Summary

İleri Genetik Yaklaşım Farelerde Stres Direnci Genler ortaya çıkarmak için - ES Hücrelerde bir Yüksek verim Ekranı

Published: November 11, 2015
doi:

Summary

Stres direnci uzun ömürlü özelliklerinden biridir ve genetik yönetilmeye bilinmektedir. Burada, uzun ömürlü çalışmaları için fare modelleri geliştirmek için hangi ES hücreleri stres direnci kazandıran mutasyonlar taranması için tarafsız bir yüksek verimli bir yöntem geliştirdi.

Abstract

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely limits its potential. We describe here the use of mouse embryonic stem (ES) cells as surrogate cells to screen for a phenotype of interest and subsequently introduce these cells into a host embryo to develop into a living mouse carrying the phenotype. This method provides (1) a cost effective, high-throughput platform for genetic screen in mammalian cells; (2) a rapid way to identify the mutated genes and verify causality; and (3) a short-cut to develop mouse mutants directly from these selected ES cells for whole animal studies. We demonstrated the use of paraquat (PQ) to select resistant mutants and identify mutations that confer oxidative stress resistance. Other stressors or cytotoxic compounds may also be used to screen for resistant mutants to uncover novel genetic determinants of a variety of cellular stress resistance.

Introduction

Ömür stres direnci ile samimi bir ilişki vardır. Genel olarak, uzun ömürlü türler genellikle hidrojen peroksit paraquatın (PQ), UV, ısı ve ağır metaller 1,2 gibi birden stres, doğru direncin artmasına işlemini göstermektedir. Bunun aksine, strese karşı artan hassasiyet, kısalmış ömür ve / veya daha fazla hastalık eğilimli fenotipi tahmin etmek eğilimindedir. Anti-oksidanın, tutucu yolu uzun hayvana gerilme direnci veren önemli bir rol oynadığı tahmin edilmektedir. Bununla birlikte, birkaç istisna dışında, çeşitli anti-oksidan enzimler (örneğin, akciğer), manipülasyonlara sahip transgenik hayvanların çeşitli çalışmalar, oksitleyici kirleticilerin alınmasına yönelik enzim düzeyi artan yaşam süresi ya da sağlık aralığı 3 arttırmadığını gösterir. Bu veriler sürekli olarak uzun ömürlü hayvanlarda gözlenen stres direnç özelliği henüz ortaya için diğer hücresel yolların aracılık ettiğini göstermektedir.

Biz tarafsız bir ileriye aldıGenetik mutasyona uğramış bir yaklaşım üzerine, kültürlü embriyonik kök (ES) hücrelerde stres direnci fenotipi olabilir genleri tanımlamak için. ES hücreleri Bu çalışmada iki ana avantaj sağlar: (1) sofistike genetik manipülasyonlar ES hücrelerinin genomunun modifiye edilmesi için kullanılabilir; ve (2) ekranında elde herhangi bir strese karşı ES hücreleri ile doğrudan ömrü, sağlık yayılma ölçmek için bütün hayvan çalışmalarında içine hızlı şekilde çevrilmesine izin veren fare üretimi için de kullanılabilir.

Bu yazıda Blm alleller bir tetrasiklin duyarlı eleman tarafından kontrol altına bulundukları C9 ES hücre hattı kullanımını tarif. Doksisiklin (Ortodoks) tedavisi geçici kardeş kromatid değişimi artan olaya lider BLM ifadesini kapalı. Bu kısa vadeli Blm knock-out heterozigot nüfus içerisindeki homozigot mutasyon üretimi için izin stres direnci için çekinik mutasyonlar tarama sürecinde yakalanan olabilir ki. BizAyrıca rastgele genom genlerin mutasyona bir poli-A tuzak kaseti (PB-UPA) eklemek için mutajen olarak piggyBac (PB) transpozonun kullanımını tarif. Poli-A tuzağı ile bir gen bozulması olan hücreler, G418 dirençli hale ve gen-trap mutantlar (gen trap kütüphanesi) oluşan bir koleksiyon yapılmış ve daha sonra, karşı stres olan mutant klonları için tarandı olabilir, böylece elde edilebilir.

Seçim kurtarıldı Stres dirençli klonlar eklemeleri sayısı (qPCR) arasında bağlamda moleküler tekniklerle oldukça hızlı karakterize edilebilir, ekleme site (splinkerette PCR), bozulmuş gen (ŞOK) kimliği ve onun ifade seviyesi ( RT-qPCR). PB yerleştirme Yabani tür bir DNA dizisini ve bu nedenle geri stres direnci kaybını test klonu MPB transpozazın geçici ifade yolu ile remobilized edilebilir. Bunlar önce yapılmalıdır mutasyon nedenselliğini onaylamak için güçlü yollar vardırpahalı bir fare üretimi. Önceki çalışmalar stres maruz kalan hücreler pluripotency 4,5 kaybettiklerini gösterdi. Böylece, bu protokolde, stres ile tedavi olmaz mutant hücreler kümesi bir yineleme, korunması başarılı fare üretimi için kritik öneme sahiptir.

