sinyal görülmemiş ayrıntı sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Laboratuvar Hayvanları Bakımı ve Kullanımı NIH Kılavuzu'na uyulması aşağıdaki hayvan prosedürleri. Ön onay Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) elde edilmiştir.
NOT: Sensör üreticisi talimatları Deneme tasarımı ve önce kendi kullanımına sırasında yapılmalıdır. Sensörler kullanırken bu talimatları sonrasında optimal sonuçlar üretecektir.
1. Sensör Kalibrasyonu
- Deneyin başlamasından önce taze stok çözümleri hazırlayın.
- 10 mM NaPi tamponu, 100 mM NaCI, 1 mM MgCI2, ve 2 mM gliserol içeren tampon A oluşturur. NaOH kullanılarak 7.4'e pH ayarlayın. 2-8 ° C'de saklayın.
- -20 ° C'de saklandı stok ATP konsantrasyonu (100 mM) kullanılarak, Tampon A, 90 ul 10 ul stok eklenerek taze 10 mM ATP çözeltisi oluşturmak kalibrasyon
- T içine ucu (Şekil 2) koyarak ATP sensörü rehydrate2-8 ° C'de en az 10 dakika süre ile tampon A içeren da rehidrasyon odası.
Not: rehidrasyon sonra, sensörler fazla 20 saniye boyunca havaya maruz kalmamalıdır veya sensör hassasiyeti azaltılabilir. Havaya uzun pozlama beklenen ise, bir gliserol çözeltisi içine kısa bir süre sensörü daldırma. Sensörler birden deneyler için kullanılabilir ancak bu sensör rehidrasyon ile aynı günde gerçekleşmelidir. Sensörler 24 saat için tampon A ile rehidrasyon odası içinde saklanabilir. - Çift kanallı potentiyostat (Şekil 3) açın ve kayıt sistemi yazılımını başlatmak.
- Tampon A. Place 3 ml kalibrasyon odasına referans elektrodu ile bir kalibrasyon odasını hazırlayın. Daha sonra, rehidrasyon odasından her sensörü alın manipülatör ekleyin ve kalibrasyon odası çözüm içine yerleştirin.
NOT: Bir kalibrasyon odası gibi standart silikon kaplı petri kullanın. Tüm kalibrasyonları ve st yürütmekyüksek performanslı laboratuar hava masaya bir Faraday kafesi içinde udies amperometri kayıtları (Şekil 4) sırasında sinyal gürültüsünü azaltmak için. Kalibrasyon mümkün olan en iyi şekilde veri toplama başlangıç yakın yapılır. In vivo uygulamalar için kalibrasyon için en uygun zaman hayvan ameliyat sonrası iyileşme döneminde olduğunu. - Ex vivo kalibrasyon
- 10 döngü için 100 mV / sn bir hızda 500 mV -500 mV ile sensörler devirli kalibrasyon odası içinde voltametri gerçekleştirin. Bu büyük ölçüde sensör duyarlılığını arttırır. 10 döngüleri gözlenen izleri Şekil 5'e bakınız.
- Son döngüden sonra 600 mV sensörleri polarize. Sensör akımı bir asimptotuna bozulacaktır. Sabit bir okuma 5 dakikalık bir minimum sonra elde edilir. Sıfır okuma kaydedin.
- In vivo sensör kalibrasyonu
- In vivo senso üzerinde voltametri yapmayınrs. Bunun yerine, mV ila +500 30 saniye için kalibrasyon odasında sensörü polarize. Sonra 0 mV potansiyostatı ayarlamak ve sensör akımı bir asimptotuna yükselmesine izin verin. Sensör akımı asimptotuna en az 2 dakika sürecektir. Sıfır okuma kaydedin.
- Ardışık istenen algılama aralığı kapsayan bir kalibrasyon hattı üretmek için odasına ATP çözeltisi set miktarda ekleyebilirsiniz. ATP odasına boyunca eşit dağılır olarak ATP çözüm çürüme tarafından takip başlangıçta sensör sinyali keskin bir tepe üretir. Tutanak sinyal değerleri sinyal seviyesi bir kez. Her ATP ilavesinden sonra Şekil 6A ve 7 izlerini stabilize ve sırasıyla vivo çalışmalar hem ex vivo ve ATP konsantrasyonlarını önerdi.
NOT: Bu Analitlerin temizleyiciler kullanılarak elektrotların seçiciliğini onaylamak için önemlidir. Mevcut protokol H <ATP sensör ve katalaz özgünlüğünü test etmek için kullanılır apirazsub> 2 O 2 sinyali (Şekil 6B). Ilaçların tatbik edilecek ise, sensör ile reaktiviteleri ölçümleri çalışma öncesi belirlenmelidir. - ATP sensörü (sıfır seviyesinin (Şekil 7) azaltmalıdır ATP uygulama tarafından üretilen akım spesifıkliğini test etmede 2 mg / ml (89 BM / mg) olan bir stok apiraz 3 ul ekle.
- (2 O 2 uygulama sıfır okuma azaltmak gerekir H tarafından üretilen akım) null sensörü özgünlüğünü test etmek için 2mg / ml stok (100 UN / mg) katalaz 3 ul ekleyin.
