Summary
هي الدافع دراسات التنمية الحنك قبل حدوث الشق الحلقي وهو عيب خلقي الذي يفرض عبئا صحية هائلة، ويمكن أن يترك تشوهات دائمة. علينا أن نظهر هنا تقنية لرفوف الثقافة حنكي التي يمكن استخدامها لدراسة مسارات الإشارات المختلفة المشاركة في التنمية حنكي والانصهار.
Abstract
الشفة المشقوقة والحنك هي من بين الأكثر شيوعا من جميع العيوب الخلقية. أشكال الحنك الثانوية من الرفوف الوسيطة مغطاة ظهارة أن تلتزم تشكل خط التماس خط الوسط الظهارية (MES). النظريات تشير إلى أن الخلايا MES اتباع الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT)، موت الخلايا المبرمج والهجرة، مما يجعل الحنك تنصهر 1. تفكك كامل للMES هو المرحلة الأساسية النهائية للحنكي التقاء مع توضيح خلايا اللحمة المتوسطة. ونحن نقدم طريقة لثقافة الجهاز الحنك. الدول المتقدمة في بروتوكول المختبر يسمح للدراسة العمليات البيولوجية والجزيئية خلال الانصهار. تطبيقات هذه التقنية متعددة، بما في ذلك تقييم الردود على العوامل الكيميائية خارجي، وآثار العوامل التنظيمية والنمو وبروتينات معينة. الثقافة الجهاز الحنك لديها عدد من المزايا بما في ذلك التلاعب في مراحل مختلفة من التنمية لم يكن ذلك ممكنا باستخدام الدراسات المجراة.
Introduction
انشقاقات فموي وجهي هي الاكثر السائدة العيوب الخلقية القحفي. أيضا، مع الأخذ في الاعتبار جميع العيوب القحفي ممكنة، وهذه هي ثاني الشذوذ الولادة الأكثر شيوعا في الأطفال حديثي الولادة 2. تحدث الأذواق المشقوقة في حوالي 1 في كل 700 ولادة في الولايات المتحدة (US) من كل عام، وقوع الحنك يساوي 475 الأطفال الذين ولدوا مع الأذواق المشقوقة شهريا أو 15 طفلا شقوقا في يوم 3. ما يقرب من 1٪ من الأطفال الذين ولدوا في جميع أنحاء العالم كل عام المعرض شكلا من أشكال dysmorphology القحفي.
شقوق في سقف الحلق والشفة تحتاج إلى إجراء مكلفة جدا ومعقدة مع تداعيات مدى الحياة للمرضى الذين لديهم هذا الشذوذ. التكلفة التقديرية لكل مريض مع شق طريق الفم هو حوالي 100،000 $ 4. علاج للمريض مع الشفة المشقوقة والحنك يتطلب فريقا من الأطباء الجراحين بما في ذلك القحفي، otolaryngologists، والهندسة الوراثية، التخدير،النطق واللغة الأطباء وخبراء التغذية، تقويم الأسنان، prosthodontists وعلماء النفس والأعصاب، وأطباء العيون.
في palatogenesis، ينشأ الحنك الثانوي الامتداد المقترنة، التي تنمو في البداية عموديا والخضوع لحنكي الرف الارتفاع فوق ظهر اللسان. بعد الارتفاع، ورفوف حنكي يقترن تنمو نحو خط الوسط (في E14.5 -E15 في الفئران والأسبوع 9 في البشر). ظهارة حافة وسطي (MEE) الذي يغطي طرف الجرف تلتزم تشكيل التماس خط الوسط الظهارية.
ويعقب ذلك الظهارية للانتقال الوسيطة و / أو موت الخلايا المبرمج للسماح الوسيطة التقاء. التصاق معارضة MEE هو الحدث الأساسي الذي يسبب الحنك التغيير. ومع ذلك، حققت فقط عدد قليل من الدراسات التصاق الأولي من الرفوف حنكي 5. أشكال الحنك الصلبة التي تمايز خلايا اللحمة المتوسطة في بناء العظم. تطوير شاذة من الحنك يمكن أن تنتج المفتاحر الأذواق مع أو دون تدخل من الشفة.
