Summary

Enfoque genético adelante para descubrir Estrés Los genes de resistencia en ratones - Una pantalla de alto rendimiento en células madre embrionarias

Published: November 11, 2015
doi:

Summary

Resistencia al estrés es una de las señas de identidad de la longevidad y es conocido por ser gobernado genéticamente. Aquí, hemos desarrollado un método de alto rendimiento imparcial para la detección de mutaciones que confieren resistencia al estrés en células madre embrionarias con el que desarrollan modelos de ratón para estudios de longevidad.

Abstract

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely limits its potential. We describe here the use of mouse embryonic stem (ES) cells as surrogate cells to screen for a phenotype of interest and subsequently introduce these cells into a host embryo to develop into a living mouse carrying the phenotype. This method provides (1) a cost effective, high-throughput platform for genetic screen in mammalian cells; (2) a rapid way to identify the mutated genes and verify causality; and (3) a short-cut to develop mouse mutants directly from these selected ES cells for whole animal studies. We demonstrated the use of paraquat (PQ) to select resistant mutants and identify mutations that confer oxidative stress resistance. Other stressors or cytotoxic compounds may also be used to screen for resistant mutants to uncover novel genetic determinants of a variety of cellular stress resistance.

Introduction

La longevidad tiene una íntima relación con la resistencia al estrés. En general, las especies de larga vida a menudo muestran una mayor resistencia a múltiples factores de estrés, como el peróxido de hidrógeno, el paraquat (PQ), UV, calor, y metales pesados ​​1,2. Por el contrario, el aumento de la sensibilidad al estrés tiende a predecir acortada duración de la vida y / o un fenotipo más propenso a la enfermedad. La vía de eliminación de anti-oxidante mucho tiempo se ha especulado que desempeñar un papel importante en el estrés que confiere resistencia al animal. Sin embargo, con pocas excepciones, los estudios de una variedad de animales transgénicos con manipulaciones en varias enzimas antioxidantes (por ejemplo, SOD) indican que el aumento del nivel de las enzimas oxidantes de barrido no aumenta la vida útil o la duración de la salud 3. Estos datos sugieren que el rasgo de resistencia al estrés observado consistentemente en animales de larga vida está mediada por otras vías celulares aún no se ha descubierto.

Tomamos un avance imparcialenfoque genético para identificar genes, que tras la mutado, puede conferir un fenotipo de resistencia a la tensión en las células madre embrionarias cultivadas (ES). Células ES ofrecen dos ventajas importantes en este estudio: (1) las manipulaciones genéticas sofisticados están disponibles para modificar el genoma de las células ES; y (2) cualesquiera células ES resistentes a estrés recuperados de la pantalla se pueden utilizar directamente para la producción de ratón, que permite la traducción rápida en los estudios en animales enteros para medir duración de la vida y la duración de la salud.

En este informe, se describe el uso de la línea celular de C9 ES, en el que los alelos Blm estaban bajo el control de un elemento sensible a la tetraciclina. El tratamiento de doxiciclina (dox) transitoriamente apagó la expresión de Blm que representan un aumento de incidentes de intercambio de cromátidas hermanas. Este corto plazo Blm Knock-Out permitido para la generación de mutaciones homocigóticas dentro de la población heterocigoto para que mutaciones recesivas para la resistencia al estrés podrían ser capturados en el proceso de selección. NosotrosTambién se describe el uso de piggyBac (PB) transposón como el mutágeno para insertar aleatoriamente un poli-A trampa de casete (PB-UPA) para mutar genes en el genoma. Las células con alteración de un gen por la poli-Una trampa convirtieron G418 resistentes y pueden ser recuperados de manera que una colección de mutantes gen-trampa (gen-trampa de biblioteca) se podría hacer, y posteriormente se proyectó para los clones mutantes que eran resistentes estrés.

Los clones resistentes a estrés recuperados de la selección se podrían caracterizar con bastante rapidez por técnicas moleculares con respecto del número de inserciones (qPCR), el sitio de inserción (splinkerette PCR), la identidad del gen alterado (BLAST), y su nivel de expresión ( RT-qPCR). La inserción PB podría removilizado por la expresión transitoria de MPB transposasa en el clon para restaurar la secuencia de ADN de tipo salvaje y por lo tanto la prueba de la pérdida de resistencia al estrés. Estas son formas poderosas para confirmar la causalidad de la mutación, que se deben hacer antesa la producción de ratón caro. Estudios anteriores demostraron que las células expuestas a factores estresantes perdieron 4,5 pluripotencia. Por lo tanto, en este protocolo, la preservación de un conjunto de réplicas de células mutantes, que no se puede tratar con los factores de estrés es fundamental para la producción exitosa de ratón.