Sensör Araştırmalar 2. Hayvan Cerrahisi
- Ex vivo Cerrahisi
- Izofluran (% 5 indüksiyon,% 1.5 2.5 bakım) / tıbbi sınıf O 2 ya da başka bir onaylanmış yöntemle deneysel hayvan anestezisi. 12 Hayvanlar sürekli olarak anestezi yeterli düzeyde sağlanması için izlenmesi gerekir 15 '. Stmümkün solunum hızı ve ayak tutam tepki uygun anestezi onaylamak için kullanılır.
Onaylı IACUC protokollerine göre hayvan Euthanize: Not. Tüm hayatta olmayan prosedürlerin tamamlanmasıyla hayvanın 12 insani ölümünü sağlamak için pnömotoraks uyaran torakotomi ile derinden anestezi hayvanlar euthanize. - Sırtüstü pozisyonda sıcaklık kontrollü cerrahi masaya sıçan yerleştirin. Uygun bir anestezi derinliği muhafaza edilirken, sol böbrek doğrultusunda yaklaşık 5 sm bir orta hat kesi yapmak ve merkezden uzak karın aortu maruz kalmaktadır.
- Çölyak ve superior mezenterik arterler ve bu arterlerin üzerinde abdominal aorta etrafında bitişik harfleri sarın ama Arter yok. Renal arterlerin altında abdominal aorta etrafında iki bitişik harfler sarın.
- Bitişik harfler üzerinde abdominal aorta Kelepçe. Alt bitişik harfleri bağlayın. Polietilen boru (PE50) ile abdominal aorta kateter. İkinci aort ligature ile kateter sabitleyin.
- Kelepçesini çıkartın ve mezenterik ve çölyak arterler Arter. Böbrek tamamen beyazlatılmış kadar 2-3 dakika süresince oda sıcaklığında Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi ile 6 ml / dk böbrek serpmek.
- Aort kısmını bağlı böbrek ve kateter, tüketim. Banyo çözeltisi ile dolu bir 3 mi Petri kabı içine böbrek yerleştirin.
Not: Deney protokolü, oda sıcaklığında gerçekleştirilebilir. 145 NaCl, 4.5 KCl, 2 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, pH NaOH ile ayarlanmış 7,35: banyo çözeltisi mM içerir.
- Izofluran (% 5 indüksiyon,% 1.5 2.5 bakım) / tıbbi sınıf O 2 ya da başka bir onaylanmış yöntemle deneysel hayvan anestezisi. 12 Hayvanlar sürekli olarak anestezi yeterli düzeyde sağlanması için izlenmesi gerekir 15 '. Stmümkün solunum hızı ve ayak tutam tepki uygun anestezi onaylamak için kullanılır.
- In vivo cerrahi
- Onaylı IACUC protokolleri kullanarak sıçan anestezisi. In vivo analiz için ketamin sıçanlar (20 mg / kg im), Inactin (50 mg / kg ip) anestezi. Hayvanlar sürekli olarak anestezi yeterli düzeyde sağlanması için izlenmesi gerekir. Kararlı bir solunum hızı ve ayak tutam tepki uygun anestezi onaylamak için kullanılır.
- Uygun anestezi derinliği elde sonraed, hava tablo üzerinde bulunan sıcaklık kontrollü bir topraklanmış bir yüzey üzerine sırt üstü yatırıldı sıçan yerleştirin. Yüzey önceden ısıtılmış ve 36 ° C 'de muhafaza edilmesi gerekir.
- Uygun anestezi derinliği korurken, böbrek doğrultusunda ensizyon yaklaşık 5 cm olun.
- Saptırmak ve tüm böbrek görünür şekilde deri ve deri altı doku demirlemek bir sütür kullanın. Herhangi bir hareket eserler en aza indirmek için bir böbrek fincan böbrek yerleştirin.
- Kan hacmi muhafaza etmek için, jugularis damarından 1 ml / 100 g / saatlik bir% 0.9 NaCl,% 2 BSA, bir IV infüzyonu kullanın. İdrar toplama hem üreterler cannulate. Yer superior mezenterik ve çölyak arterler etrafında bağlar ve böbrek perfüzyon basıncı (Şekil 10A) manipülasyonu için uzak aortal.
- Farmakolojik ajanların uygulanması in vivo deneyler sırasında gerekli ise, bir geçiş kateter yerleştirilmesi (Şekil 10B önerilir
3. Veri Toplama Ayarları
- Veri toplama programını açın ve her iki ex vivo ve Anodik Pozitif in vivo deneylerde kendi polarite ayarlayın. ASCII kodu olarak verileri kaydetmek için programı ayarlayabilirsiniz.
- Böbreklerin sensörler hızlı yerleştirilmesi için mikromanipülatörler yerleştirin.
NOT: Alternatif olarak, sensörlerin istenen yerleşim ulaşmanıza yardımcı olmak için mikromanipülatör bağlı bir kukla prob kullanın. - Ex vivo veri toplama
- / Dakika 650 ul sabit bir oranda kanül yoluyla aort (2.1.6) banyo çözeltisi ile böbrek serpmek. Cerrahi makas kullanarak dikkatlice sensör yerleştirilmesi için gerekli olan böbrek kapsülü, kaldırın.
