Summary
Resistenza allo stress è uno dei tratti distintivi per la longevità ed è conosciuto per essere geneticamente governati. Qui, abbiamo sviluppato un metodo high-throughput imparziale per lo screening di mutazioni che conferiscono resistenza allo stress in cellule ES con cui sviluppare modelli murini per gli studi di longevità.
Introduction
La longevità è un rapporto intimo con la resistenza allo stress. In generale, specie longeve spesso dimostrano una maggiore resistenza verso molteplici fattori di stress, come il perossido di idrogeno, il paraquat (PQ), UV, al calore, e metalli pesanti 1,2. Al contrario, l'aumento della sensibilità allo stress tende a prevedere vita ridotta e / o una maggiore fenotipo malattia soggetta. Il lavaggio via anti-ossidante è stato a lungo speculato a svolgere un ruolo importante nel conferire resistenza allo stress per l'animale. Tuttavia, con poche eccezioni, studi da una varietà di animali transgenici con manipolazioni in vari enzimi antiossidanti (ad esempio, SOD) indicano che l'aumento del livello di ossidanti enzimi scavenging non aumenta durata o durata di salute 3. Questi dati suggeriscono che la resistenza caratteristica sollecitazioni costantemente osservati in animali lunga durata è mediato da altre vie cellulari ancora essere scoperti.
Abbiamo preso un avanti imparzialeapproccio genetico per identificare i geni che su mutato, potrebbe conferire una resistenza allo stress fenotipo in staminali embrionali in coltura (ES) cellule. Cellule staminali offrono due grandi vantaggi in questo studio: (1) sofisticate manipolazioni genetiche sono a disposizione per modificare il genoma delle cellule ES; e (2) qualsiasi resistenti cellule ES di stress recuperate dallo schermo può essere utilizzato direttamente per la produzione di mouse, permettendo una rapida traduzione in studi su animali interi per misurare vita e durata della salute.
In questa relazione, abbiamo descritto l'uso della linea di cellule ES C9, in cui gli alleli BLM erano sotto controllo da un elemento sensibile alla tetraciclina. Trattamento di doxiciclina (DOX) transitoriamente spento l'espressione di Blm conseguente aumento incidente di scambio di cromatidi fratelli. Questo breve termine Blm knock-out permesso la generazione di mutazioni omozigoti all'interno della popolazione eterozigote in modo che le mutazioni recessive per la resistenza allo stress possono essere catturate nel processo di screening. Noianche descritto l'uso di piggyBac (PB) transposon come mutageno di inserire a caso un poli-Una cassetta trappola (PB-UPA) di mutare i geni nel genoma. Le cellule con rottura di un gene da parte del poli-Una trappola divennero G418 resistenti e potrebbero essere recuperati in modo che un insieme di mutanti del gene-trap (biblioteca gene-trap) potrebbe essere fatto, e, successivamente, proiettato per i cloni mutanti che erano resistenti stress.
Cloni resistenti stress recuperati dalla selezione potrebbero essere caratterizzati piuttosto rapidamente mediante tecniche molecolari in relazione al numero di inserimenti (qPCR), il sito di inserzione (splinkerette PCR), l'identità del gene interrotto (BLAST), e il suo livello di espressione ( RT-qPCR). L'inserimento PB potrebbe essere remobilized per espressione transiente di MPB transposase nel clone per ripristinare la sequenza di DNA wild-type e testare per la perdita di resistenza alle sollecitazioni in tal modo. Questi sono modi potenti per confermare la causalità della mutazione, che dovrebbe essere fatto primaalla produzione costoso mouse. Precedenti studi hanno dimostrato che le cellule esposte a fattori di stress hanno perso il loro 4,5 pluripotenza. Così, in questo protocollo, la conservazione di un set di repliche di cellule mutanti, che non sarebbe trattata con fattori di stress è un fattore critico per la produzione di successo del mouse.
Il nostro laboratorio ha realizzato la linea di cellule ES C9 e il vettore PB-UPA, entrambi sono a disposizione di altri ricercatori su richiesta. Il protocollo qui riportato inizierà dalla generazione di de novo biblioteca di cellule ES geni intrappolati con PB-UPA (Figura 1A), seguita dalla placcatura di replica e selezione sforzo per isolare cloni resistenti allo stress (Figura 1B). Abbiamo dimostrato la selezione con il paraquat, un generatore di radicali liberi potente all'interno delle cellule. Virtualmente, qualsiasi composto citotossico o tossina, per esempio, ER stress (ad esempio, tapsigargina e tunicamicina), ossidante neuronale (ad esempio, MPP +, dopamina 6-idrossi, e rotenone), calore, e pesantemetalli (ad esempio, Cd, Se), potrebbero essere adattati al metodo di selezionare per rispettivi mutanti resistenti.
