Stresstoleranse er et av kjennetegnene for lang levetid og er kjent for å være genetisk styrt. Her har vi utviklet en objektiv høy gjennomstrømming metoden for å screene for mutasjoner som stresstoleranse i ES-celler med å utvikle musemodeller for lang levetid studier.
Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely limits its potential. We describe here the use of mouse embryonic stem (ES) cells as surrogate cells to screen for a phenotype of interest and subsequently introduce these cells into a host embryo to develop into a living mouse carrying the phenotype. This method provides (1) a cost effective, high-throughput platform for genetic screen in mammalian cells; (2) a rapid way to identify the mutated genes and verify causality; and (3) a short-cut to develop mouse mutants directly from these selected ES cells for whole animal studies. We demonstrated the use of paraquat (PQ) to select resistant mutants and identify mutations that confer oxidative stress resistance. Other stressors or cytotoxic compounds may also be used to screen for resistant mutants to uncover novel genetic determinants of a variety of cellular stress resistance.
Longevity har et intimt forhold til stresstoleranse. Generelt er langlivede arter ofte demonstrere økt resistens mot flere stressfaktorer, slik som hydrogenperoksyd, paraquat (PQ), UV, varme, og tungmetaller 1,2. I kontrast, økt følsomhet for påkjenninger har en tendens til å forutsi forkortet levetid og / eller et mer sykdoms utsatt fenotype. Den anti-oxidant fjerningsveien har lenge vært spekulert å spille en viktig rolle i overdragelse stresstoleranse til dyret. Imidlertid, med få unntak, studier fra en rekke av transgene dyr med manipuleringer i forskjellige anti-oksiderende enzymer (f.eks SOD) indikerer at ved å øke nivået av oksidant fjernende enzymer ikke øker levetiden eller helse span 3. Disse data tyder på at stresstoleranse egenskap konsekvent observert i langlivede dyr som er mediert av andre cellulære veier som ennå ikke er avdekket.
Vi tok en objektiv fremgenetisk tilnærming for å identifisere gener, som ved mutert, kan konferere en stresstoleranse fenotype i dyrkede embryoniske stamceller (ES-celler). ES-celler gir to store fordeler i denne studien: (1) sofistikerte genetiske manipulasjoner er tilgjengelige for å modifisere genomet til ES-celler; og (2) eventuelle belastnings resistente ES-celler utvinnes fra skjermen kan brukes direkte for mus produksjon, noe som muliggjør rask oversettelse til hele dyrestudier for å måle levetid og helse span.
I denne rapporten, vi beskrevet anvendelse av C9 ES-cellelinjen, hvor BLM lene var under kontroll av en tetracyklin-reagerende element. Behandling av doksycyklin (DOX) midlertidig slått av uttrykk for Blm fører til økt hendelse av søsterkromatidutveksling. Denne korttids Blm knock-out tillatt for generering av homozygote mutasjoner innenfor heterozygote populasjonen slik at recessive mutasjoner for stresstoleranse kan bli fanget i screening prosessen. Viogså beskrevet anvendelse av piggyBac (PB) transposon som mutagen for å sette inn et tilfeldig poly-A felle kassett (PB-UPA) å mutere gener i genomet. Celler med avbrudd av et gen av poly-A-felle ble G418-resistente og kunne utvinnes, slik at en samling av gen-felle mutanter (gen-bibliotek felle) kan bli gjort, og deretter screenet for mutante kloner som var resistente belastning.
Stress resistente kloner utvinnes fra utvalget kan være preget snarere raskt ved molekylære teknikker med hensyn på antall innsettinger (qPCR), stedet for innsetting (splinkerette PCR), identiteten til forstyrret genet (BLAST), og dets ekspresjon nivå ( RT-qPCR). PB innsetting kan remobilized ved transient ekspresjon av MPB transposase i klon for å gjenopprette villtype DNA-sekvensen og således teste for tap av stresstoleranse. Dette er kraftige måter å bekrefte kausalitet av mutasjonen, som bør gjøres førtil dyre mus produksjon. Tidligere studier har vist at celler eksponert for stressfaktorer mistet sin pluripotency 4,5. Således, i denne protokollen, er bevaringen av en replika sett av mutante celler, noe som ikke ville bli behandlet med stressfaktorer kritisk for vellykket mus produksjon.