- Lastik bantlar böbrek üzerinde sarılı ve iğnelerle silikon kaplı çanak bağlı olan böbrek sabitleyin.
- Ucu batık ile petri böbrek yakın referans elektrot yerleştirintampon çözeltisi.
- In vivo veri toplama
- Bir böbrek fincan böbrek yerleştirin. Hayvanın soyu ve yaşına bağlı olarak. Gevşek böbreği tutan bardak bir boyutunu kullanmak 8 görünen programları böbrek bardak iki boyutları Şekil. Benzer bardak gibi micropuncture vs 16 böbrek işlevinin analiz odaklı farklı fizyolojik yaklaşımlar kullanılmaktadır.
Böbrek fincan pozisyon hayvan nefes tarafından üretilen mekanik gürültü çıkarmak için çok önemlidir, ancak müdahale veya böbrek perfüzyon veya idrar akışını engellemeyin olmalıdır: Not. - Veri toplama gerçekleştirmeden önce iyileşme süresi 45 dakika bekleyin.
- Bir 26-30G iğne kullanarak, böbrek sensörün istenen konuma ve derinlikte bir delik delme. Dönen kanı temizlemek için yüzey delik kurulayın. Böbrek yüzeyine bir gliserol çözeltisini ekleyin. Bu deney sırasında kurumasını böbrek yüzeyini önleyecektir. Rehidrasyon odasından, ilk sensörünü çıkarın ve mikromanipülatör eklemek. Çabuk, 20 saniye içinde, böbrekte taze oluşturulan deliğe elektrot yerleştirin. Yineleyin boş sensör için 3,5-3,9 adımları.
- Sensörlerden gelen gelen böbrek içine yaklaşık 1 cm referans elektrot yerleştirin.
- Bir böbrek fincan böbrek yerleştirin. Hayvanın soyu ve yaşına bağlı olarak. Gevşek böbreği tutan bardak bir boyutunu kullanmak 8 görünen programları böbrek bardak iki boyutları Şekil. Benzer bardak gibi micropuncture vs 16 böbrek işlevinin analiz odaklı farklı fizyolojik yaklaşımlar kullanılmaktadır.
- Potentiyostat açın ve bilgisayara kayıt programı etkinleştirin. 9 ex vivo böbrek veri toplama son kurulumunu göstermektedir. 10 eklenen bir kateter ile in vivo böbrek veri toplama son kurulumunu göstermektedir.
4. Veri Analizi
- Menşe veya başka bir benzer yazılım içine ASCII veri dosyasını içe aktarın.
- Konsantrasyon geçerli ilişki
- Geçerli bir lineer konsantrasyon (x- ekseni) oluşturmak için ATP veya H 2 (y -Axis) ilişki lineer uyum / tahmin etmek işlevini kullanın 2 kalibrasyon noktası (Şekil 6 ve 7).
doğrusal fit satır: y = mx + b
- Geçerli bir lineer konsantrasyon (x- ekseni) oluşturmak için ATP veya H 2 (y -Axis) ilişki lineer uyum / tahmin etmek işlevini kullanın 2 kalibrasyon noktası (Şekil 6 ve 7).
- Konsantrasyona akımı Equate
- Hücre içi ATP tarafından üretilen gerçek akımı elde etmek için ATP sensörünün olanlardan boş sensörünün ölçülen izleri çıkarın.
- 4.2.1 detaylı kalibrasyon denklem kullanılarak nM'ye amperometri ile elde edilen pA ATP değerleri dönüştürür. "X" değeri her bir düzeltilmiş akımı ithal ve y (analitin konsantrasyonu) için çözerek ATP sensörünün çıkarılır veri izi konsantrasyonunu belirlemek.
- Gerekirse Benzer şekilde, kalibrasyon denklemi H 2 O 2 konsantrasyonu hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enzimatik mikroelektrot biyosensör tasarımı bütün böbreklerde analitlerin gerçek zamanlı algılanmasını sağlar. Her iki ex vivo veya in vivo çalışmalar genel deney tasarımı kullanılan Şekil 1 hayranlarıyla sensörleri gösterilmiştir ve cerrahi işlemler çalışmaya bağlı olarak farklılık ex vivo veya in vivo olduğu.
Tekrarlanabilir sonuçlar, doğru öncesi ve sonrası kalibrasyon elde etmek olan kritik. Şekil 6A kalibrasyonları sırasında ex vivo ATP sensöründen görülen sinyalin temsili iz gösterir. Hızlı bir şekilde apiraz unutmayın ATP sinyalini ortadan kaldırmıştır. Katalaz ATP sinyali üzerinde herhangi bir etki ve yarattığı H2O 2 (Şekil 6B) karşı özgüllük göstermiştir. Kalibrasyon yöntem VI. ATP dinamik değişimleri (Şekil 6A, sağ panel) hesaplamak için kullanılan bir doğrusallaştırma üretirvo sensörü kalibrasyonu ex vivo sensör benzer iz üretir. Ancak, bu sensör yerine oksidatif akımların indirgeyici algılar ve üretilen bu tür güncel olarak negatiftir. Bu sensörlerin kalibrasyonu da 0,3 ile 80 mcM aralığında doğrusal bir uyum (Şekil 7A sağ panel) üretir. Diğer purin ürün üzerinde ATP in vivo sensör spesifikliği Şekil 7B 'de gösterilmiştir.
