Abstract
Biocapteurs de microélectrodes enzymatiques ont été largement utilisés pour mesurer la signalisation extracellulaire en temps réel. La plupart de leur utilisation a été limitée à des tranches de cerveau et cultures de cellules neuronales. Récemment, cette technologie a été appliquée à l'ensemble des organes. Les progrès dans la conception de capteurs ont rendu possible la mesure de la signalisation cellulaire dans le sang perfusé dans les reins vivo. Les présents protocoles énumèrent les étapes nécessaires pour mesurer l'ATP et H 2 O 2 signalisation dans le tissu interstitiel du rein de rat. Deux conceptions de capteurs séparés sont utilisés pour l'ex vivo et in vivo dans des protocoles de. Les deux types de capteurs sont revêtus d'une couche biologique enzymatique mince sur le dessus d'une couche de permsélectivité pour donner réponse rapide, les biocapteurs sensibles et sélectives. La couche de perméabilité sélective protégeant le signal des substances interférentes dans le tissu biologique, et la couche enzymatique utilise la réaction catalytique séquentiel de la glycérol kinase et glycérol-3-phosphate-oxydase en présence d'ATP pour produire H 2 O 2. L'ensemble de capteurs utilisés pour les études ex vivo en outre analyte détecté par oxydation de l'H 2 O 2 sur une platine / iridium (Pt-Ir) fil-électrode. Les capteurs pour les études in vivo sont plutôt basée sur la réduction de H 2 O 2 sur une électrode d'or revêtu de médiateur conçu pour tissu perfusé de sang. Les changements de concentration finale est détecté par ampérométrie en temps réel suivie d'étalonnage de concentrations connues d'analyte. En outre, la spécificité du signal ampérométrique peut être confirmée par l'addition d'enzymes telles que la catalase et apyrase qui décomposent H 2 O 2 et de l'ATP de façon correspondante. Ces capteurs comptent aussi beaucoup sur les étalonnages précis avant et après chaque expérience. Les deux protocoles suivants établissent l'étude de la détection en temps réel de l'ATP et H 2O 2 dans des tissus de rein, et peut être en outre modifié de manière à étendre la méthode décrite pour une utilisation dans d'autres préparations biologiques ou d'organes entiers.
Introduction
Biocapteurs de microélectrodes enzymatique (également mentionnés comme des capteurs dans le présent manuscrit) ont été un outil précieux pour l'étude des processus de signalisation dynamiques dans les cellules et les tissus vivants. Les capteurs permettent d'augmenter la résolution temporelle et spatiale des molécules de signalisation cellulaire dans des concentrations biologiquement pertinentes. Au lieu de l'échantillonnage et l'analyse de fluides extracellulaires prélevés à des intervalles de plus longues périodes de temps, ces capteurs réagissent aussi vite que leurs enzymes réagissent à l'analyte, produisant ainsi des mesures en temps réel de 1,2. Détection rapide des concentrations interstitielles de facteurs autocrine et paracrine, comme purines ou le peroxyde d'hydrogène, et la dynamique de leur libération peut être utilisé pour établir un profil pour les effets des médicaments dans des conditions normales et pathologiques 3. Actuellement, la plupart des applications utilisant des capteurs ont été dans des coupes de tissu de cerveau et de cultures de cellules 4-10. Les protocoles détaillés dans ce but manuscritétablir les moyens de mesurer avec précision les concentrations en temps réel des analytes dans les reins entiers.
Les protocoles suivants ont été développés pour étudier l'ATP interstitiel et H 2 O 2 dans les reins signalisation. Dans l'environnement natif du rein, l'ATP extracellulaire est rapidement catabolisée par ectonucléotidases endogènes dans ses dérivés (ADP, AMP et de l'adénosine). Les capteurs utilisés ici sont très sélectifs à l'ATP par rapport aux autres purines ou des produits de dégradation de l'ATP 11. Cela offre un grand avantage, car elle permet un suivi précis des concentrations constantes et dynamiques de la libération d'ATP et sa fonction de signalisation. Concentration interstitielle ATP est mesurée en utilisant la combinaison de deux microélectrodes, un capteur et un capteur ATP Null. Le capteur Null en combinaison avec des applications de la catalase est capable de détecter H 2 O 2 interstitiel 12 concentrations. Les protocoles suivants utilisent deux modèles différents de sensors qui ont des caractéristiques optimales pour soit ex vivo ou in vivo. applications
Les deux modèles sont basés sur la réaction catalytique séquentiel de la glycérol kinase et glycérol-3-phosphate oxydase contenue dans une couche de capteur enzymatique et est entraîné par la présence d'ATP. Dans l'ensemble des capteurs utilisés dans les études ex vivo, H 2 O 2, le produit enzymatique finale de la réaction, est détectée par oxydation sur une platine / iridium (Pt-Ir) fil-électrode. Capteurs pour des études in vivo sont basés sur la place H 2 O 2 de réduction sur une électrode d'or revêtu de médiateur conçu pour tissu perfusé de sang. Illustrée à la figure 1 est un schéma de deux protocoles décrits dans ce manuscrit. Le capteur Null est identique à son capteur de l'ATP correspondante, sauf qu'il n'a pas les enzymes liées. Par conséquent, en plus de la détection de H 2 O 2 avec la catalase enzyme, le capteur de mea NullSures interférences non spécifiques. Concentrations d'ATP sont calculées en soustrayant la détection des interférences non spécifiques Null fond et H 2 O 2 à partir du signal de détection de l'ATP. Plusieurs capteurs sont également disponibles dans le commerce pour détecter d'autres analytes, y compris l'adénosine, ionosine, hypoxanthine, l'acétylcholine, choline, le glutamate, le glucose, le lactate, la D-sérine des applications Ex vivo ou adénosine, ionosine et hypoxanthine pour in vivo quand il est associé avec le Null correspondant capteur.
