Approche génétique de l'avant pour découvrir les gènes de résistance au stress chez la souris - un écran haute-débit dans les cellules ES
Summary
La résistance au stress est l'une des caractéristiques de longévité et est connu pour être génétiquement régie. Ici, nous avons développé une méthode à haut débit impartiale pour le dépistage de mutations qui confèrent la résistance au stress dans des cellules ES avec laquelle de développer des modèles de souris pour les études de longévité.
Abstract
Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely limits its potential. We describe here the use of mouse embryonic stem (ES) cells as surrogate cells to screen for a phenotype of interest and subsequently introduce these cells into a host embryo to develop into a living mouse carrying the phenotype. This method provides (1) a cost effective, high-throughput platform for genetic screen in mammalian cells; (2) a rapid way to identify the mutated genes and verify causality; and (3) a short-cut to develop mouse mutants directly from these selected ES cells for whole animal studies. We demonstrated the use of paraquat (PQ) to select resistant mutants and identify mutations that confer oxidative stress resistance. Other stressors or cytotoxic compounds may also be used to screen for resistant mutants to uncover novel genetic determinants of a variety of cellular stress resistance.
Introduction
Longévité a une relation intime avec la résistance au stress. En général, les espèces à long terme démontrent souvent une résistance accrue vers de multiples facteurs de stress, tels que le peroxyde d'hydrogène, le paraquat (PQ), UV, de la chaleur, et des métaux lourds 1,2. En revanche, la sensibilité accrue au stress a tendance à prédire la durée de vie réduite et / ou un phénotype de la maladie plus sujette. La voie de balayage anti-oxydant a longtemps été supposé jouer un rôle important pour conférer une résistance au stress à l'animal. Cependant, à quelques exceptions près, les études d'une variété d'animaux transgéniques à des manipulations dans divers enzymes anti-oxydantes (par exemple, SOD) indiquent que l'augmentation du niveau d'enzymes d'évacuation des oxydants ne pas augmenter la durée de vie ou durée de la santé 3. Ces données suggèrent que le caractère de résistance au stress constamment observés chez des animaux à long terme est médiée par d'autres voies cellulaires encore être découverts.
Nous avons pris une avance impartialeapproche génétique pour identifier des gènes, qui sur muté, peut conférer un phénotype de résistance au stress chez souches embryonnaires (ES) de culture des cellules. Les cellules ES offrent deux avantages majeurs dans cette étude: (1) les manipulations génétiques sophistiqués sont disponibles pour modifier le génome des cellules ES; et (2) les cellules ES résistantes au stress récupérés de l'écran peuvent être directement utilisés pour la production de la souris, ce qui permet la traduction rapide dans les études animales entières pour mesurer la durée de vie et la durée de la santé.
Dans ce rapport, nous avons décrit l'utilisation de la lignée cellulaire ES C9, dans laquelle les allèles BLM étaient sous le contrôle d'un élément sensible à la tétracycline. Traitement de la doxycycline (Dox) transitoirement éteint l'expression de Blm conduisant à une augmentation des incidents échange de chromatides sœurs. Ce court-terme Blm knock-out a permis la génération de mutations homozygotes sein de la population hétérozygote sorte que des mutations récessives pour la résistance au stress pourraient être capturés dans le processus de sélection. nousdécrit également l'utilisation de piggyBac (PB) en tant que le transposon mutagene au hasard pour insérer un poly-Cassette de piégeage (PB-UPA) pour muter des gènes dans le génome. Les cellules avec la perturbation d'un gène par la poly-Un piège est devenu résistant à G418 et pourraient être récupérés de sorte qu'une collection de mutants de piégeage de gènes (bibliothèque de piégeage de gènes) pourrait être faite, et ensuite pour produire des clones mutants qui étaient résistant au stress.
Les clones résistants au stress récupérés à partir de la sélection peuvent être caractérisés assez rapidement par des techniques moléculaires en ce qui concerne le nombre d'insertions (qPCR), le site d'insertion (splinkerette PCR), l'identité du gène perturbé (BLAST), et son niveau d'expression ( RT-qPCR). L'insertion de PB pourrait être remobilisé par expression transitoire de MPB transposase dans le clone de restaurer la séquence d'ADN de type sauvage et donc tester pour la perte de résistance au stress. Ce sont des moyens puissants pour confirmer la causalité de la mutation, ce qui devrait être fait avantpour la production de souris coûteux. Des études antérieures ont montré que les cellules exposées à des facteurs de stress ont perdu leur 4,5 pluripotence. Ainsi, dans ce protocole, la préservation d'un jeu de répliques de cellules mutantes, qui ne serait pas traitée avec les facteurs de stress est critique pour la production de la souris succès.
