Stresstålighet är ett av kännetecknen för livslängd och är känd för att vara genetiskt styrda. Här har vi tagit fram en opartisk hög genomströmning metod för att screena för mutationer som ger stresstålighet i ES-celler med för att utveckla musmodeller för livslängd studier.
Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely limits its potential. We describe here the use of mouse embryonic stem (ES) cells as surrogate cells to screen for a phenotype of interest and subsequently introduce these cells into a host embryo to develop into a living mouse carrying the phenotype. This method provides (1) a cost effective, high-throughput platform for genetic screen in mammalian cells; (2) a rapid way to identify the mutated genes and verify causality; and (3) a short-cut to develop mouse mutants directly from these selected ES cells for whole animal studies. We demonstrated the use of paraquat (PQ) to select resistant mutants and identify mutations that confer oxidative stress resistance. Other stressors or cytotoxic compounds may also be used to screen for resistant mutants to uncover novel genetic determinants of a variety of cellular stress resistance.
Livslängd har en intim relation med stresstålighet. I allmänhet, ofta långlivade arter uppvisar ökad resistens mot flera stressfaktorer, såsom väteperoxid, parakvat (PQ), UV, värme, och tungmetaller 1,2. I motsats, ökad känslighet för stress tenderar att förutsäga livslängd förkortas och / eller en mer sjukdom som ofta drabbas fenotyp. Den antioxidant elimineringsvägen har länge spekulerats spela en viktig roll i överföra stressresistens till djuret. Men med några få undantag, studier från olika transgena djur med manipulationer i olika antioxidant enzymer (t.ex. SOD) tyder på att höja nivån på oxiderande eliminerings enzymer inte ökar livslängden eller hälsa span 3. Dessa data tyder på att stresstålighet drag konsekvent observerats i långlivade djur förmedlas av andra cellulära vägar ännu inte avslöjats.
Vi tog en opartisk framåtgenetiska tillvägagångssätt för att identifiera gener, som vid muterade, kunde ger en stresstålighet fenotyp i odlade embryonala stamceller (ES-celler). ES-celler har två stora fördelar i denna studie: (1) avancerade genetiska manipulationer finns tillgängliga för att modifiera genomet hos ES-celler; och (2) kan någon stress resistenta ES-celler som återvunnits från skärmen direkt användas för framställning mus, tillåter snabb översättning till hela djurstudier för att mäta livslängden och hälsa spännvidd.
I denna rapport beskrivs vi användning av C9 ES-cellinje, i vilken de BLM alleler var under kontroll av en tetracyklin responsivt element. Behandling av doxycyklin (DOX) gående avstängd uttrycket av Blm leder till ökad incident av systerkromatidutbyte. Denna kortsiktiga Blm knock-out tillåtet för generering av homozygota mutationer inom heterozygot befolkningen så att recessiva mutationer för stresstålighet kunde fångas i urvalsförfarandet. Viockså beskrivit användningen av piggyBac (PB) transposonet som mutagener till slumpmässigt sätt i ett poly-A-fälla kassett (PB-UPA) att mutera gener i genomet. Celler med avbrott av en gen av poly-A-fällan blev G418 resistenta och kunde återvinnas, så att en samling av gen-trap mutanter (gen-fälla bibliotek) skulle kunna göras, och därefter screenas för mutanta kloner som var stresstålig.
Stress resistenta kloner återhämtat sig från valet skulle kunna karakteriseras tämligen snabbt av molekylära tekniker när det gäller antalet insättningar (qPCR), platsen för insättnings (splinkerette PCR), identiteten hos den störs-genen (BLAST), och dess uttrycksnivån ( RT-qPCR). PB insättning kunde remobilized genom transient expression av MPB transposas i klonen för att återställa den av vildtyp-DNA-sekvensen och sålunda testa för förlusten av stressresistens. Dessa är kraftfulla sätt att bekräfta kausalitet mutationen, som bör göras företill dyra produktions mus. Tidigare studier visade att celler som utsätts för stressfaktorer förlorat sin pluripotens 4,5. Således, i detta protokoll, är bevarandet av en kopia uppsättning muterade celler, som inte skulle behandlas med stress avgörande för framgångsrik produktion mus.