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Protocol
1. Gene-trapped ES Libreria di celle Edilizia Uso piggyBac Transposon
- Preparare fibroblasti embrionali di topo primaria (PMEF) come alimentatori per colture cellulari ES
- Scongelare una fiala di mitomicina C-inattivato PMEF (5,0 x 10 6) in un bagno d'acqua a 37 ° C. Trasferire le cellule in 5 ml di terreno delle cellule ES (DMEM contenente 15% FBS, 1.000 unità / ml di fattori inibitori leucemia, 100 micron aminoacidi essenziali, glutammina mm 2, 55 mM 2-mercaptoetanolo, e 25 unità / ml di penicillina / streptomicina ), e centrifugare a 100 xg per 5 min.
- Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 30 ml di terreno cellule ES seguite da distribuire in due fiasche T25 (5 ml ciascuno) e due piastre da 100 mm (10 ml ciascuna). Incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 24 ore.
- Cultura ed espandere cellule C9 ES
- Scongelare una fiala di cellule ES C9 (2,5 x 10 6 cellule in 0,5 ml) in un bagno d'acqua a 37 ° e trasferire lacellule in 5 ml di terreno delle cellule ES. Centrifugare a 100 xg per 5 min.
- Aspirare il surnatante e risospendere cellule ES in 5 ml di mezzo delle cellule ES seguita dalla placcatura nel pallone alimentatore T25. Incubare a 37 ° C, 5% di CO 2. Sostituire medio delle cellule ES quotidiano.
- Dopo 2 giorni di coltura, le cellule ES dovrebbero diventare ~ 80% confluenti, e sono pronti per essere diversi passaggi. Lavare le cellule con 5 ml di PBS (senza Ca2 + e Mg2 +) e poi aggiungere 2,5 ml preriscaldata 0,25% tripsina-EDTA. Incubare a 37 ° C per 10 min. Aggiungere 2,5 ml di mezzo di cellule ES per fermare tripsina; pipetta su e giù per 15 volte per rompere grumi di cellule. Centrifugare a 100 xg per 5 min.
- Aspirare le cellule surnatante e risospendere in 4 ml di terreno delle cellule ES. Trasferimento 1 ml di cellule per piastra da 100 mm contenente 9 ml ES medio delle cellule; preparare due piastre da 100 mm. Si tratta di un 1: passaggio 8. Nutrire le cellule al giorno con 10 ml di ES medio delle cellule.
- Preparare 96-pozzetti di alimentazione per la biblioteca
- Come indicato al punto 1.1.1, scongelare tre fiale di mitomicina-C inattivati PMEF (ciascuno contenente 5 x 10 6 celle) e risospendere le cellule da ciascun flaconcino con 33,3 ml ES medio delle cellule. Combinare cellule per produrre una sospensione di cellule 100-ml.
- Piatto 100 cellule microlitri per pozzetto su dieci piastre da 96 pozzetti. Queste piastre di alimentazione a 96 pozzetti deve essere preparato almeno un giorno prima transfettando cellule ES C9 con PB trasposoni.
- Elettroporazione di cellule ES C9 con il vettore PB-UPA
- Trypsinize e contare le cellule ES C9 espanso utilizzando un contatore di cellule automatizzato. Lavare ogni piatto 100 mm di celle C9 ES con 10 ml di PBS. Aggiungere 8 ml preriscaldata 0,25% tripsina-EDTA e incubare a 37 ° C per 10 min.
- Smettere di tripsina con l'aggiunta di 2 ml ES medio delle cellule. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml e pipetta su e giù per 15 volte a dissolversi grumi di cellule. Subito centrifugare a 100 xg per 5 min seguita da aspirare il surnatante.
- Cell Risospenderes in 10 ml di media ES cellule e contare le cellule ES con un emocitometro. Preparare sei tubi da 15 ml di sospensione cellulare ognuno contenente 5 x 10 6 cellule ES. Centrifugare a 100 xg per 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere ogni pellet di cellule in 0,8 ml di PBS.
- Preparare sei cuvette elettroporazione (4 millimetri gap) per cui le cellule 0,8 ml vengono trasferiti. Per ogni provetta, aggiungere 1 mg PB-UPA e 20 mg MPB trasposasi (mPBase); mescolare delicatamente pipettando su e giù. Mettere le provette su ghiaccio. Eseguire elettroporazione con un elettroporatore utilizzando l'impostazione esponenziale a 250 V, 500 uF, e l'infinito ohm.
NOTA: in genere, la costante di tempo è di circa 10 a 12 msec per una elettroporazione di successo, che producono circa 1.500 a 2.000 G418 trasformanti resistenti per 5 x 10 6 cellule. - Recuperare e in comune le cellule trasfettate in un pallone T75 contenente 98 ml di ES medio delle cellule. Mescolare le cellule pipettando dolce e poi trasferire le cellule ad un serbatoio (50 ml). Noiing una pipetta a 12 canali, trasferire 100 ul di cellule per pozzetto di piastre di alimentazione precedentemente preparata da 96 pozzetti (10 in totale). Incubare a 37 ° C, 5% di CO 2.