Nuestro laboratorio ha diseñado la línea celular de C9 ES y el vector PB-UPA, ambos están a disposición de otros investigadores que lo soliciten. El protocolo informó aquí se iniciará por la generación de novo de la biblioteca de genes de las células ES-atrapado con PB-UPA (Figura 1A), seguido por réplica en placa y la selección de estrés para aislar clones resistentes de estrés (Figura 1B). Hemos demostrado la selección con paraquat, un potente generador de radicales libres en las células. Prácticamente, cualquier compuesto citotóxico o una toxina, por ejemplo, factores de estrés ER (por ejemplo, thapsigargin y tunicamicina), oxidante neuronal (por ejemplo, MPP +, la dopamina 6-hidroxi, y rotenona), el calor, y pesadometales (por ejemplo, CD, Se), podrían adaptarse para el método para seleccionar para mutantes resistentes respectivos.

Protocol

1. Gen-atrapado ES Cell Biblioteca de construcción que usa piggyBac Transposón Preparar fibroblastos de embriones de ratón primaria (PMEF) como alimentadores para el cultivo de células ES Descongelar un vial de C inactivado PMEF mitomicina (5,0 x 10 6) en un baño de agua a 37 ° C. Transferencia de las células en 5 ml de medio de células ES (DMEM que contiene 15% de FBS, 1.000 unidades / ml de factores inhibidor de la leucemia, 100 mM aminoácidos no esenciales, glutamina 2…

Representative Results

En un experimento típico mutagénesis, la transfección se compone de un total de 3 x 10 7 células madre embrionarias con PB-UPA y MPB transposasa. Los números de células ES de genes generadas atrapado en dos experimentos independientes se resumen en la Tabla 1. La eficiencia de atrapamiento de genes es de aproximadamente 0,04%. Las bibliotecas de genes trampa combinados contienen 22.400 mutantes independientes, acerca de una cobertura completa del genoma del ratón (23.0…

Discussion

Forward genetic analysis allows for an unbiased interrogation of the genome for genes responsible for a specific phenotype. This method is very powerful to uncover novel gene functions. It has been widely used in lower organisms but not in mammal, such as the mouse, mainly due to the extremely high cost associated with the infrastructure and logistics that would entail. Here, we moved the genetic screening process to the ES cell culture platform, greatly increasing the efficiency and throughput in generating mutants a…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank the Wellcome Trust Sanger Institute for the gifts of piggyBac transposon and piggyBac transposase. This work was supported by the Butcher grant of Colorado and the NIH R01 AG041801 (W.S.C).