La capacité du capteur pour détecter les analytes avec précision dépend de la pré- approprié et étalonnages post-13. Cela garantit que représente l'analyse de la dérive de la sensibilité du capteur qui se produit lors de l'utilisation dans les tissus biologiques. Le capteur est titulaire d'un dépôt de glycerol qui est utilisée comme réactif dans les réactions enzymatiques capteurs. Si le capteur est pas utilisé dans les solutions de bain contenant du glycerol, il laver dans le temps. Shorter rent reprises sont alors nécessaires pour minimiser la dérive de la sonde. En outre capteur d'encrassement par des proteases endogènes et les fragments de protéines peut grandement diminuer la sensibilité des capteurs 14.
La présente manuscrit établit l'utilisation de biocapteurs de microélectrodes enzymatiques pour ex vivo et in vivo des préparations de rein. En temps réel analyte quantification fournit des détails sans précédent de la signalisation cellulaire qui peut révéler de nouvelles perspectives sur les mécanismes de maladies du rein et des agents pharmacologiques.
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Protocol
Les procédures sur les animaux suivants ont adhéré à la NIH Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. L'approbation préalable a été obtenue à partir du Comité des soins et de l'utilisation des animaux institutionnel (IACUC).
REMARQUE: Examen des instructions du fabricant du capteur doit être fait lors de la conception de l'expérience et avant leur utilisation. Suite à ces instructions produire des résultats optimaux lorsque vous utilisez les capteurs.
1. Calibrage du capteur
- Préparer des solutions de base fraîches avant le début de l'expérience.
- Insérer le tampon A contenant 10 mM de tampon NaPi, 100 mM de NaCl, 1 mM de MgCl2, et 2 mM de glycerol. Ajuster le pH à 7,4 en utilisant du NaOH. Stocker à 2-8 ° C.
- En utilisant une concentration stock ATP (100 mM) stocké à -20 ° C, de créer une nouvelle solution ATP 10 mM d'étalonnage en ajoutant 10 pi de stock à 90 pi de tampon A.
- Réhydrater le capteur ATP en plaçant sa pointe (Figure 2) dans til chambre de réhydratation contenant tampon A pendant au moins 10 min à 2-8 ° C.
NOTE: Après réhydratation, les capteurs ne doit pas être exposé à l'air pendant plus de 20 secondes ou de la sensibilité du capteur peut être réduite. Si les longues expositions à l'air sont prévus, plonger le capteur brièvement dans une solution de glycérol. Les capteurs peuvent être utilisés pour des expériences multiples, mais ceux-ci doivent se produire sur le même jour que la réhydratation capteur. Les capteurs peuvent être stockés dans la chambre de réhydratation avec du tampon A jusqu'à 24 heures. - Tournez sur le canal potentiostat double (Figure 3) et démarrer le logiciel de système d'enregistrement.
- Préparer une chambre d'étalonnage avec 3 ml de tampon A. La place de l'électrode de référence dans la chambre de calibrage. Prenez chaque capteur de la chambre de réhydratation, puis attachez-le au manipulateur et l'insérer dans la solution de la chambre d'étalonnage.
REMARQUE: Utilisez une boîte de Pétri enduit de silicone standard en tant que chambre de calibrage. Effectuer tous les étalonnages et studies dans une cage de Faraday sur un laboratoire de table d'air haute performance pour réduire le bruit du signal pendant les enregistrements ampérométrie (figure 4). Étalonnages sont mieux fait au plus près du début de la collecte de données que possible. Pour des applications in vivo le moment optimal pour le calibrage est au cours de la période de récupération post-chirurgie des animaux. - Ex vivo étalonnage
- Effectuer voltamétrie cyclique dans la chambre de calibrage par le vélo les capteurs de -500 mV à 500 mV à un taux de 100 mV / s pour 10 cycles. Cela améliore considérablement la sensibilité des capteurs. Voir Figure 5 pour les traces observées à partir des 10 cycles.