Bizim laboratuvar hem istek üzerine diğer araştırmacılar için kullanılabilir, C9 ES hücre hattı ve PB-UPA vektörü tasarladı. Burada rapor edilen protokol, stres dayanıklı klonların (Şekil 1B) izole etmek için replika plaka ve stres seçimi, ardından PB-UPA (Şekil 1A) gen tuzak ES hücreleri, de novo arşivinin oluşturulması yoluyla başlar. Biz paraquat, hücreler içinde güçlü bir serbest kök üretici madde ile noktası göstermiştir. Hemen hemen, örneğin herhangi bir sitotoksik bileşik veya toksin, ER stres (örneğin, thapsigargin ve tunikamisin), nöronal oksitleyici (örneğin, MPP +, 6-hidroksi dopamin ve rotenon), ısı ve ağırmetaller (örneğin, Cd, Se), ilgili dirençli mutantların seçmek için bir yöntem adapte edilebilir.

Protocol

PiggyBac transpozonunun kullanma 1. Gen-tuzak ES Hücre Kütüphane İnşaatı ES hücre kültürü için besleyici olarak birincil fare embriyonik fibroblast (PMEF) hazırlayın 37 ° C su banyosu içinde mitomisin C ile inaktive PMEF (5.0 x 10 6) bir şişe çözülme. DMEM,% 15 FBS ihtiva eden ES hücre ortamı, 5 ml (1000 ünite / lösemi önleyici faktörler mi, 100 uM esansiyel olmayan amino asitler, 2 mM glutamin, 55 uM 2-merkaptoetanol, ve 25 birim / ml penisilin / strepto…

Representative Results

Tipik bir mutajenez deneyde, transfeksiyon PB-UPA ve MPB transpozaz ile 3 x 10 7 ES hücrelerinin toplam oluşur. Iki bağımsız deneyin üretilen gen tuzak ES hücre sayısı, Tablo 1 'de özetlenmiştir. Gen tuzak etkinliği, yaklaşık 0.04%' dir. Kombine gen tuzak kütüphaneleri 22400 bağımsız mutantlar, fare genomu hakkında tam bir kapsama (23.000 kodlayan genlerin) içerirler. Aşırı kapsama tekrarlanan mutasyon yoluyla daha mutantlar üreten ve / veya süreci ölçeklem…

Discussion

Forward genetic analysis allows for an unbiased interrogation of the genome for genes responsible for a specific phenotype. This method is very powerful to uncover novel gene functions. It has been widely used in lower organisms but not in mammal, such as the mouse, mainly due to the extremely high cost associated with the infrastructure and logistics that would entail. Here, we moved the genetic screening process to the ES cell culture platform, greatly increasing the efficiency and throughput in generating mutants a…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank the Wellcome Trust Sanger Institute for the gifts of piggyBac transposon and piggyBac transposase. This work was supported by the Butcher grant of Colorado and the NIH R01 AG041801 (W.S.C).