- Dopo 24 ore, nutrire le cellule quotidianamente con fresco medio cella contenente G418 ES (150 mg / ml) per selezionare per i cloni gene-trappola.
NOTA: in genere ogni pozzetto conterrà una decina di G418 colonie resistenti. Quando queste colonie crescono di dimensione sufficiente (in genere 5-7 giorni), le piastre a 96 pozzetti (la biblioteca) saranno replicati in 2 set per la conservazione e la selezione, rispettivamente. Ogni piastra nella libreria è designato come 'sub-library', quindi in questo caso, ci sono 10 sotto-librerie.
2. Biblioteca replica
- Replicare le piastre master
- 24-48 ore prima che le colonie resistenti G418 che raggiungono il 50-60% di confluenza, scongelare altri tre fiale di mitomicina C-inattivato PMEF su dieci piastre a 96 pozzetti come alimentatori (fare riferimento alla sezione 1.3). Gelatinaizzare dieci piastre a 96 pozzetti incubando 0,1% di gelatina (100 ml / pozzetto) a 37 ° C per almeno 15 - 30 min; O / N incubazione è accettabile.
- Preparare sospensioni singola cella nelle piastre a 96 pozzetti per tripsinizzazione. Aspirare media da piastre da 96 pozzetti e lavare una volta a parità di volume di PBS (senza Ca 2+, Mg 2+). Aggiungere 50 ml di pre-riscaldato 0,25% tripsina-EDTA, incubare a 37 ° C in 5% CO 2 per 10 min. Smettere di tripsina con 50 ml di media delle cellule ES. Spezzare i grumi di cellule pipettando su e giù 15 volte con la pipetta multicanale.
- Trasferimento 50 ml di sospensione cellulare tripsinizzati alla riga corrispondente della piastra di alimentazione (Master) che già contiene 150 microlitri medio delle cellule ES e le restanti 50 ml alla riga corrispondente della piastra di gelatinizzato (replica) già contenente 150 ml di media delle cellule ES. Elaborare ogni riga di celle ad una piastra master e replica. Incubare le piastre (ora contenente 200 ml cVolume ulture) a 37 ° C, 5% CO 2 O / N.
NOTA: Ora ci sono una ventina di piastre a 96 pozzetti. - Il giorno successivo nutrire le cellule con 100 pl fresco medio delle cellule ES contenente 150 mg / ml G418. Sostituire il mezzo di tutti i giorni fino i pozzi sono 80-90% confluenti.
- Congelare le piastre master
- Quando le piastre master sono circa l'80% confluenti, trypsinize le cellule, come descritto (vedere la sezione 2.1.2).
- Rimuovere le piastre e fermare la reazione tripsina con 50 ml di 2x congelamento media (60% medio delle cellule ES, 20% FBS, 20% DMSO). Pipetta su e giù per 10 volte con una pipetta multicanale per garantire la corretta miscelazione del mezzo di congelamento.
- Mettere le piastre a 96 pozzetti in una scatola di polistirolo ben sigillato e metterlo in freezer -80 ° C per un massimo di quattro mesi di stoccaggio. Quattro mesi permetteranno tempo sufficiente per completare la selezione stress e per identificare quali pozzi dalla piastra master contengono i cloni di interesse.
NOTA: Conservare a -80 & #176; C più di 4 mesi si tradurrà in declino della vitalità cellulare. Uno può utilizzare crio-tubi nel formato a 96 pozzetti che possono essere immagazzinate nella fase vapore di azoto liquido per il periodo di stoccaggio prolungato.
- Preparare piatti DNA e piscine sub-biblioteca da lastre di replica
- 24-48 ore prima di replicare ulteriormente alle piastre del DNA e piscine sub-biblioteca, preparare dieci piatti da 100 mm con mitomicina C-inattivato PMEF per la piscina sub-biblioteca, e dieci gelatinizzato piastre a 96 pozzetti per la piastra di DNA si replica. Consultare la sezione 1.3 per la procedura generale.
- Trypsinize le cellule in piastre da 96 pozzetti di replica (vedere la sezione 2.1.2). Durante la fase di tripsinizzazione 10 min, aspirare gelatina dalle piastre DNA e sostituire con 150 microlitri di cellule ES mezzo contenente G418 (150 mcg / ml). Inoltre, preparare un serbatoio contenente 5 ml di terreno delle cellule ES per messa in comune dei "sotto-biblioteche nel piatto alimentatore da 100 mm.
- A seguito di tripsinizzazione, arresto provarePSIN con 50 ml di cellule ES media una riga alla volta utilizzando una pipetta a 12 canali. Pipetta su e giù per 10 volte per spezzare grumi di cellule.
- Trasferimento 50 microlitri della sospensione cellulare alla riga corrispondente della piastra di DNA e trasferire i restanti 50 microlitri al serbatoio contenente 5 ml ES mezzo cellulare. Dopo aver completato una piastra completa a 96 pozzetti, aspirare il mezzo di una piastra di alimentazione da 100 mm a cui le cellule aggregati vengono trasferiti. Queste cellule mutagenizzate pool sono designati come un 'sub-library'.