- Polariser les capteurs à 600 mV après le dernier cycle. Le courant de la sonde se désintègre à une asymptote. Une lecture d'équilibre est atteint après un minimum de 5 min. Enregistrez la lecture zéro.
- Dans étalonnage de capteur in vivo
- Ne pas effectuer la voltamétrie cyclique sur le in vivo sensors. Au lieu de cela, polariser le capteur dans la chambre de calibrage pendant 30 s à 500 mV. Réglez ensuite le potentiostat à 0 mV et laisser le courant du capteur remonter à une asymptote. Le courant du capteur prendra au moins 2 min à asymptote. Enregistrez la lecture zéro.
- Consécutivement ajouter des quantités fixes de solution ATP dans la chambre pour produire une ligne de calibrage englobant une gamme de détection souhaitée. La solution ATP produit un pic aigu dans le signal du capteur d'abord, suivie d'une décroissance de l'ATP diffuse uniformément dans la chambre. Valeurs de signal d'enregistrement une fois que le niveau de signal est stabilisé après chaque addition ATP. Figures 6A et 7 montrent des traces et a suggéré concentrations d'ATP à la fois ex vivo et des études in vivo, respectivement.
NOTE: Il est important de confirmer la sélectivité des électrodes en utilisant des charognards des analytes. La présente protocole utilisé apyrase pour tester la spécificité de la détection de l'ATP et de la catalase pour la H <sub> 2 O 2 signal (figures 6B). Si les médicaments doivent être administrés, les mesures de réactivité avec les leurs capteurs doivent être déterminés avant l'étude. - Ajouter 3 pi de apyrase partir d'un stock de 2 mg / ml (89 ONU / mg) pour tester la spécificité du capteur de l'ATP (le courant produit par l'application de l'ATP devrait réduire au niveau zéro (figure 7).
- Ajouter 3 pi de la catalase à partir d'un stock de 2 mg / ml (100 UN / mg) pour tester la spécificité du capteur null (le courant produit par H 2 O 2 demande devrait réduire à la lecture de zéro).
2. chirurgie des animaux pour les études de capteurs
- Chirurgie ex vivo
- Anesthésier l'animal expérimental avec l'isoflurane (5% induction, de 1,5 à 2,5% maintenance) / grade médical O 2 ou d'une autre méthode approuvée. 15 '12 animaux doivent être surveillés en permanence pour assurer un niveau adéquat d'anesthésie. Strespiratoires vitesse de réaction et de pincement de l'orteil mesure sont utilisés pour confirmer l'anesthésie appropriée.
Remarque: Euthanasier l'animal selon des protocoles approuvés IACUC. À la fin de toutes les procédures non-survie euthanasier les animaux profondément anesthésiés par thoracotomie induire pneumothorax pour assurer la disparition de l'animal humain 12. - Placez le rat sur une table d'opération à température contrôlée dans une position couchée. Tout en maintenant une profondeur de l'anesthésie adéquate, faire une incision médiane d'environ 5 cm en ligne avec le rein gauche et d'exposer l'aorte abdominale distale.
- Enveloppez une ligature autour de la maladie coeliaque et les artères mésentériques supérieure et l'aorte abdominale au-dessus de ces artères, mais ne pas ligaturer. Envelopper deux ligatures autour de l'aorte abdominale en dessous des artères rénales.
- Fixer l'aorte abdominale au-dessus des ligatures. Attachez la ligature inférieure. Sonder l'aorte abdominale avec des tubes en polyéthylène (PE50). Fixez le cathéter avec la deuxième ligature de l'aorte.
- Retirer la pince et ligaturer les artères mésentériques et la maladie cœliaque. Perfuser le rein à 6 ml / min avec une solution de sel équilibrée de Hanks à température ambiante pendant 2-3 min jusqu'à ce que le rein est complètement blanchi.
- Exciser le rein et le cathéter, la partie de l'aorte connecté. Placez le rein dans une boîte de Petri 3 ml rempli de solution de bain.
Remarque: protocole d'essai peut être effectué à température ambiante. La solution de bain contient en mM: NaCl 145, KCl 4,5, MgCl2 2, CaCl2 1, 10 HEPES, pH ajusté avec du NaOH à 7,35.
- Anesthésier l'animal expérimental avec l'isoflurane (5% induction, de 1,5 à 2,5% maintenance) / grade médical O 2 ou d'une autre méthode approuvée. 15 '12 animaux doivent être surveillés en permanence pour assurer un niveau adéquat d'anesthésie. Strespiratoires vitesse de réaction et de pincement de l'orteil mesure sont utilisés pour confirmer l'anesthésie appropriée.
- Chirurgie pour in vivo
- Anesthésier le rat en utilisant des protocoles approuvés IACUC. Pour l'analyse in vivo anesthésier les rats avec de la kétamine (20 mg / kg IM) et Inactin (50 mg / kg ip). Les animaux doivent être surveillés en permanence pour assurer un niveau adéquat d'anesthésie. A la vitesse de réaction respiratoire et pincement de l'orteil stables sont utilisés pour confirmer l'anesthésie appropriée.