Burada anlatılan yaklaşım bize ilaç infüzyonu 12 cevaben endojen maddeler ve akut değişiklikler hem bazal düzeylerini ölçmek için izin verir. Ang Şekil 11 'de olduğu gösterilmiştir tuzu dayanıklı ve tuza karşı duyarlı farelerde H2O 2 interstisyel endojen konsantrasyon değişiklikleri II kaynaklı. Bu deneyler için, Sprague Dawley (SD) ya da Dahl tuza karşı duyarlı (SS) sıçanları taze izole edilmiş böbrek, sabit laminer akış (650 ul / dakika) altında 1 uM Ang II ile perfüze edildi. Sho gibiwn Şekil 11'de, Ang II SD ve SS sıçanlarından böbreklerde H2O 2 akut salımını indükler. Bununla birlikte, her bir yanıtın maksimum amplitüd önemli ölçüde hayvanların yüksek tuz diyeti 12 ile beslendi, özellikle SS sıçanlarda yükselmiştir. In vivo Biyosensör temsili bir uygulama, Şekil 12'de gösterilmektedir. Katalaz (5 ug / ml), biosensör ile tespit tamamen bloke H2O 2 sinyalinin infüzyon. Bu deneyler, farmakolojik müdahale yanıt olarak endojen madde ve onların serbest gerçek zamanlı ölçümler hormonların düzeylerinin tespiti için amperometrik tekniği ile birleştirilen belirli bir enzimatik biyosensör kullanımını göstermektedir. Bu yaklaşımın başka uygulamaları tuz duyarlı hipertansiyon gibi böbrek patolojilerin bizim bilgi ve anlayış geliştirecektir pürinerjik sinyalizasyon ve hidrojen peroksit rolünü incelemek için, böbrek öküzidative stres ve kronik böbrek hastalığı.
Protokoller Şekil 1 şematik. Ilgili analit 've özgüllüğü test edilmesi kalibrasyon deneylerin başlamasından hemen önce yapılır. In vivo protokol karmaşık fizyolojik ve farmakolojik deneyler uygulamalar için eski vivo takip edilmelidir. Mesaj deney kalibrasyon yapılması ve veri analizi sırasında dikkate alınmalıdır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Enzimatik Mikroelektrod Sensörü. İkiex vivo uygulamalar için kullanılan sensör boyutları, 50 mikron ve 125 mikron çapları gösterilmiştir. Her bir sensör teli altın uç bağlantısına bağlamak için bir kılcal boru içine uzanan (gösterilmemiş olan). Ankastre ATP tespiti için enzimler ile kaplanmış bir sensör ucu göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Dual Channel Potansiyostat. CH1 ve CH2'yi etiketli potansiyostat kanalları. 1) CH1 ATP sensörü bağlantısı ve 2) CH2 elektriksel referans elektrot bağlanır Boş sensör bağlantısı 3) bağlantıları. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
fo eşek = "jove_content": keep-together.within sayfa = "always"> 
Şekil 4. Sensör Kur. Veri toplama elektriksel gürültü azaltmak için bir Faraday kafesi ve titreşimsiz çalışma yüzeyi için yüksek performanslı bir laboratuar masasında yapılır. 1) bir sıcaklık-kontrollü bir ameliyat masası mikromanipülatörler bir ışık kaynağı cerrahi prosedürler ve sensör yerleştirme 4 için gerekli olan bir deney 3) sırasında sensörlerin esnek konumlandırma manyetik montaj adaptörlere bağlanır) fizyolojik deneyler 2 sırasında hayvanlar vücut ısısını korumak için kullanılır ) Çift kanallı potansiyostat 5) sensörler için tutucu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
p_upload / 53059 / 53059fig5.jpg "/>
Şekil 5. Voltametri. Ex vivo çalışmalar için, sensör voltametri -0.5 ve önceki kalibrasyon protokolü 0.5 V arasında 10 döngü için yapılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6. Ex vivo Amperometri Kalibrasyon. (A) Kalibrasyon banyo çözeltisine bilinen ATP konsantrasyonlarının ilave kullanır. Asymptote düzeyinde (siyah iz) kaydedilmiş amperometrik değerleri gelir. Elde edilen akımların bir kalibrasyon denklem oluşturmak. Bir örnek sağ panelde gösterilir. Kırmızı iz curre olduğunuH2O 2 yalnızca bir ek yanıt boş sensörünün nt. (B) Boş sensör banyosu çözeltisi ve amperometrik değerler kaydedilir asimptotlardan (ince siyah oklar) bilinen H2O 2 konsantrasyonları (kırmızı oklar) eklenmesi ile kalibre edilir. Banyo solüsyonu (kalın siyah ok) katalaz eklenmesi hızlı akım çürüme sonuçlanır. Sağ panel Boş sensör kalibrasyon denklemini göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için tıklayınız. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 7. Için Amperometri Kalibrasyon;., In vivo ve in Vivo elektrotlar Kalibrasyon redüksiyon reaksiyonları dışında ex vivo çalışmalarda ayrıntılı olarak anlatılan benzer bir şekilde bir ters akım (polarite) neden olan gerçekleştirilir. (A) Bilinen ATP konsantrasyonlarının ilave ATP sensörü (siyah iz) bir amperometrik akımı üretir ancak null sensörü (kırmızı iz) üzerinde hiçbir etkisi yoktur. Apiraz eklenmesi ATP sensörünün akımı söndürür. (B) ATP sensörünün özel birleşmesi farklı purinerjik ajanlar (UTP, UDP ve adenosin) 10 uM ilave ile teyit edilir. ATP'nin başka uygulamaları istikrarlı bir saptanabilir amperometrik akımı sağlarlar. Bir arabulucu kaplı altın elektrodun dayalı in vivo sensörler (C) mikrofotoğrafını. Bu figu büyük halini görmek için tıklayınızyeniden.