Vår lab har konstruert den C9 ES cellelinje og PB-UPA vektor, begge er tilgjengelige for andre forskere på forespørsel. Av protokollen angitt her, vil starte ved generering av de novo bibliotek av gen-fanget ES-celler med PB-UPA (figur 1A), etterfulgt av kopiplate og utvelgelse spenning for å isolere belastnings resistente kloner (figur 1B). Vi demonstrerte valget med paraquat, et potent fri radikal generator inne i cellene. Praktisk talt hvilken som helst cytotoksiske forbindelse eller toksin, for eksempel, ER stressfaktorer (f.eks thapsigargin og tunicamycin), neuronal oksidasjonsmiddel (f.eks MPP +, 6-hydroksy-dopamin- og rotenon), varme og tungmetaller (f.eks, Cd, Se), kan være tilpasset til fremgangsmåten for å selektere for de respektive resistente mutanter.
Forward genetic analysis allows for an unbiased interrogation of the genome for genes responsible for a specific phenotype. This method is very powerful to uncover novel gene functions. It has been widely used in lower organisms but not in mammal, such as the mouse, mainly due to the extremely high cost associated with the infrastructure and logistics that would entail. Here, we moved the genetic screening process to the ES cell culture platform, greatly increasing the efficiency and throughput in generating mutants a…
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank the Wellcome Trust Sanger Institute for the gifts of piggyBac transposon and piggyBac transposase. This work was supported by the Butcher grant of Colorado and the NIH R01 AG041801 (W.S.C).
Vector | ||
PB-UPA | ||
mPBase | ||
mPBasePuro | ||
Tissue Culture | ||
500-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU05RE |
250-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU02RE |
50-ml Steriflip-GV filters | EMD Millipore | SE1M179M6 |
KO DMEM | Life Technologies | 10829-018 |
DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 |
FBS | Tissue Culture Biologicals | 104 |
Heat Inactivated FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500 |
LIF | EMD Millipore | ESG1107 |
Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140148 |
β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 |
Methyl Viologen dichloride (Paraquat) | Sigma-Aldrich | 856177 |
Dimethyl Sulphoxide Hybri-MAX | Sigma-Aldrich | D2650 |
EmbryoMAX 0.1% gelatin | EMD Millipore | ES006B |
DPBS/Modified | HyClone | SH30028.02 |
0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 |
T25 Flask | Corning | 353108 |
T75 flask | Corning | 353135 |
100-mm plate | Corning | 353003 |
150-mm plate | Corning | 430599 |
96-well plate | Corning | 3585 |
96-well U-bottom plate | Corning | 3799 |
24-well plate | Corning | 3526 |
50-ml reservoir | Corning | 4870 |
15-ml tubes | VWR International, LLC | 82050-276 |
Primary Mouse Embryonic Fibroblasts | EMD Millipore | PMEF-NL |
DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts | Applied StemCell | ASF-1001 |
Mitomycin C | Fisher BioReagents | BP25312 |
Geneticin (G418) | Life Technologies | 11811-023 |
Doxycycline | Fisher BioReagents | BP26531 |
Cryotubes | Thermo Scientific | 377267 |
Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 |
TC10 cell counter | Bio-Rad | |
Counting Slides (for TC10) | Bio-Rad | 1450011 |
Electroporation | ||
Gene Pulser Xcell | Bio-Rad | 1652611 |
Gene Pulser Cuvettes (4 mm gap) | Bio-Rad | 1652088 |
Molecular Biology | ||
Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercylcer ep Gradient S |
Puregene Core kit B | Qiagen | 158745 |
Topo-TA Cloning kit | Life Technologies | 450030 |
High Capacity cDNA synthesis kit | Applied Biosystems | 4368814 |
NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 |
100% ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2716 |
Double Processed Tissue Culture Water | Sigma-Aldrich | W3500 |
Sau3A1 | New England BioLabs | R0169L |
T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202T |
EcoRV | New England BioLabs | R3195S |
96-well Lysis Buffer (Ramires-Solis et al. 1992) | ||
Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
Hydrochloric Acid | Fisher BioReagents | A144-212 |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 |
N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L5777 |
Proteinase-K | Fisher BioReagents | BP1700 |
Electrophoresis | ||
Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad | 170-4469EDU |
LE Agarose | GeneMate | E3120500 |
Ethidium Bromide | Fisher BioReagents | BP1302 |
100 BP DNA Ladder | New England BioLabs | N3231S |
1Kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S |
2-log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200L |