- Après la profondeur de l'anesthésie appropriée est d'obtenired, placer le rat en décubitus dorsal sur une surface à température contrôlée est échoué situé sur la table pneumatique. La surface doit être préchauffé et maintenu à 36 ° C.
- Tout en maintenant la profondeur de l'anesthésie adéquate, faire une incision médiane d'environ 5 cm en ligne avec le rein.
- Utiliser un fil de suture pour dévier et ancrer le tissu cutané et sous-cutané de façon que l'ensemble du rein est visible. Placez le rein dans une tasse de rein de minimiser les artéfacts de mouvement.
- Utilisation d'une perfusion intraveineuse de 2% de BSA: 0,9% de NaCl à 1 ml / 100 g / h par la veine jugulaire pour maintenir le volume du sang. Cathétériser deux uretères pour la collecte d'urine. La place des liens autour des artères mésentériques et coeliaques supérieures et l'aorte distale pour la manipulation de la pression de perfusion rénale (figures 10A).
- Si l'application d'agents pharmacologiques est nécessaire pendant les expériences in vivo, l'insertion d'un cathéter interstitiel est recommandé (figures 10B
Configuration 3. Acquisition de données
- Ouvrez le programme d'acquisition de données et de définir sa polarité à la fois ex vivo et in vivo à des expériences anodique positive. Réglez le programme pour enregistrer les données sous forme de code ASCII.
- Placez les micromanipulateurs pour l'insertion rapide des capteurs dans les reins.
NOTE: Vous pouvez également utiliser une sonde fictive attaché à la micromanipulateur pour aider à atteindre le positionnement souhaité de capteurs. - Ex acquisition de données in vivo
- Perfuser le rein avec une solution de bain (de 2.1.6) par l'intermédiaire d'une canule de l'aorte à une vitesse constante de 650 ul / min. Avec des ciseaux chirurgicaux, retirez soigneusement la capsule rénale, qui est nécessaire pour l'insertion de la sonde.
- Fixez le rein avec des bandes de caoutchouc attachés sur le rein et attachés au plat enduit de silicone avec des épingles.
- Placez l'électrode de référence près de rein dans la boîte de Pétri avec sa pointe immergée dansla solution tampon.
- Dans l'acquisition de données in vivo
- Placez le rein dans une tasse de rein. Selon la souche et l'âge de l'animal utiliser une taille de tasse qui détient le rein lâche. La figure 8 montre deux tailles de tasses rénaux. Tasses similaires sont utilisés pour différentes approches physiologiques ont porté sur l'analyse de la fonction rénale, tels que microponction etc 16.
Remarque: La position de la coupe du rein est essentiel pour éliminer le bruit mécanique produite par la respiration des animaux, mais ne devrait pas interférer avec ou bloquer la perfusion rénale ou l'écoulement d'urine. - Comptez 45 min de temps de récupération avant d'effectuer la collecte de données.
- En utilisant une aiguille 26-30G, faire un trou de perforation à l'endroit désiré et la profondeur de la sonde dans le rein. Éponger le trou de surface pour enlever le sang exsudation. Ajouter une solution de glycerol à la surface du rein. Cela permettra d'éviter la surface de rein de sécher pendant l'expérience. Retirer le premier capteur de la chambre de réhydratation et l'attacher à la micromanipulateur. Rapidement, dans les 20 secondes, insérer l'électrode dans le trou fraîchement créé dans le rein. Répétez les étapes 3.5 à 3.9 pour le capteur nulle.
- Insérez l'électrode de référence dans le rein, d'environ 1 cm à partir des capteurs.
- Placez le rein dans une tasse de rein. Selon la souche et l'âge de l'animal utiliser une taille de tasse qui détient le rein lâche. La figure 8 montre deux tailles de tasses rénaux. Tasses similaires sont utilisés pour différentes approches physiologiques ont porté sur l'analyse de la fonction rénale, tels que microponction etc 16.
- Tournez sur le potentiostat et activer le programme d'enregistrement de l'ordinateur. La figure 9 montre la configuration finale de l'acquisition de données de rein ex vivo. La figure 10 montre la configuration finale de l'acquisition des données in vivo du rein avec un cathéter inséré.
Analyse des données 4.
- Importer le fichier de données ASCII dans origine ou de tout autre logiciel similaire.
- Concentration relation actuelle
- Utilisez la fonction ajustement linéaire / extrapoler pour construire une concentration linéaire (axe des x) en courant (axe des y) relation pour l'ATP ou H 2 2 d'étalonnage (Figures 6 et 7).
linéaire ligne d'ajustement: y = mx + b
- Utilisez la fonction ajustement linéaire / extrapoler pour construire une concentration linéaire (axe des x) en courant (axe des y) relation pour l'ATP ou H 2 2 d'étalonnage (Figures 6 et 7).