Vårt laboratorium har konstruerat C9 ES-cell linje och PB-UPA vektor, båda är tillgängliga för andra forskare på begäran. Protokollet redovisas här kommer att börja med generering av de novo bibliotek av gen-fångade ES-celler med PB-UPA (Figur 1A), följt av replica plating och urval stress isolera spännings resistenta kloner (Figur 1B). Vi visade valet med parakvat, en potent friradikalbildare inuti celler. Praktiskt taget varje cytotoxisk förening eller toxin, till exempel, ER stressfaktorer (t.ex., tapsigargin och Tunikamycin), neuronal oxidationsmedel (t.ex., MPP +, 6-hydroxi dopamin och rotenon), värme, och tungametaller (t ex Cd, Se), skulle kunna anpassas till den metod för att välja för respektive resistenta mutanter.
Forward genetic analysis allows for an unbiased interrogation of the genome for genes responsible for a specific phenotype. This method is very powerful to uncover novel gene functions. It has been widely used in lower organisms but not in mammal, such as the mouse, mainly due to the extremely high cost associated with the infrastructure and logistics that would entail. Here, we moved the genetic screening process to the ES cell culture platform, greatly increasing the efficiency and throughput in generating mutants a…
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank the Wellcome Trust Sanger Institute for the gifts of piggyBac transposon and piggyBac transposase. This work was supported by the Butcher grant of Colorado and the NIH R01 AG041801 (W.S.C).
Vector | ||
PB-UPA | ||
mPBase | ||
mPBasePuro | ||
Tissue Culture | ||
500-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU05RE |
250-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU02RE |
50-ml Steriflip-GV filters | EMD Millipore | SE1M179M6 |
KO DMEM | Life Technologies | 10829-018 |
DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 |
FBS | Tissue Culture Biologicals | 104 |
Heat Inactivated FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500 |
LIF | EMD Millipore | ESG1107 |
Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140148 |
β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 |
Methyl Viologen dichloride (Paraquat) | Sigma-Aldrich | 856177 |
Dimethyl Sulphoxide Hybri-MAX | Sigma-Aldrich | D2650 |
EmbryoMAX 0.1% gelatin | EMD Millipore | ES006B |
DPBS/Modified | HyClone | SH30028.02 |
0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 |
T25 Flask | Corning | 353108 |
T75 flask | Corning | 353135 |
100-mm plate | Corning | 353003 |
150-mm plate | Corning | 430599 |
96-well plate | Corning | 3585 |
96-well U-bottom plate | Corning | 3799 |
24-well plate | Corning | 3526 |
50-ml reservoir | Corning | 4870 |
15-ml tubes | VWR International, LLC | 82050-276 |
Primary Mouse Embryonic Fibroblasts | EMD Millipore | PMEF-NL |
DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts | Applied StemCell | ASF-1001 |
Mitomycin C | Fisher BioReagents | BP25312 |
Geneticin (G418) | Life Technologies | 11811-023 |
Doxycycline | Fisher BioReagents | BP26531 |
Cryotubes | Thermo Scientific | 377267 |
Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 |
TC10 cell counter | Bio-Rad | |
Counting Slides (for TC10) | Bio-Rad | 1450011 |
Electroporation | ||
Gene Pulser Xcell | Bio-Rad | 1652611 |
Gene Pulser Cuvettes (4 mm gap) | Bio-Rad | 1652088 |
Molecular Biology | ||
Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercylcer ep Gradient S |
Puregene Core kit B | Qiagen | 158745 |
Topo-TA Cloning kit | Life Technologies | 450030 |
High Capacity cDNA synthesis kit | Applied Biosystems | 4368814 |
NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 |
100% ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2716 |
Double Processed Tissue Culture Water | Sigma-Aldrich | W3500 |
Sau3A1 | New England BioLabs | R0169L |
T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202T |
EcoRV | New England BioLabs | R3195S |
96-well Lysis Buffer (Ramires-Solis et al. 1992) | ||
Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
Hydrochloric Acid | Fisher BioReagents | A144-212 |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 |
N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L5777 |
Proteinase-K | Fisher BioReagents | BP1700 |
Electrophoresis | ||
Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad | 170-4469EDU |
LE Agarose | GeneMate | E3120500 |
Ethidium Bromide | Fisher BioReagents | BP1302 |
100 BP DNA Ladder | New England BioLabs | N3231S |
1Kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S |
2-log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200L |