وقد استخدمت تقنيات زراعة الأعضاء الحنك على نطاق واسع لكثير من المختبرات على مدى السنوات ال 30 الماضية 6،7.
في هذا البروتوكول وصفنا في تفاصيل طريقة لتشريح حنكي والثقافة الجهاز ثابتة. الاستفادة من ثقافة بلا حراك الجهاز هو أنه يتيح الرفوف الحنك لتلتحم. وقد استخدمت هذه التقنية بنجاح في المختبر لدينا لكثير من الانصهار ويشير التجارب 8،9. إلا أن نطاق هذه التقنية واسع ويمكن استخدامها كلما مطلوب نظام الثقافة الجهاز ثابتة، بما في ذلك تقييم الاستجابات لعوامل كيميائية خارجي، وآثار عوامل النمو التنظيمية في مسارات مختلفة، وبروتينات معينة.
الشكل 1. ماوس Palatogenesis. مراحل تطور الحنك الفئران. (BF) الضوئي ايلىالميكروسكوب ctron (SEM) من الحنك الثانوي في فترات النمو التمثيلية. السهام الحمراء: وتظهر بالجزء الأول من التصاق حنكي والانصهار. الأسهم الصفراء: أشر إلى الفضاء بين أذواق الابتدائية والثانوية التي سوف تختفي بعد الانصهار (نقلا عن كوفمان 11 بإذن من بلوس وان).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يجب تنفيذ جميع الإجراءات المذكورة وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح لاستخدام الحيوانات الفقارية، بما في ذلك الحصول على موافقة مسبقة من لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام المحلية.
1. إعداد أدوات تشريح والثقافة وسائل الإعلام
- Prewash جميع الأدوات اللازمة لاستخدامها في تشريح مع 3٪ بيروكسيد الهيدروجين ثم الأوتوكلاف على 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تصفية وسائل الإعلام BGJb بمحلول مضاد حيوي ومضاد فطري باستخدام 0.22 ميكرون مسام الحجم مرشح مع شفط فراغ في غطاء محرك السيارة.
2. إعداد المعدات الثقافة
- قطع المرشحات الغشائية البولي من شأنها أن تدعم أجهزة حنكي في مثلثات صغيرة، رذاذ مع الكحول 70٪ والسماح لهم لتجف. إعداد مركز حسنا ثقافة الجهاز صحن (60x15 ملم) عن طريق وضع متساوي الأضلاع الثلاثي على شكل شبكة الأسلاك النظيفة والمعقمة (20 ملم) على لوحة الثقافة الجهاز. ثم ملء البئر مع 1 مل من BGJB سائل الإعلام والثقافة وسائل الإعلام. ملاحظة: يجب أن تكون وسائل الإعلام كافية للوصول إلى مستوى من الشبكة بدون غمر الأذواق. وضع المرشحات الغشائية، الجانب اللامع أسفل، على رأس الشبكة (3-4 الأغشية في الشبكة). اعتمادا على التجربة والعلاج (البروتينات، والأجسام المضادة أو مثبطات) يمكن أن تضاف إلى وسائل الإعلام
3. ماوس الأجنة جمع وإعداد للثقافة
- للحصول على نوع البرية أجنة الفئران، توقيت استخدام 13.5 حاملا CD-1 الماوس سلالة الخلفية الوراثية. تنظيف المنطقة تشريح مع الايثانول 70٪.
ملاحظة: سلالات أخرى من الفئران يمكن استخدامها. نحن نفضل CD-1 الفئران بسبب العدد القمامة أكبر. - الموت ببطء الفئران الحوامل في E13.5 شركة ظفار (آخر أيام الجماع) مع 5٪ الأيزوفلورين تليها خلع عنق الرحم للتأكد من وفاة باستخدام بروتوكولات المعتمدة.
- رذاذ الايثانول 70٪ على سطح البطن بطني لتجنب وجود عصا الشعر في البطن في الصكوك. ثم فتح تجويف البطن من الناحية البطنيةباستخدام مقص حاد صريحا التشغيل وملقط تشريح الصغرى لتحديد الرحم. باستخدام ملقط، ورفع الرحم كامل وفصلها عن الجسم عن طريق قطع في جسم الرحم وعلى نصائح من قرون الرحم مع مقص التشغيل الخفيفة.