- Equate le courant de la concentration
- Soustraire les traces de mesure du capteur de zéro à partir de ceux de la sonde de l'ATP pour obtenir le courant réel produite par l'ATP intracellulaire.
- Convertir les valeurs de l'ATP en Pa obtenus par ampérométrie à nm en utilisant l'équation de calibrage décrite en 4.2.1. Déterminer la concentration de la trace de données soustrait du capteur ATP en important chaque courant ajusté dans la valeur "x" et de résolution pour y (la concentration de substance à analyser).
- De même, le calcul de la concentration de H 2 O 2 à partir de son équation d'étalonnage, si nécessaire.
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Representative Results
La conception de la microélectrode biocapteur enzymatique permet la détection en temps réel des analytes dans les reins entiers. La conception de l'expérience générale pour les ex vivo ou in vivo est illustrée à la figure 1 capteurs .Les utilisés et les procédures chirurgicales diffèrent selon que l'étude est ex vivo ou in vivo.
Pour obtenir des résultats reproductibles, précise pré et post étalonnages sont essentielles. La figure 6A montre une trace représentatif du signal vu par le capteur ex vivo de l'ATP au cours des étalonnages. Notez que apyrase rapidement éliminé du signal ATP. La catalase n'a eu aucun effet sur le signal ATP et démontre la spécificité de l'H 2 O 2 il crée (figure 6B). La procédure d'étalonnage produit un ajustement linéaire qui est utilisé pour calculer les changements dynamiques de l'ATP (figure 6A, panneau de droite). En viétalonnage du capteur vo produit une trace similaire à celle du capteur ex vivo. Cependant, ce capteur détecte réductrice à la place des courants oxydantes et en tant que tel le courant produit est négatif. Calibration de ces capteurs produit également un ajustement linéaire dans une plage de 0,3 à 80 um (figure 7A panneau de droite). Spécificité du capteur in vivo à l'ATP par rapport aux autres produits de la purine est représenté sur la figure 7B.
L'approche décrite ici nous permet de mesurer les deux niveaux de base de substances endogènes et changements aigus en réponse à la drogue perfusion 12. Les changements de concentration interstitielle endogène de H 2 O 2 dans les rats résistant au sel et le sel photosensible représenté sur la figure 11 sont Ang II-induite. Pour ces expériences, les reins fraîchement isolées à partir de Sprague Dawley (SD) ou (SS) Dahl rats sensibles au sel ont été perfuses avec 1 uM Ang II sous flux laminaire constant (650 pl / min). Comme shoWN à la figure 11, Ang II induit la libération aiguë de H 2 O 2 dans les reins de rats SD et SS. Cependant, l'amplitude maximale de chaque réponse a été significativement plus élevée chez les rats SS, en particulier lorsque les animaux ont été nourris avec un régime riche en sel 12. Représenté sur la figure 12 est une application représentant des biocapteurs in vivo. L'infusion de la catalase (5 ug / ml) bloque complètement le signal H 2 O 2 détectée par le capteur biologique. Ces expériences illustrent l'utilisation de biocapteurs enzymatiques spécifiques combinées avec la technique ampérométrique pour la détection des niveaux de base de substances endogènes et de mesures en temps réel de leur libération en réponse à une intervention pharmacologique. D'autres applications de cette approche pour étudier le rôle de la signalisation purinergique et le peroxyde d'hydrogène permettra d'améliorer notre connaissance et la compréhension de pathologies rénales comme l'hypertension sensible au sel, boeuf rénalele stress idative et de maladie rénale chronique.
Figure 1. Schéma des Protocoles. Calibrage avec analyte d'intérêt et de tester sa spécificité est faite immédiatement avant le début des expériences. Le protocole in vivo devrait être suivie pour des expériences physiologiques complexes et ex vivo pour les applications pharmacologiques. Calibration de l'expérience post devrait être fait et pris en compte lors de l'analyse de données. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Capteur enzymatique microélectrodes. Les deuxtailles de capteurs utilisés pour des applications ex vivo sont présentés, 50 um et 125 um diamètres. Chaque fil de la sonde pénètre dans un tube capillaire pour se connecter à un connecteur d'extrémité de l'or (non représenté). Encart montre une pointe de capteur revêtue d'enzymes pour la détection de l'ATP. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Double Potentiostat Channel. Les canaux de potentiostat marqués CH1 et CH2. 1) CH1 la connexion du capteur de l'ATP et 2) CH2 Le capteur connexion 3) connexions nulles qui sont couplés électriquement à l'électrode de référence. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 4. Configuration du capteur. L'acquisition de données est effectué dans une cage de Faraday pour réduire le bruit électrique et sur une table de laboratoire de haute performance pour une surface de travail exempt de vibrations. 1) Une table chirurgicale à température contrôlée est utilisé pour maintenir la température du corps de l'animal au cours d'expériences physiologiques 2) les micromanipulateurs sont attachés à des adaptateurs de montage magnétique pour un positionnement souple des capteurs lors de l'expérience 3) Une source de lumière est nécessaire pour les procédures chirurgicales et l'insertion du capteur 4 ) canal double potentiostat 5) de support pour les capteurs. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 5. Voltamétrie cyclique. Pour études ex vivo, capteur voltamétrie cyclique est effectuée pendant 10 cycles entre -0,5 et 0,5 V avant le protocole de calibration. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. Amperometry étalonnage pour ex vivo. (A) d'étalonnage utilise l'addition de concentrations d'ATP connus de la solution de bain. Les valeurs correspondantes ampérométriques enregistrées au niveau de l'asymptote (trace noire). Les courants obtenus à créer une équation d'étalonnage. Un exemple est montré sur le panneau droit. La trace rouge est la current Null du capteur qui réagit à la seule addition de H 2 O 2. (B) Le capteur Null est calibré avec l'ajout de H 2 O 2 connu concentrations (flèches rouges) à la solution de bain et les asymptotes valeurs ampérométriques sont enregistrées (minces flèches noires). Ajout de la catalase à la solution de bain (épaisseur de flèche noire) se traduit par décroissance du courant rapide. Le panneau de droite montre l'équation de calibrage du capteur Null. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7. Amperometry étalonnage pour;. In Vivo L'étalonnage du électrodes in vivo est effectué dans un mode similaire à celui détaillé dans les études in vivo, à l'exception ex réactions de réduction provoque un courant inverse (polarité). (A) L'ajout de concentrations connues ATP produit un courant ampérométrique sur le capteur de l'ATP (trace noire) mais n'a aucun effet sur le capteur Null (trace rouge). L'addition d'apyrase éteint le courant du capteur de l'ATP. (B) La spécificité de la sonde de l'ATP est confirmée par l'addition de 10 uM de différents agents purinergiques (UTP, UDP et adénosine). D'autres applications de l'ATP fournissent un courant ampérométrique détectable stable. (C) Microphotographie des capteurs in vivo basé sur un médiateur électrode enrobée d'or. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 8. Coupes de rein. Dans les études in vivo, les reins sont détenus encore en utilisant les inoxydable tasses de rein de l'acier indiquées. Deux tailles de tasses sont utilisés pour accueillir les reins variation de la taille. Ces coupes réduisent les artefacts de mouvement qui sont générés par la respiration de l'animal. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 9. ex vivo rein perfusé isolé et. Le rein isolé est placé dans un plat 1) Petri revêtue d'une épaisse sifond de licone pour broche insertion 2) l'artère rénale est canulée et attaché à une pompe à seringue pour perfusion constante au cours de l'expérience 3), le capteur d'ATP, 4) et le capteur Null sont insérés dans le rein 5) de l'électrode de référence est placée près du rein immergé dans la solution de bain. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 10. In Vivo sang rein perfusé. (A) Le rein gauche est exposé et placé dans une coupelle de reins, le rein droit reste intact à l'intérieur de l'animal. Les deux capteurs sont insérés dans le rein. BSA: NaCl est perfusé via la veine jugulaire cathétérisé pour contrecarrer la perte de liquide provoquée by le grand exemple à mi-ligne incision (B) de l'expérience in vivo avec un cathéter interstitielle implanté pour les applications pharmacologiques directs 1) le rein est détenu par un rein tasse 2) capteur ATP 3) capteur Null et 4) électrode de référence sont insérés dans la surface ventrale du rein 5) cathéter implanté dans le rein et attaché à une pompe péristaltique pour des infusions pharmacologiques laminaires. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 11. Analyse ex vivo de H 2 sub> O 2 dans le rein. Ang II perfusion provoque H 2 O 2 en sortie du cortex du rein du rat. (A) des changements en temps réel de la moyenne de H 2 O 2 de concentration (barres grises montrent erreur standard) sur un total de N = 8 applications (4 reins de rats 4 différentes). Des barres en haut représentent l'application Ang II. (B) Le H 2 O 2 maximale des valeurs de concentration d'amplitude pendant Ang II perfusion pour Sprague Dawley (SD) et (SS) rats sensibles au sel Dahl nourris avec un régime alimentaire riche en sel et faibles, respectivement. * - P <0,05 par rapport rats SD. Le chiffre est adapté de la référence 12 avec la permission. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 12. Analyse in vivo de H 2 O 2. Exemple de l'évaluation in vivo de H 2 O 2 interstitiel concentration dans la moelle d'un rat SS nourris avec un régime pauvre en sel (comme représenté sur la Figure 10B). L'application de la catalase interstitiel par l'intermédiaire d'un cathéter implanté à l'intervalle de 5 min a produit un blocage complet de l'H 2 O 2 de signal dans la médullaire rénale. Réduction de la catalase, de lavage par le flux sanguin rénal, a donné lieu à une reprise partielle du signal, qui a de nouveau été bloqué par une application catalase supplémentaire (10 min). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les présents protocoles ont été développés pour fournir une meilleure résolution temporelle et spatiale de l'ATP et de H 2 O 2 pour la signalisation des reins perfusés par le sang isolés ex vivo, et in vivo perfusé. Les différences entre les protocoles et les capteurs utilisés ici fournissent acquisition de données optimale pour soit des agents pharmacologiques ou des études physiologiques. Les protocoles sont constitués d'une) capteur étalonnage, 2) intervention chirurgicale, 3) l'installation d'acquisition de données, et 4) l'analyse des données. Ils permettent des mesures en temps réel de nombreux analytes pour des conditions expérimentales. Cela conduira à un meilleur aperçu des maladies du rein et le développement de traitements pharmacologiques plus efficaces. Ici, nous avons utilisé les capteurs pour analyser l'ATP et de H 2 O 2. Cependant, des capteurs pour d'autres substances sont également disponibles et peuvent être utilisés. Les protocoles décrits ici ont été appliqués à étudier ATP et H 2 O 2 dans les reins de rats, mais le même méthod peut facilement être ajusté pour une application chez la souris. Ainsi, cette approche a un grand potentiel compte tenu de l'abondance de modèles de rongeurs génétiques.
