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जनरेशन और स्पंदित कम आवृत्ति अल्ट्रासाउंड के मात्रात्मक विश्लेषण नियोप्लास्टिक कोशिकाओं इलाज की ध्वनि संवेदनशीलता का निर्धारण और इलाज के लिए

Published: July 22, 2015 doi: 10.3791/53060
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Syracuse University

Introduction

अल्ट्रासाउंड मानव श्रवण क्षमता की ऊपरी सीमा से अधिक आवृत्ति (~ 20 किलोहर्ट्ज़) 1 के साथ किसी भी दोलन ध्वनि दबाव लहर को दर्शाता है। 20-60 kHz के रेंज में कम आवृत्ति अल्ट्रासाउंड ऊतक विघटन के लिए, न्यूक्लिक एसिड निकासी के लिए सेलुलर नमूने की तैयारी, emulsions पैदा करने का एक साधन के रूप में प्रयोगशाला में उपयोग किया है, और अन्य परीक्षणों की एक किस्म के लिए किया गया है। कम आवृत्ति अल्ट्रासाउंड की उपयोगिता भी विभिन्न सामग्रियों की सफाई, वेल्डिंग के लिए औद्योगिक सेटिंग के लिए बढ़ा दिया, और सामग्री प्रसंस्करण में किया गया है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अल्ट्रासाउंड जनरेटर 100-1,200 डब्ल्यू से wattages 18-60 kHz से लेकर आवृत्तियों में आते हैं, और पूर्ण पैमाने पर

अल्ट्रासाउंड लंबे नैदानिक ​​इमेजिंग के लिए नैदानिक ​​सेटिंग में इस्तेमाल किया गया है, यह केवल हाल ही में एक चिकित्सकीय साधन के रूप में लागू किया गया है। अल्ट्रासाउंड ≥1 मेगाहर्ट्ज वीं में सुरक्षित रूप से मूत्र पथरी (गुर्दे की पथरी) और पित्त पथरी में खलल न डालें (पत्थर के लिए सक्षम हैरोगियों में ई पित्ताशय की थैली या जिगर में) लक्षण 2,3 कम करने के लिए। एक्स्ट्रा Shockwave Lithotripsy (ESWL) के रूप में जाना जाता है यह दृष्टिकोण अब व्यापक रूप से क्लिनिक (एक लाख से अधिक रोगियों को संयुक्त राज्य अमेरिका अकेले में ESWL साथ सालाना 4 इलाज कर रहे हैं) में आवेदन किया है, और एक साधन प्रदान करता है जिसके द्वारा गैर invasively साथ कैलकुली को तोड़ रहा है बाहर से लागू, ध्यान केंद्रित, उच्च तीव्रता ध्वनिक दालों 2-4 के उपयोग के माध्यम से कम से कम जमानत के नुकसान।

कारण उच्च तीव्रता अल्ट्रासाउंड द्वारा उत्पन्न अद्वितीय प्रत्यक्ष बाल काटना बलों, साथ ही cavitation बुलबुले के लिए, इन तरीकों उच्च तीव्रता के रूप में जाना एक दृष्टिकोण में बधिया प्रतिरोधी प्रोस्टेट कार्सिनोमा और अग्नाशय ग्रंथिकर्कटता के इलाज के लिए कैंसर के उपचार में जांच की गई है अल्ट्रासाउंड ध्यान केंद्रित (HIFU ) 5-8। ESWL करने के लिए बहुत समान तरीके से, HIFU कई अल्ट्रासाउंड मुस्कराते हुए उपयोग करता है और 60 डिग्री सेल्सियस या hig के तापमान उत्पन्न करने के लिए एक चयनित फोकल क्षेत्र पर उन्हें अपना ध्यान केंद्रितउसके लक्षित ऊतक 5 में coagulative नेक्रोसिस उत्प्रेरण ध्वनिक ऊर्जा के उपयोग के माध्यम से। थर्मल पृथक की अन्य रूपरेखा वर्तमान में (रेडियोफ्रीक्वेंसी पृथक और माइक्रोवेव पृथक) मौजूद हैं, HIFU यह केवल गैर इनवेसिव hyperthermic साधन 5 में है कि इन तरीकों पर एक विशिष्ट लाभ प्रदान करता है। HIFU क्लिनिक में मिश्रित परिणाम प्राप्त कर ली है और वर्तमान में क्लिनिकल परीक्षण 8-11 में ही उपलब्ध है। फिर भी, यह हासिल किया है सीमित सफलता, और preclinical स्तनधारी मॉडल से प्राप्त कर लिया विवो डेटा में बहुत ही होनहार कैंसर के उपचार में अल्ट्रासाउंड की क्षमता का प्रदर्शन किया है।

HIFU सुधार करने के प्रयास में, शोधकर्ताओं ने sonochemotherapy के एक फार्म उत्पन्न करने के लिए उपयुक्त Antineoplastic एजेंटों के साथ अल्ट्रासाउंड गठबंधन करने का प्रयास किया है। Sonodynamic थेरेपी (SDT) इन विट्रो में और दोनों में प्रभावशाली Antineoplastic गतिविधि का प्रदर्शन किया है कि एक होनहार उपन्यास उपचार के साधन है 1। यह नुकसान को प्राथमिकता ऐसी कोशिकाओं और सामान्य ऊतक विज्ञान 1,5 के उन लोगों के बीच आकार अंतर के आधार पर घातक कोशिकाओं कि अल्ट्रासाउंड दिखाया गया है। SDT नियोप्लास्टिक कोशिकाओं के खिलाफ अल्ट्रासाउंड द्वारा लगाए जाने वाले तरजीही क्षति की सीमा को बढ़ाने के लिए sonosensitizers के रूप में जाना विशेष एजेंटों को शामिल किया गया। SDT की चिकित्सीय अनुप्रयोगों पहले से जांच की गई है, वहीं इस्तेमाल किया अल्ट्रासोनिक प्रणाली आम तौर पर उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड (≥1 मेगाहर्ट्ज) को रोजगार, और कम kHz आवृत्ति अल्ट्रासाउंड के प्रभाव को अभी तक पूरी तरह से पता लगाया जा चुका है। अल्ट्रासाउंड के कम आवृत्तियों के कारण भौतिक क्षति 12-14 उत्प्रेरण microbubbles का तेजी से गिर करने के लिए अक्सर जड़त्वीय cavitation, कोशिकाओं के विनाश में परिणाम है कि एक घटना के उत्पादन में और अधिक कुशल हैं। मेगाहर्ट्ज और कम किलोहर्ट्ज़ अल्ट्रासाउंड के बीच जड़त्वीय cavitation की पीढ़ी में यह अंतर कम लहर आवृत्तियों microbubble सक्षम तथ्य यह है कि जिम्मेदार ठहराया गया हैनिम्नलिखित संपीड़न आधा चक्र 12 के दौरान फलस्वरूप अधिक हिंसक गिर उत्पादन, विस्तार आधा चक्र में सुधारा प्रसार द्वारा विकसित करने के लिए और अधिक समय है।