- وضع الرحم على منشفة ورقية نظيفة على الجليد (وفقا لدليل بروتوكول للرعاية واستخدام حيوانات المختبر). تغطية الرحم مع منشفة ورقية نظيفة أخرى لمنع التلوث. تعقيم الأدوات باستخدام 70٪ رذاذ الايثانول قبل استخدامها مرة أخرى. يمكن نقلها الرحم والأجنة إلى المختبر على الجليد.
- في فتح غطاء تدفق الصفحي، وجعل بعناية فتحة صغيرة في الكيس المحي باستخدام مقص حاد التشغيل كليلة وملقط تشريح الصغرى. جعل زيادة الانفتاح وثم دفع برفق إلى الداخل للظاهر الجنين من الكيس المحي.
- نقل الأجنة فورا إلى طبق بيتري مع الباردة الفوسفات مخزنة المالحة 1X (PBS) ودرجة الحموضة 7.4. لضمان السليم المرحلة السابقةأمين الجنين تحت المجهر تشريح للجسم، وحجم الرأس والأطراف التشكل.
لا يتم استخدام الأجنة التي ليست في مرحلة الصحيحة التنمية للتجربة: ملاحظة.
الشكل 2. برعم الطرف الصرف. ويتم فحص الصدارة وأطرافه الخلفية للحصول على درجة حزام المسافة البادئة بين الأرقام. في E13.5، كل تكثفات أرقام بارزة، مع حزام والمسافات البادئة البعيدة بين الأرقام تظهر اضح للغاية. الأرقام هند هي وراءها لمدة نصف يوم 12 الصف العلوي: forelimb، الصف السفلي: أطرافه الخلفية.
4. الحنك تشريح
- وضع الجنين في وقت واحد في طبق بتري مع برنامج تلفزيوني تحت المجهر تشريح. باستخدام مقص تشريح الصغيرة وملاقط تفصل الرأس عن الجسم من الأجنة.
- عقد بعناية الجمجمة الماوس فوق مستوى العين مع ملقط (تجنبعملية الفك العلوي) جعل اثنين من الشقوق على جانبي خط الشفاه. ثم إزالة الفك السفلي واللسان. عزل المنطقة عملية الفكين عن طريق إجراء خفض في مستوى العين وإزالة الدماغ والعينين والأنف والأنسجة الحاجز المجاور.
الرقم الأنسجة 3. الحنك التي تم جمعها من 13.5 الأجنة، عندما الرفوف الحنك قد رفعت لكن لم تصدر للإتصال به. وضعت على الرفوف حنكي في الثقافة الجهاز على فلتر في واجهة وسائل الإعلام الهواء لمدة 72 ساعة في نموذج ثابت. (A) مستوى تشريح E13.5 على الجنين. (B) بلو ستارز وتفصل بين المناطق لعقد الأنسجة مع ملقط أثناء تشريح. (C) عرض الرفوف حنكي تشريح وضعت على غشاء فلتر شبه منحرف. (D) عرض جانب من الطبق الثقافة بعد تنسيب من أذواق تشريح وبالإضافة إلى ذلك من وسائل الإعلام الثقافة.
- وضع الجانب الشفوي حنكي صعودا وإزالة الحاجز الأنفي والأنسجة المحيطة بها، والحفاظ على الحنك الأساسي المرفق لمساعدتها على توجيه من الأمامي إلى الخلفي. استخدام ملعقة ملعقة ونقل بعناية فائقة الرفوف الحنكية (الجانب الأنف إلى أسفل) للمرشحات مستعدة على الشبكات في أطباق الثقافة. ملاحظة: ضبط حجم وسائل الاعلام للسماح اجهة الوسائط الجوية المناسبة.
- تحت المجهر ستيريو، تشريح الحنك الابتدائي واستخدام ملاقط لوضع الرفوف حنكي قريبة من بعضها البعض. سوف الرفوف حنكي لا تلتحم إذا لم يتم وضعها في الاتصال. قطع غشاء الثلاثي حيث يقع الجزء الأمامي من الحنك. وشكل شبه منحرف تساعد في إضفاء الطابع المحلي على الجزء الأمامي من الحنك.