La conception de base de biocapteurs de microélectrodes enzymatiques a été développé dans les années 1960 par Clark et Lyons 2. Après le développement initial de biocapteurs, des progrès ont été réalisés dans la conception et les applications 20 17-19. Llaudet et al. 21,22 développé la conception de principe des capteurs ATP utilisés dans les présentes méthodes en utilisant des protocoles de Cosneir et al. 23 pour le revêtement de l'enzyme. Ces capteurs ont détecté la signalisation ATP dans un certain nombre de processus physiologiques, y compris la libération d'ATP des astrocytes du cerveau 8, la régulation de la respiration 4,24, et le muscle squelettique règlement artériole 25. Récemment, le protocole ex vivo a été utilisé pour mesurer la signalisation ATP dans les reins 12. Le but de ce manuscrit is de fournir des orientations et des idées efficaces pour la détection de substances endogènes tels que l'ATP dans les reins.
Biocapteurs enzymatiques de microélectrodes présentent de nombreux avantages sur les moyens existants pour mesurer des analytes in vivo. Cependant, des précautions particulières doivent être utilisés à cette approche que pour toute autre méthode nouvelle. Validation avec une approche établie donne confiance dans les données obtenues. Par exemple, les mesures de microdialyse ont été faites comme décrit précédemment 26,27. Aucune différence significative n'a été observée entre les concentrations maximales déterminées par les capteurs et celles obtenues à partir des échantillons de dialyse 12. La limitation de microdialyse est qu'il ne mesure les niveaux d'analyte à l'état stable. En tant que tel, l'évaluation des changements dynamiques dans la signalisation cellulaire ne peut être obtenue avec l'utilisation des biocapteurs enzymatiques de micro-électrodes. Les spécifications manufacture de temps de réponse du capteur diffèrent entre le capteurex vivo. types de capteurs ont un temps de 5 à 10 secondes et à des capteurs in vivo de 30 à 35 secondes pour la montée du signal de 10 à 90% de réponse. Les traces d'étalonnage (figures 6 et 7) montrent la résolution dans le temps de l'addition de l'analyte / l'enlèvement. Pour les capteurs et les deux approches microdialyse, l'utilisation d'enzymes spécifiques pour bloquer le signal produit par analytes est nécessaire pour assurer la spécificité.
Les protocoles décrits ont plusieurs défis. Comme avec toute insertion de la sonde dans le tissu, des dommages aux tissus ne se produit. Cela pourrait activer les voies de signalisation qui peuvent influencer les mesures 28. Pour minimiser les dommages de la cellule, des capteurs plus minces seraient nécessaires. Cependant, il est difficile de pénétrer dans la capsule du rein avec les capteurs de sorte aiguilles sont utilisées pour faire un petit trou d'entrée. Capteurs minces sont plus susceptibles de se plier et de perturber leur revêtement sur l'insertion. Capteurs de plus grand diamètre sont flexion plus résistant et le resultadommages nt à leur revêtement. La figure 3 montre un capteur mince et épaisse. En plus de la résistance du capteur d'épaisseur à la flexion, ils comprennent une couche plus épaisse de revêtement, en fournissant une protection accrue de la couche enzymatique. La préoccupation des dommages aux tissus causés par l'utilisation de capteurs d'épaisseur était beaucoup moins dans les reins à ce qu'elle serait dans le tissu cérébral. La profondeur d'insertion est approchée et le placement final devrait être vérifiée après des mesures sur le rein sont terminées. Estimation entre les couches du cortex et de la moelle en utilisant le capteur de longueur de la pointe comme un guide d'insertion et est suffisant que la pointe du capteur est de 0,5 mm et le cortex du rein est de 2-3 mm d'épaisseur. L'encrassement de la sonde se produit également à une vitesse supérieure dans le sang, ce qui limite l'utilisation du capteur en temps dans des protocoles in vivo pour une expérience. Les durées d'enregistrement de 1 à 1 ½ h abouti qu'à une petite dérive de la sonde. Les principaux critères pour évaluer la performance du capteur est réduite la faible sensibilitéà l'analyte au cours du processus d'étalonnage. Bruit électrique accrue et l'instabilité du courant de base peuvent aussi indiquer que la pointe du capteur est endommagé. Pour des mesures précises de l'ATP, les deux capteurs (ATP et NULL) doivent avoir des caractéristiques de bruit et de stabilité similaires en vue de la soustraction du signal. Dans le cas contraire, l'un des capteurs doivent être remplacés. Pour un faible bruit et la détection de faibles concentrations d'analyte, l'utilisation de nouveaux capteurs pour chaque animal est suggérée.
Plusieurs étapes sont cruciales pour les résultats expérimentaux réussis. Les capteurs sont très fragiles et doivent être manipulés avec précaution pour éviter d'endommager la pointe du capteur. En outre, après réhydratation, les capteurs ne doivent pas être exposées à l'air pendant plus de 20 s. Des enregistrements à faible bruit sont nécessaires pour la détection réussie de signaux biologiques dans les tissus. A cet effet, une table d'air de laboratoire de haute performance et de terre correcte est exigée. L'addition de quantités exactes de l'analyte durcompris les étapes d'étalonnage est nécessaire pour déterminer la concentration exacte dans les expériences. Parvenir à une bonne compensation du rein en ex vivo chirurgies rénaux se traduira par de bons enregistrements. L'utilisation d'enzymes apyrase et de la catalase dans les étalonnages et dans des expériences permet d'évaluer la sensibilité de capteur non spécifique et confirme les mesures.
Ces protocoles prévoient grandement améliorées détail de signalisation extracellulaire dans les reins. L'amélioration de la sensibilité et une résolution temporelle offerte par les capteurs peuvent nous permettre de résoudre des changements dans l'ATP de signalisation dans les états pathologiques et suivants manipulation pharmacologique qui étaient auparavant indétectable. Le protocole in vivo est bien adapté pour les études physiologiques complexes tout en ex vivo est optimal pour l'étude des applications pharmacologiques sur les reins. La conception du capteur in vivo utilisé ici permet une résistance sans précédent contre l'ingérence dans blood tissu perfusé. Pris ensemble, ces capteurs offrent une grande quantité d'applications qui étaient auparavant pas possible avec les protocoles et techniques existantes.
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Disclosures
Capteurs pour l'enregistrement vidéo de ce manuscrit ont été fournis par Sarissa Biomedical Limited (Coventry, Royaume-Uni).
Acknowledgments
Nous apprécions Sarissa biomédicale pour leur travail dans le développement des capteurs utilisés dans le présent manuscrit. Cette recherche a été financée par le National Heart, Lung, and Blood Institute accorde HL108880 (A. Staruschenko), HL 116264 (A. Cowley) et HL 122662 (A. Staruschenko et A. Cowley), un projet financé par le Medical College of Comité des affaires recherche Wisconsin # 9306830 (O. Palygin) et de faire progresser un programme de recherche et d'enseignement sain Wisconsin # 9520217, et le Young Investigator Grant de la National Kidney Foundation (O. Palygin).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sensor Kit | Sarissa Biomedical | SBK-ATP-05-125 | The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes. Also included with the kit is the user's choice of sensors. |
| Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-ATP-05-125 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissagold ATP Biosensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-ATP-10-50 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissaprobe null sensor 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-NUL-20-125 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissagold null sensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-NUL-10-50 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissaprobe ATP Manual | Sarissa Biomedical | http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf | |
| Faraday cage | TMC | ||
| Dual channel potentiostat | Digi-Ivy | DY2021 | Type II Faraday cage |
| Data acquisition program | Digi-Ivy | DY2000 | |
| Perfusion pump | Razel Scientific Instruments | Model R99E | |
| Fiber optic illuminator | Schott | ACE 1 | |
| micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| micromanipulator magnetic stand | Narishige | GJ-8 | |
| air table | TMC | 63-500 | |
| isoflurane ventilator | LEI Medical | M2000 | |
| 3 ml petri dish | Fisher Scientific | S3358OA | |
| needle | Santa Cruz | 26-30 G | |
| pins | Standard dissection pins | ||
| catheter | Polyethylene tubing (PE50) | ||
| catheter tissue glue | Vetbond | 1469SB | |
| suture | Look | SP117 | |
| rubber bands | any 2-4 mm wide rubber bands | ||
| silicone | Momentive | RTV-615 Clear 1# | |
| clamp | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| standard dissection kit | Kit should include scalpel and dissection sissors | ||
| Kidney Cup | Of own design | ||
| standard chemicals | Sigma-Aldrich | ||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | 100 mM ATP solution |
| hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A7646 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| isoflurane | Clipper | 10250 | |
| inactin | Sigma-Aldrich | T133 | |
| ketamine | Clipper | 2010012 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 |
References
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