- Ripetere l'operazione per i restanti nove piastre a 96 pozzetti. Feed the piastre DNA a 96 pozzetti e piastre da 100 mm pool 'sub-biblioteca "quotidiano con terreno contenente cellule ES G418 (150 mg / ml).
NOTA: Ora ci sono dieci piastre a 96 pozzetti 'DNA', e 'sub-biblioteca "piastre dieci da 100 mm.
- Congelare le piastre del DNA. Quando le cellule nella piastra DNA sono 80-90% confluenti, aspirare il terreno, lavare le cellule due volte con 100l di PBS e conservare a -20 ° C per l'isolamento dopo DNA genomico 6. Queste piastre di DNA saranno proiettati mediante PCR per identificare quali corrispondente bene nel piatto 'Master' contiene il clone di interesse.
3. Doxiciclina indotta mutanti omozigoti
- Congelare le piscine sub-biblioteca e le cellule di passaggio per il trattamento doxiciclina
- 24 ore prima che le piastre da 100 mm "sub-libreria» aventi colonie abbastanza grandi per produrre 70-80% di confluenza, preparare una serie di dieci gelatinizzato piastre da 100 mm per il trattamento doxiciclina.
- Preparare sospensioni singola cella di ogni sub-biblioteca (fare riferimento alle sezioni 1.4.1 e 1.4.2 per maggiori dettagli). Trasferimento 5 x 10 6 cellule per piastra da 100 mm gelatinizzato con doxiciclina (1 mg / ml); incubare a 37 ° C, 5% CO 2. Congelare le piscine sub-biblioteca rimanenti non doxiciclina trattati con 5 x 10 6 cellule per fiala.
- Passage cellule in presenzadi doxiciclina a mettere fuori Blm
- Passaggio sotto-librerie a 1: 8 ogni 2-3 giorni in presenza di doxiciclina (1 mg / ml) per un massimo di due settimane, durante le quali dox-indotta Knock-out di Blm promuoverà perdita di eterozigosi nella cella popolazione, consentendo la generazione di mutanti omozigoti.
4. Selezione Stress e isolamento di cloni resistenti
- Le cellule trattate con doxiciclina soggetto per la selezione dello stress
- 24 ore prima di passaging cellule trattate doxiciclina per la selezione dello stress, preparare dieci gelatinizzato piastre da 150 mm, posto a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore umidificato.
- Preparare una sospensione di cellule singole di ogni sotto-libreria tripsinizzazione (fare riferimento alla sezione 1.4.1 e 1.4.2 per i dettagli). Seed 6.6 x 10 6 cellule su ciascuna piastra 150 mm in 30 ml di volume totale coltura, distribuire uniformemente le cellule. Incubare le cellule con fattore di stress (10 micron paraquat o omissione di β-mercaptoetanolo,in mezzo delle cellule ES contenente 7,5% inattivato al calore FBS) per 7 giorni, dopo di che sostituiscono con normale medio delle cellule ES per consentire cellule sopravvissute di crescere in colonie per la raccolta.
- Opzionale: Congelare sinistra sulle celle doxiciclina-trattato a 5.0 x 10 6 cellule per fiala.
- Scegli colonie resistenti allo stress
- Dopo ripristinare i media normale per una settimana, osservare quanti lo stress sono presenti colonie resistenti. A seconda del numero di colonie da prelevare, preparare abbastanza pozzi con mitomicina C-inattivato PMEF su piastre a 96 pozzetti uno giorno prima conseguenza (vedere la sezione 1.1 per i dettagli).
- Il giorno della raccolta, aspirare e sostituire medie piastra alimentatore 96 pozzetti con 100 microlitri fresca medie cellule ES, posizionare nuovamente dentro 37 ° C, 5% CO 2 incubatore umidificato. A questo punto, preparare una piastra a 96 pozzetti con fondo a U 50 microlitri 0,25% tripsina-EDTA per pozzetto. Aspirare il terreno dalla piastra selezione di stress da 150 mm e aggiungere eil volume qual di PBS.
- Impostare la micropipetta a 2 microlitri, e 'raccogliere' sopravvivere colonie nella tripsina U-bottom contenenti pozzi, raccogliendo una colonia per pozzetto. È accettabile lasciare piastra sedersi a RT finché è stato scelto il numero desiderato di colonie. Poi, incubare la piastra inferiore U a 37 ° C, 5% CO 2 per 10 min.
Nota: in genere, si prende 1 ora a prendere 96 colonie. - Smettere di reazione tripsina una riga alla volta con 50 microlitri medio cellule ES con una pipetta multicanale. Pipettare su e giù 15 volte per ottenere una sospensione di cellule singole e trasferire 100 microlitri di cellule alla riga corrispondente della piastra di alimentazione già contenente 100 ml di mezzo di cellule ES. Completare il trasferimento per l'intero piatto. Cellule di coltura O / N in 200 ml. La prossima mattina, medio aspirare e sostituirlo con 100 microlitri di media delle cellule ES.