Şekil 8. Böbrek Bardaklar., In vivo çalışmalarda, böbrekler hala gösterilen paslanmaz çelik böbrek bardak kullanılarak yapılır. Bardak İki boyutları böbrek boyutu varyasyonu karşılamak için kullanılır. Bu bardak hayvanın solunum tarafından oluşturulan hareket eserler azaltır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 9. izole edilmiş ex vivo ve perfüze Kidney. Izole edilmiş böbrek, kalın si ile kaplanmış bir 1) Petri kabı içine yerleştirilirpimli ekleme 2) renal arter deney 3) ATP sensörü boyunca sabit perfüzyon için bir şırınga pompasına kanül vasıtasıyla sokuldu ve bağlı olduğu için licone alt, 4) ve boş sensör böbrek 5) referans elektrotu daldırılmış böbrek yakın yerleştirilir sokulur banyo solüsyonu içine. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Vivo Kan perfüze Böbrek olarak Şekil 10.. Sol böbrek maruz kalan ve bir böbrek fincan yerleştirilir (A), sağ böbrek hayvanın içinde bozulmadan kalır. Her iki sensörler böbrek içine yerleştirilir. BSA: NaCl sıvı kaybı b neden karşı koymak kateterize infüze ediliry 1) böbrek böbrek bardağı 2) ATP sensörü 3) Boş sensör ve 4) referans elektrot tarafından düzenlenen direkt farmakolojik uygulamalar için implante interstisyel kateter ile in vivo deney geniş orta hat kesi (B) Örnek eklenir laminer farmakolojik infüzyon için bir peristaltik pompa böbrek içine implante ve bağlı böbrek 5) kateter ventral yüzeyine. Bu rakamın büyük halini görmek için tıklayınız. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
H 2 Şekil 11. Ex Vivo Analizi sub> böbrekte O 2. Ang II perfüzyon H parçasından sıçan böbrek korteksinde 2 O 2 salınımına neden olur. (A) ortalamanın Gerçek zamanlı değişiklikleri N = 8 uygulamalar toplam H 2 O 2 konsantrasyonu (gri çubuklar standart hata gösterir) (4 farklı sıçanlardan 4 böbrek). Üst Barlar Ang II uygulamasını temsil etmektedir. (B) maksimum H Sprague Dawley (SD) ve Dahl tuz duyarlı (SS) sıçanlar için Ang II perfüzyon sırasında 2 O 2 konsantrasyonu genlik değerleri sırasıyla, alçak ve yüksek tuz diyeti ile beslenen. * - P <SD sıçanlarının karşı 0,05. Şekil izni ile referans 12 uyarlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
/files/ftp_upload/53059/53059fig12.jpg "/>
(Şekil 10B'de gösterildiği gibi) H Vivo Analizi interstisyel H in vivo değerlendirilmesi 2 O 2. Örnek olarak Şekil 12. Bir SS sıçan medullasındaki 2 O 2 konsantrasyonunun düşük tuz diyeti ile beslenen. 5 dk aralığında implante kateter yoluyla katalaz interstisyel uygulama renal medulla H 2 O 2 sinyali tam bir abluka üretti. Renal kan akımı ile arınma gelen katalaz Azaltılması, ek katalaz uygulaması (10 dakika) tarafından tekrar bloke edilmiştir sinyalin, kısmi toparlanma sonuçlandı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut protokoller ATP gelişmiş zamansal ve uzaysal çözünürlüğü sağlamak için geliştirilmiştir ve ex vivo perfüze izole ve in vivo kan perfüze böbrekler için H 2 O 2 sinyal. Protokolleri ve burada kullanılan sensörler arasındaki farklar farmakolojik ajanlar ve fizyolojik çalışmalar biri için uygun veri toplama sağlar. Protokoller 1) sensör kalibrasyonu, 2) cerrahi prosedür, 3) veri toplama kurulumu ve 4) veri analizi oluşmaktadır. Onlar çok deneysel koşullar için analitlerin gerçek zamanlı ölçümleri sağlar. Bu büyük böbrek hastalıklarının içgörü ve daha etkili farmakolojik tedavilerin geliştirilmesine yol açacaktır. Burada ATP ve H 2 O 2 analiz sensörleri kullanılır. Bununla birlikte, diğer maddeler için sensörler de kullanılabilir ve kullanılabilir. Burada anlatılan protokoller sıçan böbreklerinde ATP ve H 2 O 2 incelemek için uygulanan, ancak aynı yöntemii edildid kolay farelerde uygulama için ayarlanabilir. Böylece, bu yaklaşım, genetik kemirgen modellerinin bolluğu dikkate alındığında büyük bir potansiyele sahiptir.