- ثقافة الرفوف حنكي بشكل فردي أو مع اثنين أو ثلاثة في نفس الطبق الثقافة الجهاز باستخدام BGJb سائل الإعلام والثقافة.
5. رفوف التثقيف ماوس الحنكي
- احتضان TISSUوفاق عند 37 درجة مئوية في خليط الغاز مرطب (5٪ CO 2 و 95٪ الهواء) لمدة 72 ساعة، وتغيير المتوسط كل 24 ساعة.
6. الحنك المعالجة للتحليل النسيجي
- إصلاح الأذواق بعد 72 ساعة في الثقافة مع 4٪ الفورمالديهايد / الفوسفات مخزنة المالحة O / N عند 4 درجات C. ثم بلطف مع ماصة نقل غسل الأنسجة في الطبق الثقافة مع برنامج تلفزيوني. التفاف الأذواق في قطعة من مناديل مختبر ومكان في تضمين أشرطة.
ملاحظة: التفاف الأذواق في مناديل مختبر منع خسارتهم خلال عملية الجفاف. - يذوى الأنسجة التالية 70٪، 80٪ وحتى 100٪ يغسل الإيثانول لمدة 1 ساعة، يليه إجراء البارافين العادي التضمين. لدمج، ضع الجزء الأمامي من سقف الحلق التي تواجه الدرج.
- قطع المسلسل 6 ميكرون المقاطع في اتجاه الاكليلية من الأمامي إلى الخلفي. وهناك قسم كامل الحنك تسفر 350-450 sectiإضافات. وصمة عار على المقاطع مع الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E). 10 نقاط كل قسم 20 تشرين باستخدام سبق وصفها متوسط فيوجن نتيجة (MFS) على نطاق و(الجدول 1). 8
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويمكن تطبيق هذه التقنية لأنواع مختلفة من experiments.The الدراسة التالية تم تصميمها لاختبار تأثير ماسخ من النيكوتين في المختبر على حنكي الانصهار. واستخدمت سلالتين من الفئران لهذه التجربة، وعولج CD1 والأنسجة C57.Palatal مع 0.06 و 6 ملي تركيزات من hemisulfate النيكوتين. ولوحظ أن أنماط الاندماج الحنك وتوقيت كانت مختلفة في اثنين من سلالات مختلفة. في الفئران CD1، واصلت الرفوف الحنك من السيطرة على المجموعة الانصهار في الوقت بطريقة تعتمد. ومع ذلك، في التعامل مع مجموعة النيكوتين الانصهار تأخر خصوصا في تركيز النيكوتين 6MM (الشكل 4A). وأظهرت المقاطع الأنسجة من CD1 الأذواق الماوس مجموع الانصهار بعد 72 ساعة في عينات السيطرة. في جرعات أقل من النيكوتين تلتزم الرفوف الحنك لكن تبقى الخلايا الظهارية بعد 3 أيام في الثقافة. لم رفوف الحنك المحتضنة في جرعات عالية من النيكوتين لا تجعل الاتصال بعد 72 ساعة من الحضانة.
= "jove_content"> في الفئران C57، واصلت الرفوف حنكي من السيطرة على المجموعة الانصهار في الوقت بطريقة تعتمد. ومع ذلك، أظهرت رفوف حنكي من الفئران C57 ارتفاع درجة تركيز في 6 ملي عندما حضنت العينات لمدة 48 ساعة في مقارنة مع العينات حضنت في تركيز 0.6 ملم من النيكوتين لنفس الفترة من الزمن (الشكل 4B). وأظهرت المقاطع الأنسجة من C57 الأذواق الفئران التي في مجموعات العلاج التماس الظهارية المستمر استمر في خط الوسط. ولوحظ الانصهار فقط في المجموعة الضابطة في 72 ساعة.