- Replicare le piastre a 96 pozzetti
- Quando i pozzi delle colonie raccolti sono 80-90% confluent, replicare in due piastre corrispondenti, una per l'isolamento del DNA e l'altro per le celle di back-up. Queste piastre sono gelatinizzato e non contengono mitomicina C-inattivato PMEF.
- Aspirare il terreno e lavare con 100 l di PBS. Aggiungere 50 ml di 0,25% tripsina-EDTA a ciascun pozzetto, incubare a 37 ° C per 10 min. Fermare la tripsina con 150 microlitri medio delle cellule ES, mescolare pipettando, e trasferire 100 l di sospensione cellulare al corrispondente fila di due piastre da 96 pozzetti. Cambiare medio giornaliero.
- Quando le piastre sono 80-90% confluenti, congelare una serie di piatti come un 'back-up' (fare riferimento alla sezione 2.2 per i dettagli). L'altra serie di piastre vengono ulteriormente ampliata come descritto di seguito.
- Cellule in espansione per l'isolamento del DNA genomico
- Preparare una sospensione di cellule singole nella piastra DNA a 96 pozzetti (vedere 2.1.2 per i dettagli).
- Trasferire la sospensione cellulare da ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti per il pozzo di un 24-pozzetti (4 totale) utilizzando un micropipette. Assicurarsi che vi sia alcuna contaminazione incrociata di tutte le cellule, come le colonie "raccolti" sono 'clonale' origine. Cellule di coltura in 0,5 ml ES medio cellula, cambiando media tutti i giorni fino pozzi sono 80-90% confluenti.
NOTA: Il 24-pozzetti permetterà rendimento sufficiente di DNA genomico per l'analisi PCR.
5. Individuazione dei siti di inserzione PB e Geni Trapped
- Isolamento DNA genomico da 24 pozzetti: Lisare le cellule nella piastra di 24 pozzetti e isolare privo di RNA DNA genomico.
- Eseguire Splinkerette PCR (SpPCR) per generare frammenti di sequenze che fiancheggiano il sito di integrazione transposon PB come descritto 7,8.
NOTA: SpPCR è un processo di cinque giorni, anche se hands-on di tempo ogni giorno è minima.
6. Analisi genetica dei cloni mutanti
- Individuare maestro bene e purificare clone di interessi.
- Quando il sito di integrazione PB è statamappato, la progettazione di un primer forward monte del sito di integrazione da utilizzare con un primer reverse PB (ad esempio, PB3'-1) 8 e schermare la piastra di DNA corrispondente alla stessa 'sub-library' da cui il clone resistente sollecitazioni stato scelto. Aspettatevi di trovare un solo bene positivo su tutta la piastra di DNA da 96 pozzetti. Scongelare questo esatto bene dalla piastra di 'Master' per un 24-pozzetti su linee e far crescere cellule fino al 80-90% di confluenza.
NOTA: A questo punto, questo pozzo contiene una miscela di cloni geni intrappolati. - Quando la piastra 24 pozzetti è 80-90% confluenti, trypsinize cellule e piastra 1.000 ES cellule in una piastra di alimentazione da 100 mm (garantire sospensione singola cella). Passaggio celle rimanenti in un pallone T25 su alimentatori di espansione. Congelare le cellule dal pallone T25 quando le colonie sono 80-90% confluenti. Congelare 4 fiale al pallone T25 come back-up.
- Lasciare le colonie di crescere per 7 giorni e poi prendere 96 colonie in 96 pozzi feeder piatto. Consultare la sezione 4.2 per la raccolta di procedura. Replicare la piastra quando è pronto in un piatto di 'DNA' e bloccare gli altri come '2 ° -master' piatto (fare riferimento alla sezione 2.2 per congelamento).
- Lasciare colonie per raggiungere 80-90% di confluenza. Schermo piatto DNA per trovare pozzetti contenenti il clone purificato di interesse. Expand cellule dal 96 pozzetti 2 nd -master a 24 pozzetti e successivamente in un pallone T25 (tutta alimentatori). Congelare 4 flaconcini per pallone T25.
NOTA: A questo punto, la linea cellulare gene-intrappolata è clonale, non è stata esposta al fattore di stress, ed è adatto per la produzione di mouse.
- Quando il sito di integrazione PB è statamappato, la progettazione di un primer forward monte del sito di integrazione da utilizzare con un primer reverse PB (ad esempio, PB3'-1) 8 e schermare la piastra di DNA corrispondente alla stessa 'sub-library' da cui il clone resistente sollecitazioni stato scelto. Aspettatevi di trovare un solo bene positivo su tutta la piastra di DNA da 96 pozzetti. Scongelare questo esatto bene dalla piastra di 'Master' per un 24-pozzetti su linee e far crescere cellule fino al 80-90% di confluenza.
- Determinare il numero di inserimento PB: Scongelare una fiala della linea cellulare resistente sollecitazioni ed espandere le cellule in un pallone T25 gelatinizzato. Isolare DNA genomico e controllare il numero copia del trasposone PB. Ciò può essere ottenuto mediante qPCR mira il gene neomicina.
- Misurare il livello di espressione genica: dopo confirming vi è un singolo evento di integrazione PB nella linea cellulare di interesse, misurare il livello di espressione del gene intrappolato mediante RT-qPCR utilizzando sonde specifiche Taqman per ciascun gene.
- Sequenziare il mutante mRNA: Generare un amplicone cDNA mediante PCR utilizzando un primer ricottura a monte per un esone e un primer ricottura a valle alla sequenza splice accettore della cassetta trappola gene. Sequence il frammento di cDNA per confermare che la giunzione previsto si verifica nel gene intrappolato.
- Rimobilitare il trasposone piggyBac per verificare la relazione causale tra il gene intrappolati e la resistenza allo stress.
- 24-48 ore prima di scongelamento cellule per PB rimobilizzazione, disgelo e piatto DR4 alimentatori sul pallone un T25 e due piastre da 100 mm. Almeno un giorno dopo gli alimentatori DR4 sono placcati su beuta T25, scongelare un flaconcino di linea cellulare contenente l'inserimento PB e piastra le cellule nel pallone T25 contenente alimentatori DR4. Crescere le cellule in terreno di cellule ESper 48 ore, cambiando medio giornaliero.
- Preparare una sospensione di cellule singole delle cellule ES. Contare le cellule con un contaglobuli automatizzato, e trasferire 5.0 x 10 6 cellule ES ad un tubo 15 ml. Centrifugare a 100 xg, e risospendere le cellule in 800 l di PBS. Trasferire la sospensione in una cuvetta 4 mm.
- Aggiungere 20 mg mPBase Puro alla cuvetta, mescolare pipettando, e le cellule elettroporazione (fare riferimento alla sezione 1.4 per i dettagli). Distribuire le cellule transfettate su due piastre di alimentazione DR4 100 mm. Cellule di coltura O / N in media di cellule ES.
- La mattina dopo, nutrire le cellule con ES media con / ml puromicina e cultura cellule 1 mcg per 48 ore. Estrarre selezione puromicina e continuare a coltivare le cellule per 5 giorni. Quando le colonie sono abbastanza grandi per la raccolta, scegliere in una piastra di alimentazione a 96 pozzetti (vedere paragrafo 4.2).
- Quando le cellule raccolte hanno raggiunto 80-90% di confluenza, raggruppati 1/6 th della piastra in una piastra di DNA e 1/6 del plmangiato in un piatto di G418, lasciando 2/3 rds delle cellule nella piastra originale da congelare (vedi sezione 2.2 per congelamento).
- Cultura la piastra di DNA in cellule ES medio per l'isolamento del DNA più tardi, e la piastra G418 a 150 mg / ml di G418 per testare per la perdita di resistenza alla neomicina. Wells senza cellule vitali dopo 72-96 h in coltura contenente G418 indicano successo rimobilizzazione del PB trasposoni-gene trapping.
- Le corrispondenti pozzetti della piastra 'DNA' saranno proiettati mediante PCR per confermare il trasposone PB è stato rimosso. Quando la piastra DNA è 90% confluenti, isolare il DNA genomico in formato piastra da 96 pozzetti 4 per lo screening PCR per il ripristino della sequenza wild-type e l'assenza di neo-IRES come mezzo per confermare reversione.
- Scongelare i pozzetti corrispondenti della piastra di Master a 24 pozzetti ed espandere in un pallone T25 (tutti con alimentatori). Congelare quattro fiale al pallone T25 come back-up.
7. Generazione di mouse Mutanti - Recuperare le cellule ES resistenti dalle piastre master ed utilizzare per l'iniezione embrione per generare chimera. Circa 15-20 cellule ES vengono iniettate in un individuo C57BL / 6 blastocisti. Trasferimento 15 blastocisti per topo alla nell'utero di una femmina pseudopregnant (ceppo ICR). Mate la chimera maschile (indicato dal ES cellule specifico colore del mantello agouti) recuperati dalla cucciolata con diversi giovani vergini C57BL / 6J femmine di prova per la trasmissione germinale, e per costruire una colonia di topi mutanti.
- Isolare e fibroblasti cutanei prova coda di topi mutanti F1 e wild-type littermate per le specie reattive dell'ossigeno (ROS) il livello e la resistenza al paraquat 9.
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Representative Results
In un tipico esperimento mutagenesi, la trasfezione è costituito da un totale di 3 x 10 7 cellule ES con PB-UPA e Mpb trasposasi. Il numero di cellule ES geni intrappolati generati in due esperimenti indipendenti sono riassunti in Tabella 1. L'efficienza del gene-intrappolamento è di circa 0,04%. Le librerie gene-trap combinate contengono 22.400 mutanti indipendenti, di una copertura completa del genoma del topo (23.000 geni codificanti). Riempimento eccessivo potrebbe essere raggiunto generando più mutanti attraverso mutagenesi ripetuta e / o la riduzione il processo.