Enzimatik mikroelektrot biyosensörler temel tasarım Clark ve Lyons 2 tarafından 1960'lı yıllarda geliştirilmiştir. Biyosensörler ilk geliştirme ardından, gelişmeler hem tasarım 17-19 ve uygulamalar 20 yapılmıştır. Llaudet ve ark., 21,22, enzim kaplama Cosneir ve ark., 23 metotlarını kullanarak, bu protokoller kullanılan ATP sensör prensibi tasarım geliştirildi. Bu sensörler, beyin astrositleri 8 ATP Yayım, 4,24 solunum düzenlenmesi ve iskelet kası arteriole düzenleme 25 de dahil olmak üzere fizyolojik proseslerin bir dizi ATP sinyal tespit ettik. Son zamanlarda ex vivo protokol böbrekler 12 ATP sinyalini ölçmek için kullanılır olmuştur. Bu yazının amacı is böbreklerde ATP gibi endojen maddelerin bulunması için etkili bir yön ve anlayış sağlamak için.
Enzimatik mikroelektrot biyosensörler in vivo analitlerinin ölçülmesinde varolan yöntemlerle üzerinden pek çok avantajı var. Bununla birlikte, özel bir tedbir diğer yeni yönteminde olduğu gibi, bu yaklaşım için kullanılmalıdır. Kurulmuş bir yaklaşımla Doğrulama elde edilen verilerin güven sağlar. Daha önce tarif edildiği gibi 26,27 Örneğin, mikrodiyaliz ölçümleri yapılmıştır. Anlamlı bir fark sensörleri ve diyaliz örnekleri 12 elde edilen değerler ile belirlenen en yüksek konsantrasyonları arasında gözlenmiştir. Mikrodiyaliz sınırlama sadece analitin kararlı hal düzeylerini ölçen olmasıdır. Bunun gibi, hücre sinyal dinamik değişikliklerin değerlendirilmesi sadece enzimatik mikroelektrot biyosensörler kullanımı ile elde edilebilir. Sensör yanıt süreleri fabrikada özellikleri sensörü arasında farklılıktürleri. ex vivo sensörler 5-10 saniye ve 90% 10 ile sinyal artış için 30-35 saniye in vivo sensörleri bir tepki süresi vardır. Kalibrasyon izleri (Şekiller 6 ve 7) analit ekleme / kaldırma zaman çözünürlüğü göstermektedir. Sensörü ve mıkrodıyalız yaklaşımların için analitler ile üretilen bir sinyal bloke etme spesifik enzimlerin kullanımı özgüllük sağlamak için gereklidir.
Açıklanan protokoller çeşitli zorlukları var. Doku içine herhangi bir sensör yerleştirilmesi gibi, doku hasarı meydana gelir. Bu ölçümler 28 etkileyebilir sinyal yolları aktive olabilir. Hücre hasarını en aza indirmek için, daha ince sensörler gerekli olacaktır. Bununla birlikte, bu iğneler, küçük bir giriş deliği yapmak için kullanılır, böylece sensörler böbrek kapsülü nüfuz etmek zordur. İnce sensörler eğmek olasılığı daha yüksektir ve yerleştirme onların kaplama bozabilir. Daha büyük çaplı sensörleri daha dirençli eğilme ve sonucu olanOnların kaplama. Şekil 3 nt hasar ince ve kalın sensörü gösterir. Bükme kalın sensörün direncine ek olarak, bu enzimatik katman için daha fazla koruma sağlayan kaplamanın daha kalın bir tabakasını ihtiva etmektedir. Kalın sensörler kullanarak kaynaklanan doku hasarının endişe beyin dokusunda olacağını daha böbreklerde önemli ölçüde daha az oldu. Yerleştirme derinliği yaklaşılır ve böbrek üzerinde ölçümler tamamlandıktan sonra nihai yerleştirme kontrol edilmelidir. Sensör ucu 0.5 mm ve böbrek korteks 2-3 mm kalınlığında olduğu ekleme rehber olarak sensör ucu uzunluğu kullanarak korteks ve medulla tabakalarını arasındaki Tahmini yeterlidir. Sensörün Kirlenme de böylece bir deney in vivo protokolleri uzun sensör kullanımı sınırlıdır, kanda daha büyük bir oranda gerçekleşir. 1 ½ saat 1 ila kayıt süreleri sadece küçük bir sensör sürüklenme sonuçlandı. Ana kriterler azaltılmış sensör performansını değerlendirirken düşük hassasiyettirKalibrasyon işlemi sırasında analite. Artan elektriksel gürültü ve temel akımının istikrarsızlık da sensör ucu bozuk olduğunu gösterebilir. ATP hassas ölçümler için, iki sensör (ATP ve boş) sinyalin diğer çıkarma benzer gürültü ve sabitlik özelliklerine sahip olmalıdırlar. Aksi takdirde, sensörlerden biri değiştirilmelidir. Düşük ses ve analit düşük konsantrasyonlarda saptanması için, her bir hayvan için yeni sensör kullanımı önerilmektedir.