Materials

Vector
PB-UPA
mPBase
mPBasePuro
Tissue Culture 
500-ml Stericup filters EMD Millipore SCGPU05RE
250-ml Stericup filters EMD Millipore SCGPU02RE
50-ml Steriflip-GV filters EMD Millipore SE1M179M6
KO DMEM Life Technologies 10829-018
DMEM Sigma-Aldrich D6429
FBS Tissue Culture Biologicals 104
Heat Inactivated FBS Sigma-Aldrich F4135-500
LIF EMD Millipore ESG1107
Non-essential Amino Acids Life Technologies 11140-050
GlutaMAX Life Technologies 35050-061
Pen/Strep Life Technologies 15140148
β-Mercaptoethanol Life Technologies 21985-023
Methyl Viologen dichloride (Paraquat) Sigma-Aldrich 856177
Dimethyl Sulphoxide Hybri-MAX Sigma-Aldrich D2650
EmbryoMAX 0.1% gelatin EMD Millipore ES006B
DPBS/Modified HyClone SH30028.02
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200-056
T25 Flask Corning 353108
T75 flask Corning 353135
100-mm  plate Corning 353003
150-mm  plate Corning 430599
96-well  plate Corning 3585
96-well U-bottom plate Corning 3799
24-well plate Corning 3526
50-ml reservoir  Corning 4870
15-ml tubes VWR International, LLC 82050-276
Primary Mouse Embryonic Fibroblasts EMD Millipore PMEF-NL
DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts Applied StemCell ASF-1001
Mitomycin C Fisher BioReagents  BP25312
Geneticin (G418) Life Technologies 11811-023
Doxycycline Fisher BioReagents  BP26531
Cryotubes Thermo Scientific 377267
Centrifuge  Eppendorf Centrifuge 5702
TC10 cell counter Bio-Rad
Counting Slides (for TC10) Bio-Rad 1450011
Electroporation 
Gene Pulser Xcell Bio-Rad 1652611
Gene Pulser Cuvettes (4 mm gap) Bio-Rad 1652088
Molecular Biology 
Thermal Cycler Eppendorf Mastercylcer ep Gradient  S
Puregene Core kit B Qiagen 158745
Topo-TA Cloning kit Life Technologies  450030
High Capacity cDNA synthesis kit Applied Biosystems 4368814
NaCl Fisher BioReagents  BP358-212
100% ethanol Decon Laboratories, Inc. 2716
Double Processed Tissue Culture Water Sigma-Aldrich W3500
Sau3A1 New England BioLabs R0169L
T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202T
EcoRV New England BioLabs R3195S
96-well Lysis Buffer (Ramires-Solis et al. 1992)
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503
Hydrochloric Acid Fisher BioReagents  A144-212
EDTA Sigma-Aldrich E5134
N-Lauroylsarcosine sodium salt Sigma-Aldrich L5777
Proteinase-K Fisher BioReagents  BP1700
Electrophoresis
Mini-Sub Cell GT Bio-Rad 170-4469EDU
LE Agarose  GeneMate E3120500
Ethidium Bromide  Fisher BioReagents  BP1302
100 BP DNA Ladder New England BioLabs N3231S
1Kb DNA Ladder New England BioLabs N3232S
2-log DNA Ladder New England BioLabs N3200L

References

  1. Johnson, T. E., et al. Longevity genes in the nematode Caenorhabditis elegans also mediate increased resistance to stress and prevent disease. J Inherit Metab Dis. 25, 197-206 (2002).
  2. Murakami, S., Salmon, A., Miller, R. A. Multiplex stress resistance in cells from long-lived dwarf mice. Faseb J. 17, 1565-1566 (2003).
  3. Perez, V. I., et al. The overexpression of major antioxidant enzymes does not extend the lifespan of mice. Aging Cell. 8, 73-75 (2009).
  4. Martin, G. M. Genetic engineering of mice to test the oxidative damage theory of aging. Ann NY Acad Sci. 1055, 26-34 (2005).
  5. Chick, W. S., Drechsel, D. A., Hammond, W., Patel, M., Johnson, T. E. Transmission of mutant phenotypes from ES cells to adult mice. Mamm Genome. 20, 734-740 (2009).
  6. Ramirez-Solis, R., et al. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Anal Biochem. 201, 331-335 (1992).
  7. Uren, A. G., et al. A high-throughput splinkerette-PCR method for the isolation and sequencing of retroviral insertion sites. Nat Protoc. 4, 789-798 (2009).
  8. Wang, W., Bradley, A., Huang, Y. A piggyBac transposon-based genome-wide library of insertionally mutated Blm-deficient murine ES cells. Genome Res. 19, 667-673 (2009).
  9. Chick, W. S., et al. Screening for stress-resistance mutations in the mouse. Front Genet. 5, 310 (2014).
  10. Salmon, A. B., et al. Fibroblast cell lines from young adult mice of long-lived mutant strains are resistant to multiple forms of stress. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 23-29 (2005).
  11. Skarnes, W. C., et al. A public gene trap resource for mouse functional genomics. Nat Genet. 36, 543-544 (2015).
  12. Baker, K. E., Parker, R. Nonsense-mediated mRNA decay: terminating erroneous gene expression. Curr Opin Cell Biol. 16, 293-299 (2004).
  13. Shigeoka, T., Kawaichi, M., Ishida, Y. Suppression of nonsense-mediated mRNA decay permits unbiased gene trapping in mouse embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 33, e20 (2004).
  14. Symula, D. J., Zhu, Y., Schimenti, J. C., Rubin, E. M. Functional annotation of mouse mutations in embryonic stem cells by use of expression profiling. Mamm Genome. 15, 1-13 (2004).

Play Video

Cite This Article
Ludwig, M., Kitzenberg, D., Chick, W. S. Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice — A High-throughput Screen in ES Cells. J. Vis. Exp. (105), e53062, doi:10.3791/53062 (2015).

View Video