हम पहले U937 मानव monocytic ल्यूकेमिया कोशिकाओं कम आवृत्ति अल्ट्रासाउंड (23.5 kHz) के प्रति संवेदनशील हैं कि पता चला है, और कहा कि इस संवेदनशीलता स्पष्ट रूप से cytoskeleton 15 उपद्रव कि Antineoplastic एजेंटों के आवेदन के माध्यम से बढ़ाया जा सकता है। इसके अलावा, हम कोशिकाओं को प्राथमिकता उच्च अल्ट्रासोनिक संवेदनशीलता का प्रदर्शन बड़े कोशिकाओं के साथ, आकार के आधार पर क्षतिग्रस्त हो रहे हैं कि प्रदर्शन किया है। इसके अलावा, तुलनीय सेल आकार में सामान्य मानव hematopoietic स्टेम कोशिकाओं (hHSCs) और ल्यूकोसाइट्स अंतरिम रूप से कम आवृत्ति अल्ट्रासाउंड को प्राथमिकता सामान्य ऊतकों की उपस्थिति में घातक कोशिकाओं को नुकसान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, सुझाव है कि उनके नियोप्लास्टिक समकक्षों के 15 की तुलना में sonication के लिए बहुत अधिक प्रतिरोधी रहे हैं।

आगे अद्वितीय सहारा की जांच करने के लिएसंभावित चिकित्सीय उपयोग के लिए कम आवृत्ति अल्ट्रासाउंड के erties, हम अपने वर्तमान sonication के प्रणालियों में से एक की प्रभावकारिता और विश्वसनीयता बढ़ाने के लिए साफ सफाई और स्थिरीकरण प्रक्रियाओं को विकसित किया है, एक 20 मिमी सींग के साथ सुसज्जित ब्रैनसन मॉडल SLPe 150 डब्ल्यू, 40 किलोहर्ट्ज़ सेल disrupter, फिट एक 7.62 सेमी कप में। इसके अलावा, हम हाइड्रोफ़ोन के साथ एक cavitation मीटर और आस्टसीलस्कप का उपयोग 40 किलोहर्ट्ज़ सीमा के भीतर सटीक नमूना गुहिकायन ऊर्जा है, साथ ही लगातार waveforms और आयाम निर्धारित करने में सक्षम किया गया है। रिफाइनिंग और हमारे प्रोटोकॉल systematizing करके, हम हमें मात्रात्मक अलग histogenetic प्रजातियों के नियोप्लास्टिक और सामान्य कोशिकाओं की ध्वनि संवेदनशीलता की तुलना करने की अनुमति देता है, हमारे प्रयोगात्मक sonications में स्थिरता स्थापित करने में सक्षम किया गया है। 40 किलोहर्ट्ज़ प्रणाली के लिए हमारी प्रोटोकॉल रुचि प्रयोगशालाओं के लिए आदेश तुलनीय प्रयोगों प्रदर्शन करने में सक्षम होने के लिए, और द्वारा हासिल Antineoplastic प्रभाव से हमारे निष्कर्ष का मूल्यांकन करने में व्यापक विस्तार से प्रस्तुत किया हैकम आवृत्ति अल्ट्रासाउंड। (; चित्रा 1 MeβCD), एक कोलेस्ट्रॉल घट एजेंट, U937 की अल्ट्रासोनिक संवेदनशीलता और THP1 मानव monocytic ल्यूकेमिया कोशिकाओं को बढ़ाने पर इसके अतिरिक्त, हम मिथाइल-β-cyclodextrin की खुराक निर्भर प्रभाव की जांच।

Protocol

1. सफाई सेल sonifier सिस्टम

  1. सींग और कनवर्टर का उपयोग क्लोरोफॉर्म और कपास की एक झाड़ू के बीच संघ साफ करें। आगे धातु छीलन, जंग, या ऑक्सीकरण के buildup को दूर करने के सींग और कनवर्टर के धागे के लिए एक प्रकाश का तेल या खनिज तेल लागू करें।
  2. तेल के साथ धागे पोंछते के बाद संघ से तेल और किसी भी अन्य contaminants को दूर करने के लिए क्लोरोफॉर्म का प्रयोग करें।

2. सेल sonifier reassembling और प्रणाली की स्थापना

  1. कनवर्टर करने के लिए सींग पुनः अनुलग्न। ठीक से व्यवस्था टोक़, कप (2A चित्रा) के नीचे से बाहर सींग खींच कर कप विधानसभा से इकट्ठे कनवर्टर और सींग हटा दें। कनवर्टर (चित्रा 2 बी) के शीर्ष के पास तीन छोटे छेद में से एक के अंदर एक स्लॉट रिंच रखें। फिर, सींग (चित्रा 2 बी) के slotted ओर से एक आधा इंच कौवा पैर के साथ लगे एक टोक़ रिंच की स्थिति। एस में कसोटोक़ मीटर 54.23 एन पढ़ता है जब तक घड़ी की दिशा tandard। एम (चित्रा -2), निर्माता 16 से सिफारिश टोक़। कड़ा कनवर्टर फ़िट और वापस कप में सींग, और एक ईमानदार स्थिति में एक अंगूठी खड़ा करने के लिए सींग और कनवर्टर माउंट। प्रयोगात्मक नाड़ी खुराक के लिए प्रणाली स्थापित करने से पहले बिजली की आपूर्ति करने के लिए कनवर्टर पुनः अनुलग्न।
  2. दालों के बीच 1 सेकंड के साथ sonication के 1 सेकंड का उपयोग कर पल्स खुराक के लिए प्रणाली स्थापित। विभिन्न खुराक मॉडल अन्य प्रयोगात्मक शर्तों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ऐसे में पानी की मात्रा और सींग व्यास के रूप में कई चर, संभवतः इस खुराक में परिवर्तन की आवश्यकता होगी। इस aforementioned सेल नमूना प्रकार, मात्रा और एकाग्रता का उपयोग करना, अनुभवजन्य डेटा और प्रेक्षण इस खुराक आहार के निर्माण के लिए नेतृत्व किया है।
  3. वांछित आयाम करने के लिए प्रणाली को समायोजित करें। इस प्रोटोकॉल में, sonosensit की प्रभावकारिता प्रस्तुत करना होगा जो पूरा सेल विनाश को रोकने के लिए 33% और 50% आयाम का उपयोगमुश्किल या असंभव izers गेज करने के लिए।
    नोट: आयाम तुलना कर रहे हैं इस अध्ययन में।

3. सिस्टम तीव्रता और फंक्शन का आकलन

  1. नमूना sonication के स्तर पर है, जो 1.5 सेमी, पर गुहिकायन मीटर पकड़ो। प्रणाली एक उम्मीद की तीव्रता में चल रहा है जो आकलन करने के लिए रीडिंग नोट करें। मौजूदा प्रणाली और जल स्तर का उपयोग करना, 100-110 डब्ल्यू / 33% आयाम और 115-125 डब्ल्यू / 50% आयाम के लिए 2 सेमी के लिए 2 सेमी के बीच की उम्मीद है। सीधे डब्ल्यू / 2 सेमी में cavitation ऊर्जा का प्रतिनिधित्व करता है जो मीटर प्रदर्शन से गुहिकायन मीटर रीडिंग नोट करें। पानी की सतह पर इन रीडिंग ले लो, और कोई बुलबुले मीटर जांच के चेहरे पर मौजूद हैं सुनिश्चित करते हैं।
    नोट: यह इन प्रक्रियाओं के सींग से ऊपर पहुँच के लिए टोपी के बिना किया जाता है कि नोट के लिए महत्वपूर्ण है। वे हर sonication के बाद दोहराया जा जरूरत नहीं है। बल्कि, वे ही, सफाई reassembling, और प्रणाली स्थापित करने के बाद किया जाना चाहिए। पूरी तरह से हाइड्रोफ़ोन संवेदक को विसर्जित करने के क्रम में पानी की 12.5 मिलीग्राम से युक्त एक नमूना शीशी में हाइड्रोफ़ोन रखें। अंगूठी स्टैंड का उपयोग कर हाइड्रोफ़ोन निलंबित।
  2. तरंग विशेषताओं का आकलन करने के क्रम में आस्टसीलस्कप के इनपुट के लिए हाइड्रोफ़ोन संलग्न। न्यायपालिका लहरों निर्माता की विशिष्टताओं से प्रणाली की आवृत्ति को बदल सकते हैं, के रूप में एक स्पष्ट साइन लहर के लिए आस्टसीलस्कप जांच करते हैं। गुहिकायन मीटर और आस्टसीलस्कप दोनों एक दोषपूर्ण प्रणाली या अनुचित विधानसभा का संकेत कर रहे हैं कि न्यायपालिका लहरों दिखाएगा एक आवृत्ति पढ़ना, लेकिन केवल आस्टसीलस्कप दे।

कोशिकाओं और मध्यम 4. तैयारी

  1. 240 मिलीलीटर Iscove संशोधित Dubecco के मध्यम (IMDM) और 50 मिलीलीटर भ्रूण गोजातीय सीरम का उपयोग करके मध्यम तैयार करें। तापमान में तेजी से बढ़ सीरम स्थिरता में एक समझौता करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, के रूप में एक गर्म पानी से स्नान में भ्रूण गोजातीय सीरम गल न करें। Μl gentamicin 50 मिलीग्राम / एमएल 240 और 5 मिलीलीटर पेनिसिलिन जुडा/ एक मानक संस्कृति फ्लास्क में 100x स्ट्रेप्टोमाइसिन, और मध्यम करने के लिए जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम स्टोर।
  2. बीज U937 कोशिकाओं पर ~ 4 एक्स 10 तैयार माध्यम का उपयोग कर एक 25 सेमी 2 फ्लास्क में 4 कोशिकाओं / एमएल। एक TC20 सेल काउंटर का उपयोग एकाग्रता और व्यवहार्यता के लिए कोशिकाओं का आकलन करें और एक सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब में कोशिकाओं और 15-20 μl trypan नीले रंग की 15-20 μl रखने और सामग्री के मिश्रण से नीले बहिष्कार trypan। Pipette15-20 एक TC20 नमूने स्लाइड में इस मिश्रण के μl, और TC20 सेल काउंटर में स्लाइड रखकर मायने रखता आरंभ करें।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को सेते हैं, और trypan नीले बहिष्कार और TC20 सेल काउंटर का उपयोग सेल व्यवहार्यता के लिए जाँच करें। कोशिकाओं को एक उपयुक्त एकाग्रता में कर रहे हैं और / या एक उचित समय सीमा के लिए sonosensitizers, स्थानांतरण एक 20 मिलीलीटर कांच जगमगाहट शीशी संस्कृति कुप्पी से कोशिकाओं के 3 मिलीलीटर के साथ इलाज किया गया है जब। इस प्रोटोकॉल में, 48 घंटा के लिए U937 कोशिकाओं के विकास, और उसके बाद 0.5, 1 के साथ व्यवहार,या 30 मिनट के लिए 5 मिमी MeβCD पर्याप्त sonication के लिए पूर्व कोशिकाओं के कोलेस्ट्रॉल व्यय करना।

5. सेल Sonication

  1. देगास, विआयनीकृत एक निर्वात और BUCHNER कुप्पी का उपयोग कर पानी आसुत। कप सींग करने के लिए जल अंतरण, और सींग के ऊपर से ऊपर 15 मिमी के स्तर तक भरें। sonication के प्रक्रिया में कुछ मिनट की अवधि के लिए पानी की आगे की degassing के कारण बनता है, और इस प्रणाली sonication के नमूने के लिए पूर्व चलाने के लिए नहीं है, तो प्रयोग के दौरान अधिक विसंगतियां पैदा कर सकते हैं। इसलिए, sonication के नमूने के लिए पूर्व ~ 7 मिनट के लिए प्रणाली चला रहे हैं।
  2. होल्डिंग डिवाइस के लिए कोशिकाओं से युक्त जगमगाहट शीशी संलग्न। फिर, कप सींग के शीर्ष पर पकड़े डिवाइस देते हैं और (स्लाइडिंग तंत्र का उपयोग कर पानी की सतह पर) सींग के ऊपर से 15 मिमी की ऊंचाई करने के लिए निर्धारित किया है।
  3. कोशिकाओं आम तौर पर 1 सेकंड इन दालों में से प्रत्येक के बीच में अंतर के साथ, अल्ट्रासाउंड के तीन 1 सेकंड दालों का प्रयोग sonicated कर रहे हैं। इसके लिएप्रोटोकॉल, उपरोक्त नाड़ी खुराक का उपयोग कर 33% और 50% आयाम पर sonicate कोशिकाओं।

6. नुकसान पोस्ट-sonication के लिए कोशिकाओं का आकलन

  1. Trypan नीले और TC20 सेल काउंटर का उपयोग नुकसान और व्यवहार्यता के लिए निलंबित कर दिया कोशिकाओं का आकलन करें। इसके अलावा, एक Z2 के काउंटर का उपयोग नमूना विश्लेषण। (: 1 के अनुपात 200) Z2 के काउंटर विश्लेषण के लिए, 20 मिलीलीटर आइसोटोनिक खारा में एक 100 μl सेल निलंबन विंदुक। विश्लेषण करने से पहले, isotonic खारा का उपयोग कम से कम दो बार Z2 के कण विश्लेषक के एपर्चर फ्लश। काउंटर धारक में Z2 के नमूना, जगह और गिनती की शुरुआत से पहले एपर्चर करने के लिए मंच बढ़ा।
  2. निर्माता द्वारा प्रदान की सॉफ्टवेयर का उपयोग कर TC20 और Z2 के काउंटरों से डेटा का मोल। सेल की क्षति, व्यवहार्यता, और sonication से सेलुलर मलबे के निर्माण के लिए इन आंकड़ों का विश्लेषण करें।

7. XTT परख सेल व्यवहार्यता का निर्धारण और इलाज U937 और THP1 प्रकोष्ठों के Mitochondrial गतिविधि के लिए

  1. PRIOXTT assays के लिए आर, एक ही परिस्थितियों में U937 और THP1 कोशिकाओं को विकसित। पूर्व sonication के लिए 30 मिनट के लिए MeβCD का एक ही एकाग्रता रेंज के साथ कोशिकाओं pretreat। कोशिकाओं को अब 1-3 एक सेकंड दालों की एक श्रृंखला का उपयोग sonicated कर रहे हैं, सिवाय इसके कि पहले की तरह ही अल्ट्रासाउंड मापदंडों का उपयोग का आकलन करने के XTT किट के लिए क्षति की एक श्रृंखला विकसित करने के लिए एक सेकंड के अलावा दूरी।
    नोट: इन कदमों से कई XTT किट पुस्तिका से सीधे लिया जाता है और केवल रुचि प्रयोगशालाओं की सुविधा के लिए दोहराया जाता है।
  2. 10 मिनट के लिए 200 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा। मध्यम विकास में Resuspend सेल गोली पहले से वर्णन किया। ~ 1 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल Resuspend कोशिकाओं। तो 100 तीन प्रतियों में एक-फ्लैट नीचे 96 अच्छी तरह से microtiter प्लेट में अच्छी तरह से प्रति μl, और कम से बीज U937 कोशिकाओं को एक अलग 96 अच्छी तरह से थाली का उपयोग कर THP1 कोशिकाओं के लिए दोहराएँ। पूरा मध्यम विकास के रूप में अकेले खाली absorbance के रीडिंग के 100 μl युक्त 3 नियंत्रण कुओं को शामिल करें। फिर, 2 के लिए टीका प्लेटें सेते4 घंटे।
  3. XTT अभिकर्मक और उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर सक्रियण अभिकर्मक के दो aliquots के Defrost। भंवर aliquots धीरे स्पष्ट समाधान प्राप्त कर रहे हैं जब तक। एक 96 अच्छी तरह से microtiter प्लेट परख के लिए काफी सक्रिय XTT समाधान जो रूपों XTT अभिकर्मक, 5.0 मिलीग्राम के लिए सक्रियण अभिकर्मक के 0.1 मिलीलीटर जोड़ें। अन्य प्लेट के लिए प्रक्रिया को दोहराएं।
  4. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए सक्रिय-XTT समाधान के 50 μl जोड़ें। 2 घंटे के लिए सेल संस्कृति सीओ 2 इनक्यूबेटर करने के लिए थाली लौटें। धीरे समान रूप से सकारात्मक कुओं में नारंगी रंग वितरित करने के लिए ऊष्मायन अवधि के बाद थाली हिला। एक microtiter प्लेट रीडर का उपयोग 450-500 एनएम तरंगदैर्ध्य के बीच एक तरंग दैर्ध्य में कोशिकाओं से युक्त परख कुओं और खाली पृष्ठभूमि नियंत्रण कुओं की absorbance के उपाय।
  5. या तो खाली नियंत्रण कुओं का उपयोग कर microtiter प्लेट पाठक शून्य या विशिष्ट परिणामों से उनकी औसत मूल्य घटाना। एक waveleng पर फिर से सभी परख कुओं की absorbance के उपायवें 630-690 एनएम के बीच और प्राप्त 450-500 एनएम मूल्यों से मूल्यों को घटाना। नोट: यह दूसरा absorbance के दृढ़ संकल्प परख परिणामों से गैर विशिष्ट रीडिंग को खत्म करने में मदद करता है। XTT परख दोनों सेल लाइनों के लिए चार बार दोहराया गया था।

Representative Results

सिस्टम स्थिरता repeatable और विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने में सर्वोपरि है। 54.23 एन एम। के समुचित टोक़ विनिर्देश 3B चित्रा नमूना शीशी के अंदर माप दर्शाया गया है। तरंग की स्थिरता एक आस्टसीलस्कप और हाइड्रोफ़ोन (चित्रा 3) के उपयोग के माध्यम से मूल्यांकन किया जा रहा है, ट्रांसड्यूसर और sonotrode 2 के समुचित युग्मन हासिल की है, और चित्रा -3 सी कप सींग भीतर स्थिरता का आकलन है। जैसी कि उम्मीद थी कुछ ऊर्जा के लिए कांच के द्वारा अवशोषित होने के कारण, आयाम से थोड़ा कम हो गया था। हालांकि, तरंग परेशान या नमूना करने के लिए ध्वनि ऊर्जा के विश्वसनीय प्रसव के लिए आवश्यक है, जो या तो पैनल बी या सी में विकृत नहीं किया गया था। एक स्पष्ट विलक्षण साइन लहर के रूप में प्रकट नहीं होता है कि एक तरंग एक दोषपूर्ण ट्रांसड्यूसर या अनुचित सेटअप इंगित करता है। यह कई न्यायपालिका तरंगों से पता चलता है जो चित्रा 3 डी, एक साइन लहर का स्पष्ट अभाव में व्यक्त किया जाता है, और एक आवृत्ति कोई पढ़नेटी एक ठीक से कार्य प्रणाली के साथ होने की उम्मीद है। गुहिकायन ऊर्जा उत्पन्न (चित्रा 4) को मापने के लिए इस्तेमाल किया गुहिकायन मीटर 100-110 डब्ल्यू / 33% आयाम में 2 सेमी, और 125-130 डब्ल्यू / 50% आयाम में 2 सेमी होना करने के लिए ध्वनि तीव्रता पाया।

40 किलोहर्ट्ज़ प्रणाली उचित समायोजन और अपनी संपूर्णता (चित्रा 5) में इकट्ठा किया गया था एक बार दोनों TC20 और Z2 के काउंटरों (चित्रा 6) द्वारा निर्धारित किया जाता है, के रूप में विश्वसनीय सेल विनाश आसानी से प्राप्त कर ली गई थी। जैसी कि उम्मीद थी, और अधिक व्यापक कोशिका क्षति नहीं बल्कि 33% आयाम पर, की तुलना में 50% से कम sonicated सेल आबादी में मनाया गया। फिर भी, 33% आयाम यह ध्यान देने योग्य क्षति पैदा करता है, के रूप में प्रशासित एजेंटों के संभावित ध्वनि संवेदनशील प्रभाव का पता लगाने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में उपयोगी है, लेकिन एजेंट अल्ट्रासोनिक संवेदनशीलता के अपने potentiation का आकलन करने के लिए लागू कर रहे हैं, जब और अधिक नुकसान का पता लगाया जा करने के लिए कमरे में छोड़ देता है। यह आंकड़ा 7A, में प्रदर्शन किया है जहांU937 कोशिकाओं की अल्ट्रासोनिक संवेदनशीलता potentiating पर MeβCD की खुराक निर्भर प्रभाव प्रस्तुत कर रहे हैं। गैर sonicated MeβCD इलाज कोशिकाओं गैर sonicated, इलाज कोशिकाओं के लिए व्यवहार्यता में बहुत समान थे, व्यवहार्यता स्पष्ट रूप से लागू किया गया था 1 सेकंड में 40 किलोहर्ट्ज़ अल्ट्रासाउंड के तीन दालों के बाद छोड़ दिया। इसके अलावा, sonication के बाद व्यवहार्यता में कमी 5 मिमी MeβCD सबसे बड़ी 1 मिमी द्वारा पीछा कोशिकाओं की संख्या में गिरावट, और फिर 0.5 मिमी MeβCD उत्पादित, के रूप में निर्भर खुराक किया गया है प्रकट होता है।

सेल व्यवहार्यता और mitochondrial गतिविधि पर समान प्रभाव XTT किट (चित्रा 7B) के साथ मूल्यांकन के रूप में, पूर्व sonication के लिए MeβCD के अलग सांद्रता के साथ इलाज किया गया है कि दोनों U937 और THP1 कोशिकाओं में मनाया गया। THP1 कोशिकाओं U937 कोशिकाओं की तुलना में प्रतिरोधी थोड़ा अधिक ध्वनि होना दिखाई देते हैं, दोनों मानव ल्यूकेमिया लाइनों एक खुराक निर्भर तरीके से क्षतिग्रस्त हो रहे हैं। MeβCD के उच्च सांद्रता और अल्ट्रासाउंड उत्पादों की अधिक दालोंसेल व्यवहार्यता और mitochondrial गतिविधि को कम करने के लिए इसी U937 और THP1 कोशिकाओं दोनों के लिए एक घुलनशील, चमकीले रंग नारंगी व्युत्पन्न करने XTT की सबसे कम कमी uced।

चित्र 1
Methyl- β-cyclodextrin चित्रा 1. आणविक संरचना। (ए) मिथाइल-β-cyclodextrin (MeβCD) की पूरी संरचना। (बी) MeβCD एच या सीएच 3 या तो एक अनुसंधान समूह के साथ सात दोहरा इकाइयों के एक बहुलक है। आणविक फार्मूला: सी 56 एच 98 हे 35। आण्विक वजन = 1,331.36।

चित्र 2
चित्रा 2. ठीक 40 किलोहर्ट्ज़ अल्ट्रासाउंड प्रणाली torqueing। (ए) के सींग और कनवर्टर कप प्राथमिक से हटा रहे हैंया torqueing करने के लिए। (बी) उनके संबंधित पदों पर स्लॉट रिंच और टोक़ रिंच स्थिति। (सी) कप के लिए सींग और कनवर्टर reattaching से पहले एक घड़ी की दिशा में टोक़ के 54.23 एन। एम लागू करें।

चित्र तीन
अल्ट्रासोनिक प्रणाली की तरंग चिह्नित करने के लिए एक आस्टसीलस्कप के 3. उपयोग चित्रा। (ए) हाइड्रोफ़ोन के साथ एक आस्टसीलस्कप आयाम और तरंग स्थिरता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। (बी) एक रिकॉर्डिंग 1.5 सेमी पर सीधे सींग से ऊपर कप के साथ लिया जाता है और 33% आयाम पर निर्धारित किया है। (सी) यहाँ चित्र तरंग हाइड्रोफ़ोन 20 मिलीलीटर कांच जगमगाहट शीशी के भीतर रखा जाता है जब हासिल कर ली एक पढ़ने से है। शीशी सींग से ऊपर 1.5 सेमी में तैनात है और फिर से 33% आयाम पर सेट किया जाता है। (डी) एक आस्टसीलस्कप स्क्रीनशॉट ओएक दोषपूर्ण प्रणाली या सींग कनवर्टर संघ के अनुचित युग्मन के साथ उम्मीद की होगी न्यायपालिका आवृत्तियों के साथ एफए प्रणाली। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
एक cavitation मीटर की चित्रा 4. उपयोग अल्ट्रासोनिक प्रणाली की ध्वनि तीव्रता चिह्नित करने के लिए। यहाँ देखा गुहिकायन मीटर डब्ल्यू / 2 सेमी में cavitation ऊर्जा का प्रतिनिधित्व करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इस नमूने के लिए सम्मान के साथ ऊर्जा की स्थिरता का आकलन करने के लिए एक बहुत ही महत्वपूर्ण साधन है।

चित्रा 5
40 किलोहर्ट्ज़ अल्ट्रासाउंड प्रणाली की चित्रा 5 प्रमुख घटक। अल्ट्रासोनिक प्रणाली कप सींग के साथ पूरा दिखाया गया है ( (बी), कनवर्टर (सी), और नमूना पोजीशनिंग तंत्र (डी)। इस डिजाइन सींग (एफ) के ऊपर नमूना (ई) की आसान स्थिति के लिए अनुमति देता है।

चित्रा 6
TC20 और Z2 के काउंटरों का उपयोग कर U937 कोशिकाओं की अल्ट्रासोनिक सेल पर आयाम के विभिन्न स्तरों के 6 चित्रा प्रभाव। प्रकोष्ठों के बीच प्रत्येक में 1 सेकंड अंतर के साथ, अल्ट्रासाउंड के तीन 1 सेकंड दालों का उपयोग कर 33% आयाम पर 40 किलोहर्ट्ज़ सेल dismembrator (100-110 डब्ल्यू / 2 सेमी) या 50% आयाम (125-130 डब्ल्यू / 2 सेमी) के साथ sonicated गया इन दालों की। (ए) Z2 के काउंटर सॉफ्टवेयर से एक स्क्रीनशॉट U937 कोशिकाओं पर sonication के प्रभाव को दर्शाता है। TC20 काउंटर से (बी) डाटा परिणाम के reproducibility प्रदर्शित करने के लिए एक ग्राफ में संकलित किया गयाएस। ये आंकड़े कुल और जीना सेल मायने रखता है, के रूप में अच्छी तरह से trypan नीले रंग का मूल्यांकन के रूप में सेल व्यवहार्यता शामिल हैं। बार्स 4 स्वतंत्र सेल आबादी के लिए मतलब (SEM) के मानक त्रुटि को दर्शाते हैं। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
U937 और THP1 कोशिकाओं की अल्ट्रासोनिक संवेदनशीलता potentiating पर methyl- β-cyclodextrin चित्रा 7. प्रभाव। (ए) U937 कोशिकाओं से पहले 40 किलोहर्ट्ज़ में अल्ट्रासाउंड (105 डब्ल्यू / सेमी के साथ sonicated किया जा रहा करने के लिए 30 मिनट के लिए MeβCD की एकाग्रता बदलती के साथ इलाज किया गया 2 ) तीन 1 सेकंड दालों का उपयोग कर के अलावा 1 सेकंड स्थान दिया गया है। सेल आबादी ≥12 माइक्रोन और ≥17 माइक्रोन में बांटा गया था। (बी) U937 या THP1 कोशिकाओं को फिर से बदलती एकाग्रता के साथ इलाज किया गया30 मिनट के लिए पूर्व 1 सेकंड अल्ट्रासाउंड के 1-3 दालों का उपयोग कर 40 किलोहर्ट्ज़ प्रणाली के साथ sonicated जा रहा है MeβCD का राशन 1 सेकंड के अलावा दूरी। सेल व्यवहार्यता और mitochondrial गतिविधि XTT किट के साथ मूल्यांकन किया गया। कोशिकाओं के 100 μl एक-फ्लैट नीचे 96 अच्छी तरह से microtiter प्लेट में अच्छी तरह से प्रति वरीयता प्राप्त थे। थाली से पहले XTT समाधान के अलावा करने के लिए 24 घंटे के लिए incubated किया गया था। तरंगदैर्ध्य पढ़ा था पहले कोशिकाओं तो एक अतिरिक्त 2 घंटे के लिए incubated रहे थे। बार्स 4 स्वतंत्र सेल आबादी के लिए SEM के दर्शाते हैं। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए, विशेष देखभाल ध्यान से नमूना स्थिति और कनवर्टर-सींग संघ साफ करने के लिए लिया जाना चाहिए। सींग में नमूना की नियुक्ति के सींग से दूरी बदलते नमूना के संपर्क में है ऊर्जा बदल इसलिए ध्वनिक foci बदल जाएगा, और के रूप में, लगातार सेल विनाश को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। कप सींग भीतर ध्वनिक ऊर्जा अधिकतम गुहिकायन की स्थिति को खोजने के लिए गुहिकायन मीटर का उपयोग मैप किया जा सकता है। इसके अलावा, आस्टसीलस्कप के साथ गुहिकायन मीटर, कोशिकाओं के संपर्क में किया जा रहा है ध्वनि तीव्रता है, साथ ही तरंग की एकरूपता का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। इसलिए, इन उपकरणों की व्यवस्था के साथ समस्याओं का पता लगाने, और समस्या निवारण प्रणाली अस्थिरता दूर करने के लिए आवश्यक हो सकता है क्या पता लगाने में मदद करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।