Materials

Vector
PB-UPA
mPBase
mPBasePuro
Tissue Culture 
500-ml Stericup filters EMD Millipore SCGPU05RE
250-ml Stericup filters EMD Millipore SCGPU02RE
50-ml Steriflip-GV filters EMD Millipore SE1M179M6
KO DMEM Life Technologies 10829-018
DMEM Sigma-Aldrich D6429
FBS Tissue Culture Biologicals 104
Heat Inactivated FBS Sigma-Aldrich F4135-500
LIF EMD Millipore ESG1107
Non-essential Amino Acids Life Technologies 11140-050
GlutaMAX Life Technologies 35050-061
Pen/Strep Life Technologies 15140148
β-Mercaptoethanol Life Technologies 21985-023
Methyl Viologen dichloride (Paraquat) Sigma-Aldrich 856177
Dimethyl Sulphoxide Hybri-MAX Sigma-Aldrich D2650
EmbryoMAX 0.1% gelatin EMD Millipore ES006B
DPBS/Modified HyClone SH30028.02
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200-056
T25 Flask Corning 353108
T75 flask Corning 353135
100-mm  plate Corning 353003
150-mm  plate Corning 430599
96-well  plate Corning 3585
96-well U-bottom plate Corning 3799
24-well plate Corning 3526
50-ml reservoir  Corning 4870
15-ml tubes VWR International, LLC 82050-276
Primary Mouse Embryonic Fibroblasts EMD Millipore PMEF-NL
DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts Applied StemCell ASF-1001
Mitomycin C Fisher BioReagents  BP25312
Geneticin (G418) Life Technologies 11811-023
Doxycycline Fisher BioReagents  BP26531
Cryotubes Thermo Scientific 377267
Centrifuge  Eppendorf Centrifuge 5702
TC10 cell counter Bio-Rad
Counting Slides (for TC10) Bio-Rad 1450011
Electroporation 
Gene Pulser Xcell Bio-Rad 1652611
Gene Pulser Cuvettes (4 mm gap) Bio-Rad 1652088
Molecular Biology 
Thermal Cycler Eppendorf Mastercylcer ep Gradient  S
Puregene Core kit B Qiagen 158745
Topo-TA Cloning kit Life Technologies  450030
High Capacity cDNA synthesis kit Applied Biosystems 4368814
NaCl Fisher BioReagents  BP358-212
100% ethanol Decon Laboratories, Inc. 2716
Double Processed Tissue Culture Water Sigma-Aldrich W3500
Sau3A1 New England BioLabs R0169L
T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202T
EcoRV New England BioLabs R3195S
96-well Lysis Buffer (Ramires-Solis et al. 1992)
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503
Hydrochloric Acid Fisher BioReagents  A144-212
EDTA Sigma-Aldrich E5134
N-Lauroylsarcosine sodium salt Sigma-Aldrich L5777
Proteinase-K Fisher BioReagents  BP1700
Electrophoresis
Mini-Sub Cell GT Bio-Rad 170-4469EDU
LE Agarose  GeneMate E3120500
Ethidium Bromide  Fisher BioReagents  BP1302
100 BP DNA Ladder New England BioLabs N3231S
1Kb DNA Ladder New England BioLabs N3232S
2-log DNA Ladder New England BioLabs N3200L

References

  1. Johnson, T. E., et al. Longevity genes in the nematode Caenorhabditis elegans also mediate increased resistance to stress and prevent disease. J Inherit Metab Dis. 25, 197-206 (2002).
  2. Murakami, S., Salmon, A., Miller, R. A. Multiplex stress resistance in cells from long-lived dwarf mice. Faseb J. 17, 1565-1566 (2003).
  3. Perez, V. I., et al. The overexpression of major antioxidant enzymes does not extend the lifespan of mice. Aging Cell. 8, 73-75 (2009).
  4. Martin, G. M. Genetic engineering of mice to test the oxidative damage theory of aging. Ann NY Acad Sci. 1055, 26-34 (2005).
  5. Chick, W. S., Drechsel, D. A., Hammond, W., Patel, M., Johnson, T. E. Transmission of mutant phenotypes from ES cells to adult mice. Mamm Genome. 20, 734-740 (2009).
  6. Ramirez-Solis, R., et al. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Anal Biochem. 201, 331-335 (1992).
  7. Uren, A. G., et al. A high-throughput splinkerette-PCR method for the isolation and sequencing of retroviral insertion sites. Nat Protoc. 4, 789-798 (2009).
  8. Wang, W., Bradley, A., Huang, Y. A piggyBac transposon-based genome-wide library of insertionally mutated Blm-deficient murine ES cells. Genome Res. 19, 667-673 (2009).
  9. Chick, W. S., et al. Screening for stress-resistance mutations in the mouse. Front Genet. 5, 310 (2014).
  10. Salmon, A. B., et al. Fibroblast cell lines from young adult mice of long-lived mutant strains are resistant to multiple forms of stress. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 23-29 (2005).
  11. Skarnes, W. C., et al. A public gene trap resource for mouse functional genomics. Nat Genet. 36, 543-544 (2015).
  12. Baker, K. E., Parker, R. Nonsense-mediated mRNA decay: terminating erroneous gene expression. Curr Opin Cell Biol. 16, 293-299 (2004).
  13. Shigeoka, T., Kawaichi, M., Ishida, Y. Suppression of nonsense-mediated mRNA decay permits unbiased gene trapping in mouse embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 33, e20 (2004).
  14. Symula, D. J., Zhu, Y., Schimenti, J. C., Rubin, E. M. Functional annotation of mouse mutations in embryonic stem cells by use of expression profiling. Mamm Genome. 15, 1-13 (2004).

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Cite This Article
Ludwig, M., Kitzenberg, D., Chick, W. S. Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice — A High-throughput Screen in ES Cells. J. Vis. Exp. (105), e53062, doi:10.3791/53062 (2015).

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