Birkaç adımlar başarılı deneysel sonuçlar elde etmek için çok önemlidir. Sensörler çok kırılgan ve sensör ucu zarar vermemek için dikkatle ele alınmalıdır. Ayrıca, rehidrasyon işleminden sonra, sensörler fazla 20 saniye boyunca havaya maruz olmamalıdır. Düşük gürültü kayıtları dokularda biyolojik işaretlerin başarılı tespiti için gereklidir. Bu amaçla, bir yüksek performanslı laboratuar hava masa ve uygun elektrik topraklama gereklidir. Analit dur kesin miktarlarda eklenmesiKalibrasyon adımları ing deneylerde, doğru konsantrasyon belirlenmesi için gereklidir. Ex vivo böbrek ameliyatlarında böbreğin iyi takas ulaşmak başarılı kayıtları neden olur. Enzimlerin kullanımının apiraz ve kalibrasyon katalaz ve deneylerde sensör nonspesifik duyarlılık değerlendirilmesi için izin verir ve ölçümler onaylar.
Bu protokoller ölçüde böbreklerde dışı sinyalizasyon detay gelişmiş sağlarlar. Sensörler tarafından sağlanan gelişmiş duyarlılık ve zamansal çözünürlük bize hastalık durumlarında sinyalizasyon ve daha önce saptanamayan idi farmakolojik manipülasyon aşağıdaki ATP değişiklikleri gidermek için izin verebilir. Ex vivo olarak böbrekler üzerinde farmakolojik uygulamalar çalışma için en uygun ise, in vivo protokolü kompleks fizyolojik çalışmalar için uygundur. Burada kullanılan in vivo sensör tasarımı bl de girişime karşı eşi görülmemiş bir direnç sağlardoku ood perfüze. Birlikte ele alındığında, bu sensörler için mevcut protokollerde ve teknikleri ile daha önce mümkün olmayan bir uygulama, büyük miktarda bulunur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bu yazının video kaydı için Sensörler Sarissa Biyomedikal Limited (Coventry, İngiltere) tarafından sağlandı.
Acknowledgments
Biz bu yazıda kullanılan sensörlerin geliştirilmesi onların çalışmaları için Sarissa Biyomedikal teşekkür ederiz. Bu araştırma Ulusal Kalp, Akciğer tarafından desteklenen ve Kan Enstitüsü HL108880 (A. Staruschenko) verir, HL 116.264 (A. Cowley) ve HL 122.662 (A. Staruschenko ve A. Cowley), Tıp Koleji tarafından finanse edilen bir proje Wisconsin Araştırma İşleri Komisyonu # 9306830 (O. Palygin) ve Sağlıklı Wisconsin Araştırma ve Eğitim Programı # 9520217 ilerlemek ve Ulusal Böbrek Vakfı Genç Araştırmacı Grant (O. Palygin).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sensor Kit | Sarissa Biomedical | SBK-ATP-05-125 | The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes. Also included with the kit is the user's choice of sensors. |
| Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-ATP-05-125 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissagold ATP Biosensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-ATP-10-50 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissaprobe null sensor 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-NUL-20-125 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissagold null sensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-NUL-10-50 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissaprobe ATP Manual | Sarissa Biomedical | http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf | |
| Faraday cage | TMC | ||
| Dual channel potentiostat | Digi-Ivy | DY2021 | Type II Faraday cage |
| Data acquisition program | Digi-Ivy | DY2000 | |
| Perfusion pump | Razel Scientific Instruments | Model R99E | |
| Fiber optic illuminator | Schott | ACE 1 | |
| micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| micromanipulator magnetic stand | Narishige | GJ-8 | |
| air table | TMC | 63-500 | |
| isoflurane ventilator | LEI Medical | M2000 | |
| 3 ml petri dish | Fisher Scientific | S3358OA | |
| needle | Santa Cruz | 26-30 G | |
| pins | Standard dissection pins | ||
| catheter | Polyethylene tubing (PE50) | ||
| catheter tissue glue | Vetbond | 1469SB | |
| suture | Look | SP117 | |
| rubber bands | any 2-4 mm wide rubber bands | ||
| silicone | Momentive | RTV-615 Clear 1# | |
| clamp | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| standard dissection kit | Kit should include scalpel and dissection sissors | ||
| Kidney Cup | Of own design | ||
| standard chemicals | Sigma-Aldrich | ||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | 100 mM ATP solution |
| hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A7646 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| isoflurane | Clipper | 10250 | |
| inactin | Sigma-Aldrich | T133 | |
| ketamine | Clipper | 2010012 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 |
References
- Palygin, O., Staruschenko, A. Detection of endogenous substances with enzymatic microelectrode biosensors in the kidney. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 305, 89-91 (2013).