لاحظنا تأثر أن الاندماج حنكي في كلا النوعين من الفئران بجرعات عالية من النيكوتين. ومع ذلك، كانت الأذواق من C57 أكثر عقلانية للنيكوتين. في الختام، تظهر نتائجنا أن الخلفية الوراثية للفئران يؤثر النيكوتين الردود في أنسجة الحنك.
| أحرز هدفاً | المعايير |
| 1 | غير الانصهار مع عدم وجود التصاق. |
| 2 | غير الانصهار مع بعض التصاق واضح. |
| 3 | التصاق مع بعض تفكك طبقات MEE واضح الوسيطة التقاء جزئي. |
| 4 | الانصهار الكامل مع بعض آثار من خلايا MEE أو التماس المتبقية. |
| 5 | الانصهار الكامل مع أي دليل على خلايا MEE أو التماس مرئية. |
الجدول 1: متوسط فيوجن نتيجة (MFS) على نطاق و(كانغ وسفوبودا، 2002). حساب النقاط لكل الحنك لالأمامي (أقسام 1-150) والمتوسطة (المقاطع 150-300) والخلفي (المقاطع 300-450). 8
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكول في هذه المقالة يوفر طريقة لتشريح الرفوف حنكي من الأجنة في اليوم الجنينية 13.5. وكانت الرفوف الحنك من أجنة الفئران مثقف في وسائل الإعلام ثقافة خالية من مصل في جو من 95٪ O 2 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. نجاح حنكي تشريح اعتمادا كبيرا على عوامل متعددة في كل خطوة أثناء إجراء من الوقت الجنينية من الفئران الموت الرحيم لإتمام الثقافة. واحدة من أهم العوامل التي تؤثر حنكي الانصهار هو الوقت الذي يستغرقه لبدء الثقافة الجهاز. الأجنة يجب أن تكون في يوم الجنينية 13.5 كما الرفوف الحنك الثانوية أفقية، ولكن لم تبدأ لدمج (الشكل 1).
نقطة هامة أخرى أثناء إجراء هو ظاهرية الأجنة من الكيس المحي. هذه الخطوة تتطلب عناية كبيرة لمنع الأضرار التي لحقت هياكل الوجه. وبمجرد إزالة الجنين من الكيس، تتم إزالة الرأس منالجسم وتوضع في طبق بتري ليتم عرضه مع stereomicroscope مع الإضاءة الألياف البصرية من كلا الجانبين. تتم إزالة الفك السفلي واللسان، وفضح الحنك. تتم إزالة أنسجة المخ والمتبقية على مستوى العين. في هذه المرحلة من المهم النظر في طبقة الظهارية حول الرفوف. فمن الضروري لمعالجة الأنسجة بعناية فائقة للحفاظ على سلامة هذه الخلايا. الخلايا الظهارية هي المسؤولة عن التزام وتشكيل MES.
يتم تشغيل كل الحنك تشريح الجانب الشفوي وصولا لتنظيف الغضروف من الحاجز الأنفي. هذا النسيج على الجانب الأمامي من الحنك ويظهر الموجز بياضا وأكثر. يتم نقل الرفوف الحنك خالية من الأنسجة غير المرغوب فيها إلى صحن ثقافة ووضعها على رأس الغشاء التصفية. يتم فحص موقف الرفوف مرة أخرى تحت المجهر تشريح ستيريو. يجب أن تكون دفعت معا للسماح الالتزام وزيادة على حنكي الانصهار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BGJb | Invitrogen | ||
| Penicillin/Streptomycin | Lonza Inc. | 17-602E | 100X |
| Petri dishes | VWR | 25384-088 | 100 x15 mm |
| Center-well organ culture dish | Falcon | #353037 | 60 x15 mm |
| Wire triangular grid | Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well. | ||
| Polycarbonate filter | GE& Water and Process Technologies | K04BP04700 | Black 0.4 micron, 47 mm |
| Stereo microscope | ZEISS Stemi SR | ||
| Culture hood | NUAIRE Laminar Flow | ||
| Microdissecting forceps | Dumont Medical | #5 | |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS14003-G | Vannas Scissors, straight, 8 cm long, 0.1mm tips, 5 mm blades, German made |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS500086 | Vannas Scissors, straight, 8.5 cm long, 0.025 mm x 0.015 mm tips, 7 mm blades |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS14127-G | Spring scissors curved curved, 10.5 cm long, 8 mm blades, German made |
| Surgical currete (spoon spatula) | Hu-friedy | CM 2/4 | |
| