Stress resistens er et af kendetegnene for lang levetid og er kendt for at være genetisk styret. Her har vi udviklet en neutral high-throughput metode til screening for mutationer, som bibringer resistens i stress ES-celler til at tilskynde musemodeller for levetiden undersøgelser.
Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely limits its potential. We describe here the use of mouse embryonic stem (ES) cells as surrogate cells to screen for a phenotype of interest and subsequently introduce these cells into a host embryo to develop into a living mouse carrying the phenotype. This method provides (1) a cost effective, high-throughput platform for genetic screen in mammalian cells; (2) a rapid way to identify the mutated genes and verify causality; and (3) a short-cut to develop mouse mutants directly from these selected ES cells for whole animal studies. We demonstrated the use of paraquat (PQ) to select resistant mutants and identify mutations that confer oxidative stress resistance. Other stressors or cytotoxic compounds may also be used to screen for resistant mutants to uncover novel genetic determinants of a variety of cellular stress resistance.
Holdbarhed har et intimt forhold til stress modstand. Generelt ofte langlivede arter som viser øget resistens mod flere stressfaktorer, såsom hydrogenperoxid, paraquat (PQ), UV, varme og tungmetaller 1,2. Derimod øget følsomhed over for stress tendens til at forudsige kortere levetid og / eller en mere sygdomsfri tilbøjelige fænotype. Antioxidanten fjernende pathway har længe været spekuleret at spille en vigtig rolle i giver belastningsmodstand til dyret. Men med få undtagelser, studier fra en række transgene dyr med manipulationer i forskellige anti-oxidant enzymer (f.eks SOD) indikerer, at forøgelse af størrelsen af oxidant fjernende enzymer ikke øger levetiden eller helbred span 3. Disse data tyder på, at stress resistens træk konsistent i de langlivede dyr medieres af andre cellulære veje endnu at blive afdækket.
Vi tog en fordomsfri fremadgenetiske tilgang til at identificere gener, som ved muteret, kan indebære en belastningsmodstand fænotype i dyrkede embryonale stamceller (ES-celler). ES-celler har to store fordele i denne undersøgelse: (1) avancerede genetiske manipulationer er tilgængelige til at modificere genomet af ES-celler; og (2) eventuelle stress-resistente ES-celler udvundet fra skærmen direkte kan anvendes til produktion mus, som muliggør en hurtig oversættelse til hele dyreforsøg til at måle levetid og sundhed span.
I denne rapport, vi beskrev brugen af C9 ES cellelinje, hvor BLM alleler var under kontrol af en tetracyclin lydhør element. Behandling af doxycyclin (DOX) forbigående slukket udtryk for Blm fører til øget hændelse af søsterkromatid udveksling. Denne korte sigt Blm knock-out tilladt for generering af homozygote mutationer i den heterozygote befolkning, så recessive mutationer for stress modstand kunne fanget i screeningsprocessen. Viogså beskrevet anvendelsen af piggyBac (PB) transposon som mutagen til tilfældigt indsætte en poly-A-trap kassette (PB-UPA) at mutere gener i genomet. Celler med forstyrrelse af et gen af poly-A-fælde blev G418-resistente og kunne genvindes, således at en samling af gen-trap-mutanter (gen-trap bibliotek) kunne foretages, og efterfølgende screenet for mutantkloner der var slidstærkt.
Stress-resistente kloner udvundet fra udvælgelsen kunne karakteriseres ret hurtigt ved hjælp af molekylære teknikker med hensyn til antallet af insertioner (qPCR), insertionsstedet (splinkerette PCR), identiteten af den afbrudte gen (BLAST), og dets ekspression niveau ( RT-qPCR). PB insertion kunne mobiliseres ved transient ekspression af MPB transposasen i klonen for at gendanne DNA-sekvensen vildtype og dermed teste for tab af belastningsmodstand. Disse er effektive måder at bekræfte kausalitet af mutationen, som bør gøres, indentil dyre muse produktion. Tidligere undersøgelser har vist, at celler udsat for stressfaktorer mistet deres pluripotens 4,5. Således i denne protokol, bevarelse af en replika sæt af mutant celler, som ikke ville blive behandlet med stressfaktorer er afgørende for en vellykket mus produktion.
Vores laboratorium har udviklet C9 ES-cellelinien og PB-UPA vektor, begge er til rådighed for andre forskere efter anmodning. Protokollen rapporteret her, vil begynde med dannelsen af de novo bibliotek af gen-fanget ES-celler med PB-UPA (figur 1A) efterfulgt af replikaudpladning og stress valg at isolere stress resistente kloner (figur 1B). Vi demonstrerede markeringen med paraquat, en potent frie radikaler generator i celler. Stort set enhver cytotoksisk forbindelse eller et toksin, for eksempel, ER stressfaktorer (f.eks thapsigargin og tunicamycin), neuronal oxidant (f.eks MPP +, 6-hydroxy dopamin og rotenon), varme og tungemetaller (f.eks Cd, Se), kan tilpasses til den metode til at selektere for respektive resistente mutanter.
Forward genetic analysis allows for an unbiased interrogation of the genome for genes responsible for a specific phenotype. This method is very powerful to uncover novel gene functions. It has been widely used in lower organisms but not in mammal, such as the mouse, mainly due to the extremely high cost associated with the infrastructure and logistics that would entail. Here, we moved the genetic screening process to the ES cell culture platform, greatly increasing the efficiency and throughput in generating mutants a…
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank the Wellcome Trust Sanger Institute for the gifts of piggyBac transposon and piggyBac transposase. This work was supported by the Butcher grant of Colorado and the NIH R01 AG041801 (W.S.C).
Vector | ||
PB-UPA | ||
mPBase | ||
mPBasePuro | ||
Tissue Culture | ||
500-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU05RE |
250-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU02RE |
50-ml Steriflip-GV filters | EMD Millipore | SE1M179M6 |
KO DMEM | Life Technologies | 10829-018 |
DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 |
FBS | Tissue Culture Biologicals | 104 |
Heat Inactivated FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500 |
LIF | EMD Millipore | ESG1107 |
Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140148 |
β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 |
Methyl Viologen dichloride (Paraquat) | Sigma-Aldrich | 856177 |
Dimethyl Sulphoxide Hybri-MAX | Sigma-Aldrich | D2650 |
EmbryoMAX 0.1% gelatin | EMD Millipore | ES006B |
DPBS/Modified | HyClone | SH30028.02 |
0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 |
T25 Flask | Corning | 353108 |
T75 flask | Corning | 353135 |
100-mm plate | Corning | 353003 |
150-mm plate | Corning | 430599 |
96-well plate | Corning | 3585 |
96-well U-bottom plate | Corning | 3799 |
24-well plate | Corning | 3526 |
50-ml reservoir | Corning | 4870 |
15-ml tubes | VWR International, LLC | 82050-276 |
Primary Mouse Embryonic Fibroblasts | EMD Millipore | PMEF-NL |
DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts | Applied StemCell | ASF-1001 |
Mitomycin C | Fisher BioReagents | BP25312 |
Geneticin (G418) | Life Technologies | 11811-023 |
Doxycycline | Fisher BioReagents | BP26531 |
Cryotubes | Thermo Scientific | 377267 |
Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 |
TC10 cell counter | Bio-Rad | |
Counting Slides (for TC10) | Bio-Rad | 1450011 |
Electroporation | ||
Gene Pulser Xcell | Bio-Rad | 1652611 |
Gene Pulser Cuvettes (4 mm gap) | Bio-Rad | 1652088 |
Molecular Biology | ||
Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercylcer ep Gradient S |
Puregene Core kit B | Qiagen | 158745 |
Topo-TA Cloning kit | Life Technologies | 450030 |
High Capacity cDNA synthesis kit | Applied Biosystems | 4368814 |
NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 |
100% ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2716 |
Double Processed Tissue Culture Water | Sigma-Aldrich | W3500 |
Sau3A1 | New England BioLabs | R0169L |
T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202T |
EcoRV | New England BioLabs | R3195S |
96-well Lysis Buffer (Ramires-Solis et al. 1992) | ||
Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
Hydrochloric Acid | Fisher BioReagents | A144-212 |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 |
N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L5777 |
Proteinase-K | Fisher BioReagents | BP1700 |
Electrophoresis | ||
Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad | 170-4469EDU |
LE Agarose | GeneMate | E3120500 |
Ethidium Bromide | Fisher BioReagents | BP1302 |
100 BP DNA Ladder | New England BioLabs | N3231S |
1Kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S |
2-log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200L |