- Clark, L. C., Lyons, C. Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery. Ann N Y Acad Sci. 102, 29-45 (1962).
- Haruyama, T. Micro- and nanobiotechnology for biosensing cellular responses. Adv Drug Deliv Rev. 55, 393-401 (2003).
- Huckstepp, R. T., et al. Connexin hemichannel-mediated CO2-dependent release of ATP in the medulla oblongata contributes to central respiratory chemosensitivity. J Physiol. 588, 3901-3920 (2010).
- Lopatar, J., Dale, N., Frenguelli, B. G. Minor contribution of ATP P2 receptors to electrically-evoked electrographic seizure activity in hippocampal slices: Evidence from purine biosensors and P2 receptor agonists and antagonists. Neuropharmacology. 61, 25-34 (2011).
- Avshalumov, M. V., Chen, B. T., Marshall, S. P., Pena, D. M., Rice, M. E. Glutamate-dependent inhibition of dopamine release in striatum is mediated by a new diffusible messenger, H2O2. J Neurosci. 23, 2744-2750 (2003).
- Frenguelli, B. G., Wigmore, G., Llaudet, E., Dale, N. Temporal and mechanistic dissociation of ATP and adenosine release during ischaemia in the mammalian hippocampus. J. Neurochem. 101, 1400-1413 (2007).
- Lalo, U., et al. Exocytosis of ATP from astrocytes modulates phasic and tonic inhibition in the neocortex. PLoS Biol. 12, e1001747 (2014).
- Heinrich, A., Ando, R. D., Turi, G., Rozsa, B., Sperlagh, B. K+ depolarization evokes ATP, adenosine and glutamate release from glia in rat hippocampus: a microelectrode biosensor study. Br.J Pharmacol. 167, 1003-1020 (2012).
- Dale, N. Purinergic signaling in hypothalamic tanycytes: potential roles in chemosensing. Semin Cell Dev Biol. 22, 237-244 (2011).
- Gourine, A. V., Llaudet, E., Dale, N., Spyer, K. M. Release of ATP in the ventral medulla during hypoxia in rats: role in hypoxic ventilatory response. J Neurosci. 25, 1211-1218 (2005).
- Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H2O2 release in freshly isolated kidneys. Am J Physiol Renal Physiol. , (2013).
- Thome-Duret, V., Gangnerau, M. N., Zhang, Y., Wilson, G. S., Reach, G. Modification of the sensitivity of glucose sensor implanted into subcutaneous tissue. Diabetes Metab. 22, 174-178 (1996).
- Wilson, G. S., Gifford, R. Biosensors for real-time in vivo measurements. Biosens. Bioelectron. 20, 2388-2403 (2005).
- Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-Channel Analysis of TRPC Channels in the Podocytes of Freshly Isolated Glomeruli. Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).
- Stockand, J. D., Vallon, V., Ortiz, P. In vivo and ex vivo analysis of tubule function. Compr Physiol. 2, 2495-2525 (2012).
- Turner, A. P. Biosensors: Fundamentals and applications - Historic book now open access. Biosens. Bioelectron. 65C, A1 (2014).
- Kauffmann, J. M., Guilbault, G. G. Enzyme electrode biosensors: theory and applications. Methods Biochem Anal. 36, 63-113 (1992).
- Barlett, P. N., Cooper, J. M. A review of the immobilization of enzymes in electropolymerized films. J Electroanal Chem. 362, 1-12 (1993).
- Kano, K., Morikage, K., Uno, B., Esaka, Y., Goto, M. Enzyme microelectrodes for choline and acetylcholine and their applications. Anal Chim Acta. 299, 69-74 (1994).
- Llaudet, E., Hatz, S., Droniou, M., Dale, N. Microelectrode biosensor for real-time measurement of ATP in biological tissue. Anal Chem. 77, 3267-3273 (2005).
- Llaudet, E., Botting, N. P., Crayston, J. A., Dale, N. A three-enzyme microelectrode sensor for detecting purine release from central nervous system. Biosens Bioelectron. 18, 43-52 (2003).
- Cosnier, S., Lepellec, A., Guidetti, B., Isabelle, R. -L. Enhancement of biosensor sensitivity in aqueous and organic solvents using a combination of poly(pyrrole-ammonium) and poly(pyrrole-lactobionamide) films as host matrices. J Electroanal Chem. 449, 165-171 (1998).
- Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329, 571-575 (2010).
- Kluess, H. A., Stone, A. J., Evanson, K. W. ATP overflow in skeletal muscle 1A arterioles. J. Physiol. 588, 3089-3100 (2010).
- Nishiyama, A., Jackson, K. E., Majid, D. S., Rahman, M., Navar, L. G. Renal interstitial fluid ATP responses to arterial pressure and tubuloglomerular feedback activation during calcium channel blockade. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290, H772-H777 (2006).
- Jin, C., et al. Effects of renal perfusion pressure on renal medullary hydrogen peroxide and nitric oxide production. Hypertension. 53, 1048-1053 (2009).
- Khan, A. S., Michael, A. C. Invasive consequences of using micro-electrodes and microdialysis probes in the brain. Trends Anal. Chem. 22, 503-508 (2003).