जैसा कि पहले उल्लेख, कम आवृत्ति प्रणाली के लिए भाग नहीं अगर प्रयोग भर में आगे देगास करने के लिए पानी में कार्य कर सकतेsonication के नमूने के लिए कई मिनट पहले। यह प्रारंभिक रन प्रयोगों के दौरान एक अपेक्षाकृत degassed sonication के मध्यम और इस तरह अनुरूप परिणाम उपज के लिए किया जाना चाहिए। संवेदीकरण की हद तक सच का आकलन करना मुश्किल होगा, के रूप में sonosensitizers की प्रभावकारिता का आकलन करते समय इसके अलावा, कोशिकाओं में या अधिकतम आयाम के पास sonicated नहीं किया जाना चाहिए। 40 किलोहर्ट्ज़ सिस्टम पर 33% आयाम का उपयोग करते हुए यह उल्लेखनीय क्षति पैदा करता है, के रूप में एक आदर्श स्थापित है, लेकिन U937 और THP1 कोशिकाओं (चित्रा 7) के खिलाफ MeβCD के साथ प्रदर्शन के रूप में, अपने प्रभाव का प्रदर्शन करने के लिए sonosensitizers पर्याप्त जगह उपलब्ध कराता है। ये आंकड़े भी MeβCD एक खुराक निर्भर तरीके से कम आवृत्ति अल्ट्रासाउंड करने के लिए कई ल्यूकेमिया लाइनों sensitizes की पुष्टि करें।

Sonication के 17-19 के माध्यम से उत्पन्न किया जा रहा intramembrane cavitation बुलबुले के सबूत दिखा 8 मेगाहर्ट्ज के लिए 0.75 मेगाहर्ट्ज की रेंज में उच्च आवृत्ति के साथ किया प्रयोगों की एक नंबर दिया गया है। हालांकि, questioअभी भी अल्ट्रासाउंड प्रेरित सेल 18 की सटीक व्यवस्था के संबंध में रहना एन एस। हम कम आवृत्ति अल्ट्रासाउंड 15 अन्य प्रयोगशालाओं 20, द्वारा प्रदर्शन एक घटना का उपयोग कर cytoskeleton fluidizing के बीच एक कड़ी दिखाया गया है और ध्वनि के प्रति संवेदनशीलता बढ़ गई हैं 21। इसके अलावा, हम इस तरह के cytochalasin बी के रूप में microfilament में खलल न डालें एजेंटों कई ल्यूकेमिया में अल्ट्रासोनिक संवेदनशीलता शक्ति प्रदान पाया है कि actin के polymerization की कि निषेध का सुझाव लाइनों, लेकिन नहीं hHSCs या 22 leukocytes, विशेष रूप से ब्याज की एक sonosensitizing तंत्र हो सकता है। हम यह भी स्पष्ट रूप से तीव्र myeloid लेकिमिया, क्रोनिक माइलॉयड ल्यूकेमिया, और तीव्र ल्य्म्फोइड ल्यूकेमिया सहित इन विट्रो में अलग ल्यूकेमिया प्रकार की अल्ट्रासोनिक संवेदनशीलता बढ़ जाती है, कि विन्क्रिस्टाईन, ट्यूबिलिन polymerization के 23, 24 को रोकता है कि एक सूक्ष्मनलिका में खलल न डालें एजेंट मनाया है। इसके विपरीत, cytoskeletal घटकों को स्थिर कि cytoskeletal निर्देशित एजेंट (Paclitaxel एकडी jasplakinolide) सेल 22 की कम दर से परिलक्षित, sonication के लिए कोशिकाओं के लिए प्रतिरोधी बनाने के लिए दिखाई देते हैं। साथ में ले ली, इन आंकड़ों नियोप्लास्टिक कोशिकाओं की cytoskeletal घटकों fluidizing परिकल्पना है कि वास्तव में SDT 25 की प्रभावकारिता को बढ़ाने में एक महत्वपूर्ण कारक है समर्थन करते हैं। वर्तमान अध्ययन में यह भी कोलेस्ट्रॉल कमी MeβCD इलाज U937 कोशिकाओं स्पष्ट रूप से 40 किलोहर्ट्ज़ अल्ट्रासाउंड को अवगत कर रहे हैं के रूप में आगे, नियोप्लास्टिक कोशिकाओं की अल्ट्रासोनिक संवेदनशीलता शक्ति प्रदान करने के लिए है जिसके द्वारा एक और तरीका हो सकता है कि यह दर्शाता है।

हमारे sonication के प्रोटोकॉल के लिए इन विट्रो में चिह्नित Antineoplastic गतिविधि का प्रदर्शन किया है, जबकि मौजूदा कार्यप्रणाली sonication के लिए इस्तेमाल किया शीशियों में फिट करने में सक्षम हैं कि संस्कृति और छोटे कशेरुकी मॉडल में काम करने के लिए सीमित है। हम सुरक्षित रूप से स्पंदित कम आवृत्ति अल्ट्रासाउंड (20 किलोहर्ट्ज़) का उपयोग sonicated जा सकता है कि zebrafish से पता चला है, और एजेंटों के लिए अपनी सहिष्णुता के लिए मात्रात्मक तुलनीय है किकि ट्यूमर असर zebrafish सुझाव दे murine मॉडल 26 द्वारा सहन खुराक, इन प्रोटोकॉल के vivo Antineoplastic गतिविधि का आकलन करने के लिए प्रारंभिक जांच में इस्तेमाल किया जा सकता है। फिर भी, पूर्व स्तनधारी मॉडल के sonication के लिए एजेंटों का प्रबंध मेगाहर्ट्ज रेंज 1 में बताया गया है, और इस तरह के प्रोटोकॉल की संभावना कम आवृत्ति अल्ट्रासाउंड, साथ ही कोलेस्ट्रॉल घट और cytoskeletal निर्देशित एजेंटों को शामिल करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।