Poiché le librerie gene-trap contengono mutazioni casuali, non è possibile prevedere il numero di mutanti che possiedono una resistenza allo stress fenotipo. Due selezioni indipendenti per resistenza PQ sono state eseguite; lo screening combinato di 22.440 mutazioni gene-trap indipendenti scoperto 17 mutazioni che conferiscono resistenza cellulare al PQ (0,08%) (Tabella 1).
<p class = "jove_content"> Abbiamo purificato 3 cloni mutanti, il Pigl, Tiam1, e Rffl, dalle piastre master per ulteriori analisi e la produzione di mouse. Le cellule con mutazione eterozigote Rffl sono state indotte con successo a produrre progenie omozigote battendo fuori Blm. Tuttavia, non siamo riusciti a produrre tutti i mutanti omozigoti dai mutanti Pigl e Tiam1, presumibilmente a causa di una letalità cellulare omozigosi-linked. La resistenza allo stress di questi cloni purificati è stata confermata utilizzando 2 diversi tipi di stress: omissione di 2-mercaptoetanolo (2-ME) e PQ (Figura 2). Dopo rimozione del PB da questi cloni, la resistenza allo stress associata fenotipo è stato anche perso (Figura 2), confermando che le mutazioni gene-trap sono il fattore causale. Caratterizzazione dei cloni recuperate dalle piastre di master è fondamentale in quanto esclude stocastico lesione durante la selezione di stress come causa del fenotipo osservato.Su 3cellule staminali mutanti introdotti in blastocisti per la produzione di mouse (Tabella 2), 2 linee (Pigl e Tiam1) mostrano trasmissione germinale. L'iniezione Rffl prodotta solo una chimera femminile che non era un numero ottimale di chimera per cominciare. Così, il fallimento della trasmissione germinale di Rffl è probabilmente dovuto ad una chimera incompetente. Abbiamo testato il fenotipo cellulare di fibroblasti cutanei isolati da topi mutanti Pigl e ha mostrato che mantenevano il livello ridotto di endogeni specie reattive dell'ossigeno (ROS) e la resistenza allo stress di PQ (Figura 3).
Figura 1. ES mutagenesi cellulare e la selezione di stress. (A) PB-UPA vettore. Un imparziale vettore polyA (UPA) trappola composto da un splice accettore (SA), il segnale poli-adenilato ormone della crescita bovina (Pa), phosphoglycerate chinasi (PGK) promotore, neomicina fosfotransferasi (neo), interna entry site ribosomiale (IRES), e un donatore di splicing (SD) con ATG artificiale (in 3 differenti fasi di lettura) è stato clonato nel trasposone piggyBac, affiancato dal 3 ' e 5 'ripetizione terminale lunga (LTR). (B) mutagenesi casuale di cellule ES e la selezione dei cloni resistenti allo stress. Cellule staminali sono state co-trasfettate mediante elettroporazione con PB-UPA e mPBase seguita da placcatura su piastre da 96 pozzetti. Gene cloni intrappolati sono stati selezionati dalla resistenza G418; una volta confluenti, sono stati suddivisi in 2 set di repliche. Un set di replica è stata ulteriormente divisa in due metà per l'isolamento del DNA e la selezione stress paraquat (PQ); l'altro set di repliche (master) è stato congelato in giù. I sopravvissuti colonie di cellule ES recuperati dal stress trattamento sono stati analizzati per l'inserimento molecolarmente PB da Sp-PCR. I primer sono stati poi studiati per schermare la piastra di replica del DNA da cui il pozzetto contenente il SIBLIng PQ R clone stato trovato sulla piastra principale. Queste cellule sono per la resistenza allo stress test su diversi fattori di stress e per la produzione di mouse. Modificato da Chick et al. 7. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. resistenza allo stress in cellule ES mutanti. (A) Resistenza a 2-mercaptoetanolo (2-ME) recesso. (B) Resistenza al paraquat (PQ). Vengono mostrati i wild-type cellule parentali ES (C9: giallo), un controllo clone cellulare ES indeformabile, (4C11: rosso), recuperati da un precedente studio 5 e tre cloni gene-trap (grigio). Le cellule sono state sottoposte a trattamento per sottolineare due giorni, dopo di che è stato contato il numero di cellule vitali. < em> eterozigoti Pigl, Tiam1, e Rffl. (PB / +: grigio scuro) resistenza esposizione ad entrambi questi fattori di stress Rffl omozigoti (PB / PB: nero) mostrano resistenza alle sollecitazioni più forti rispetto agli eterozigoti. Resistenza a entrambi i fattori di stress è stato perso quando gli inserimenti PB sono stati rimossi (+ / +: grigio chiaro). Barre di errore rappresentano SD di media (n = 4). * P <0.001, p = 0,01 # tra i cloni gene-trap e il C9 genitori wild-type, valutate dal di Student t-test. (C) ES cellula formazione di colonie sotto PQ (10 micron) trattamento. Indeformabile ES cloni sono stati in grado di formare colonie in coltura sotto trattamento PQ mentre il numero e le dimensioni delle colonie dalla wild-type di clonazione sono stati significativamente ridotti. Modificato da Chick et al. 7. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Caratterizzazione di Pigl PB / + fibroblasti. (A) Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) di livello. Fibroblasti cutanei coda isolati da wild-type (WT) e Pigl PB / + topo sono state colorate con CM-DCFCA e la fluorescenza è stato normalizzato contro Hoechst. Il contenuto di ROS è stato espresso come unità di fluorescenza relativa (RFU). Il valore di P è stata valutata da due a coda di Student t-test (n = 8). (B) PQ resistenza. Fibroblasti cutanei coda da wild-type (WT) e Pigl PB / + topi sono stati esposti al PQ 4 mm per 6 ore, dopo di che la vitalità delle cellule sono stati misurati mediante saggi MTT. La percentuale di cellule vive dopo il trattamento PQ è stato calcolato il rapporto di assorbanza ottenuto dal ce PQ trattatiLLS e che dalle cellule non trattati. Il valore di P è stata valutata mediante uno di Student t-test coda (n = 8). Modificato da Chick et al. 7. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Biblioteca | Sub-librerie | Ceppo di cellule ES | Numero di gene intrappolato clone | Numero di cloni PQ R |
| 1 | C9PA01 - C9PA10 | C9 (BLM tet / tet) | 9.000 | 7 |
| 2 | C9PA11 - C9PA20 | C9 (BLM tet / tet) | 13.440 10 | |
| Totale | 22.440 | 17 |
Tabella 1. piggyBac gene-trap di costruzione di biblioteche e il recupero dei cloni resistenti PQ. Modificato da Chick et al. 7.
| Clone cellulare ES iniettato | Numero di chimera recuperato | Trasmissione germinale * |
| Pigl PB / Pigl + | 4 | sì |
| Tiam1 PB / Tiam1 + | 2 | sì | </ tr>
| Rffl PB / Rffl + | 1 | No |
Tabella 2. Generazione di topi. Modificato da Chick et al. 7.
* Trasmissione germinale è stata confermata dalla eredità del allele del gene-trappola rilevato mediante PCR genotipizzazione.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vector | |||
| PB-UPA | |||
| mPBase | |||
| mPBasePuro | |||
| Tissue Culture | |||
| 500-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU05RE | |
| 250-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU02RE | |
| 50-ml Steriflip-GV filters | EMD Millipore | SE1M179M6 | |
| KO DMEM | Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| FBS | Tissue Culture Biologicals | 104 | |
| Heat Inactivated FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140148 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Methyl Viologen dichloride (Paraquat) | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Dimethyl Sulphoxide Hybri-MAX | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| EmbryoMAX 0.1% gelatin | EMD Millipore | ES006B | |
| DPBS/Modified | HyClone | SH30028.02 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| T25 Flask | Corning | 353108 | |
| T75 flask | Corning | 353135 | |
| 100-mm plate | Corning | 353003 | |
| 150-mm plate | Corning | 430599 | |
| 96-well plate | Corning | 3585 | |
| 96-well U-bottom plate | Corning | 3799 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 50-ml reservoir | Corning | 4870 | |
| 15-ml tubes | VWR International, LLC | 82050-276 | |
| Primary Mouse Embryonic Fibroblasts | EMD Millipore | PMEF-NL | |
| DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts | Applied StemCell | ASF-1001 | |
| Mitomycin C | Fisher BioReagents | BP25312 | |
| Geneticin (G418) | Life Technologies | 11811-023 | |
| Doxycycline | Fisher BioReagents | BP26531 | |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 377267 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| TC10 cell counter | Bio-Rad | ||
| Counting Slides (for TC10) | Bio-Rad | 1450011 | |
| Electroporation | |||
| Gene Pulser Xcell | Bio-Rad | 1652611 | |
| Gene Pulser Cuvettes (4 mm gap) | Bio-Rad | 1652088 | |
| Molecular Biology | |||
| Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercylcer ep Gradient S | |
| Puregene Core kit B | Qiagen | 158745 | |
| Topo-TA Cloning kit | Life Technologies | 450030 | |
| High Capacity cDNA synthesis kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 | |
| 100% ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2716 | |
| Double Processed Tissue Culture Water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Sau3A1 | New England BioLabs | R0169L | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202T | |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S | |
| 96-well Lysis Buffer (Ramires-Solis et al. 1992) | |||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher BioReagents | A144-212 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L5777 | |
| Proteinase-K | Fisher BioReagents | BP1700 | |
| Electrophoresis | |||
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad | 170-4469EDU | |
| LE Agarose | GeneMate | E3120500 | |
| Ethidium Bromide | Fisher BioReagents | BP1302 | |
| 100 BP DNA Ladder | New England BioLabs | N3231S | |
| 1 Kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S | |
| 2-log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200L | |
References
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