Notre laboratoire a conçu la lignée cellulaire ES C9 et le vecteur PB-UPA, les deux sont disponibles à d'autres enquêteurs sur demande. Le protocole présenté ici va commencer par la génération de novo bibliothèque de cellules ES gène piégé avec PB-UPA (figure 1A), suivis par des répliques et la sélection de stress pour isoler des clones résistants au stress (figure 1B). Nous avons démontré la sélection avec le paraquat, un puissant générateur de radicaux libres dans les cellules. Pratiquement, tout composé cytotoxique ou une toxine, par exemple, les facteurs de stress ER (par exemple, la thapsigargine et tunicamycine), oxydant neuronale (par exemple, MPP +, la dopamine 6-hydroxy, et la roténone), la chaleur, et lourdmétaux (par exemple, Cd, Se), pourraient être adaptés à la méthode de sélection de mutants résistants respectifs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forward genetic analysis allows for an unbiased interrogation of the genome for genes responsible for a specific phenotype. This method is very powerful to uncover novel gene functions. It has been widely used in lower organisms but not in mammal, such as the mouse, mainly due to the extremely high cost associated with the infrastructure and logistics that would entail. Here, we moved the genetic screening process to the ES cell culture platform, greatly increasing the efficiency and throughput in generating mutants a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank the Wellcome Trust Sanger Institute for the gifts of piggyBac transposon and piggyBac transposase. This work was supported by the Butcher grant of Colorado and the NIH R01 AG041801 (W.S.C).
Materials
| Vector | ||
| PB-UPA | ||
| mPBase | ||
| mPBasePuro | ||
| Tissue Culture | ||
| 500-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU05RE |
| 250-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU02RE |
| 50-ml Steriflip-GV filters | EMD Millipore | SE1M179M6 |
| KO DMEM | Life Technologies | 10829-018 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 |
| FBS | Tissue Culture Biologicals | 104 |
| Heat Inactivated FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500 |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 |
| Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140148 |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 |
| Methyl Viologen dichloride (Paraquat) | Sigma-Aldrich | 856177 |
| Dimethyl Sulphoxide Hybri-MAX | Sigma-Aldrich | D2650 |
| EmbryoMAX 0.1% gelatin | EMD Millipore | ES006B |
| DPBS/Modified | HyClone | SH30028.02 |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 |
| T25 Flask | Corning | 353108 |
| T75 flask | Corning | 353135 |
| 100-mm plate | Corning | 353003 |
| 150-mm plate | Corning | 430599 |
| 96-well plate | Corning | 3585 |
| 96-well U-bottom plate | Corning | 3799 |
| 24-well plate | Corning | 3526 |
| 50-ml reservoir | Corning | 4870 |
| 15-ml tubes | VWR International, LLC | 82050-276 |
| Primary Mouse Embryonic Fibroblasts | EMD Millipore | PMEF-NL |
| DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts | Applied StemCell | ASF-1001 |
| Mitomycin C | Fisher BioReagents | BP25312 |
| Geneticin (G418) | Life Technologies | 11811-023 |
| Doxycycline | Fisher BioReagents | BP26531 |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 377267 |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 |
| TC10 cell counter | Bio-Rad | |
| Counting Slides (for TC10) | Bio-Rad | 1450011 |
| Electroporation | ||
| Gene Pulser Xcell | Bio-Rad | 1652611 |
| Gene Pulser Cuvettes (4 mm gap) | Bio-Rad | 1652088 |
| Molecular Biology | ||
| Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercylcer ep Gradient S |
| Puregene Core kit B | Qiagen | 158745 |
| Topo-TA Cloning kit | Life Technologies | 450030 |
| High Capacity cDNA synthesis kit | Applied Biosystems | 4368814 |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 |
| 100% ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2716 |
| Double Processed Tissue Culture Water | Sigma-Aldrich | W3500 |
| Sau3A1 | New England BioLabs | R0169L |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202T |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S |
| 96-well Lysis Buffer (Ramires-Solis et al. 1992) | ||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
| Hydrochloric Acid | Fisher BioReagents | A144-212 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L5777 |
| Proteinase-K | Fisher BioReagents | BP1700 |
| Electrophoresis | ||
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad | 170-4469EDU |
| LE Agarose | GeneMate | E3120500 |
| Ethidium Bromide | Fisher BioReagents | BP1302 |
| 100 BP DNA Ladder | New England BioLabs | N3231S |
| 1Kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S |
| 2-log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200L |
References
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