SDT के इस फार्म के संभावित नैदानिक ​​अनुप्रयोगों Antineoplastic एजेंटों नसों के द्वारा प्रशासित रहे हैं (चार) खून करने से पहले sonication के 25 के लिए हटाया जा रहा है, जिसमें बाह्य रक्त sonication के शामिल हो सकता है। इस विधि को मानव शरीर रचना विज्ञान से उत्पन्न संभावित ध्वनि अवरोध को हटा, और ठोस ट्यूमर से ल्यूकेमिक विस्फोटों, साथ ही मेटास्टेसिस को नुकसान करने के लिए एक प्रभावी तरीका हो सकता है। ऐसा लगता है कि कोलेस्ट्रॉल घट और cytoskeletal निर्देशित एजेंट सकता भी संभव हैपहले से ही इस उपचार के साधन की प्रभावकारिता में सुधार करने की कोशिश में क्लिनिक में जांच की जा रही है कि HIFU प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जाएगा।

वर्तमान अध्ययन में वर्णित विधि इस उपयोगिता को बढ़ाने सकता संभावित sonosensitizers के मूल्य, और आगे प्रणाली शोधन का आकलन करने में सक्षम हैं। हालांकि, बिजली आपूर्ति की गुणवत्ता, ध्वनिक foci, और कन्वर्टर्स के बीच व्यक्तिगत भिन्नता सहित ऐसे अल्ट्रासोनिक devises, का उपयोग करते समय विचार किया जा करने के लिए कई चर रहे हैं। इसलिए, भविष्य के अनुसंधान ध्वनि तरंगों visualizing और परिणामों पर उनके प्रभाव को समझने पर ध्यान दिया जाएगा। SDT इन विट्रो में सेल बढ़ाने के लिए दिखाया गया है और अर्जित कर रहे हैं स्तनधारी मॉडल में विवो डेटा में अधिक अगर चिकित्सकीय रूप से व्यवहार्य साबित हो सकता है। कई एजेंटों और अल्ट्रासाउंड से जुड़े घातक कोशिकाओं के अन्य संभावित दोहन विशेषताओं, साथ ही विभिन्न संयुक्त तौर तरीकों की जांच प्रयोगों हमारी प्रयोगशाला में जारी है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iscove's Modified Dulbecco's Medium w/ NaHCO3 & 25mM Hepes  Life Technologies 12440079
Amphotericin B Solution  Sigma-Aldrich A2942 
Penicillin/Streptomycin 100x Solution  Life Technologies 10378-016
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12105
Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor with 3" (25mm) Cuphorn Branson Ultrasonics 101-063-726 sonication device
Brisk Heat SDC Benchtop Digital temperature Controler w/ 1000 ml Beaker Heater Brisk Heat SDCJF1A-GBH1000-1 heater used for temperature control
Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp® Software Beckman-Coulter 6605700
Bio-Rad TC20 Automated Cell Counter Bio-Rad 145-0102
Gentamicin 50 mg/ml Sigma-Aldrich G1397 
Trypan Blue Solution Sigma-Aldrich T8154
Falcon 50 ml & 25 ml Vented Culture Flasks Fisher Scientific 353082
Lonza L-Glutamine 200 mM 0.85% NaCl Lonza 17-605C 
Seal-Rite 1.5 ml Microcentrifuge Tubes USA Scientific 1615-5510
Beckman-Coulter Accuvette ST 25 ml Vials and caps Beckman-Coulter  A35473
AccuJet Pro Auto Pipet  BrandTech Scientific 26330
USA Scientific 10 ml Disposable Serological Pipets USA Scientific 1071-0810
Tip One 100 μl and 1,000 μl Filter Tips USA Scientific 1120-1840, 1126-7810
100 μl Micropipette  Wheaton 851164
1,000 μl Micropipette Wheaton 851168
BioRad Dual Chamber Counting Slides Bio-Rad 145-0015
Forma Scientific Dual chamber water jacketed Incubator Forma Scientific 3131
Tektronix  DPO 2002B Digital Phosphor Oscilloscope Tektronix DPO2002B used to measure the ultrasonic waveform
PPB MegaSonics Model PB-500 Ultrasonic Energy Meter PPB Megasonics PB-500  used to assess the sound intensity in W/cm2
Teledyne RESON TC4013-1 Hydrophone Teledyne TC4013-1  connects to the oscilloscope 
Wheaton 250 ml Flasks Sigma-Aldrich Z364827
20 ml Glass Scintillation Vials  Sigma-Aldrich Z190527
Beckman-Coulter Isotonic Saline Solution  Beckman-Coulter N/A diluent for Z2 counter
Chloroform 99% Sigma-Aldrich C2432
Ethanol 200 Proof Anhydrous  Sigma-Aldrich 459836
Mineral Oil N/A
XTT Cell Proliferation Assay Kit ATCC 30-1011K
96-Well Microplate Reader Cole-Palmer  EW-13055-54
U937 Human Monocytic Leukemia Cells ATCC CRL­1593.2
THP1 Human Monocytic Leukemia Cells ATCC TIB-202

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References

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चिकित्सा अंक 101 Sonodynamic चिकित्सा कम आवृत्ति अल्ट्रासाउंड कैंसर ल्यूकेमिया Sonosensitizers
जनरेशन और स्पंदित कम आवृत्ति अल्ट्रासाउंड के मात्रात्मक विश्लेषण नियोप्लास्टिक कोशिकाओं इलाज की ध्वनि संवेदनशीलता का निर्धारण और इलाज के लिए
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Trendowski, M., Christen, T. D., Zoino, J. N., Acquafondata, C., Fondy, T. P. Generation and Quantitative Analysis of Pulsed Low Frequency Ultrasound to Determine the Sonic Sensitivity of Untreated and Treated Neoplastic Cells. J. Vis. Exp. (101), e53060, doi:10.3791/53060 (2015).

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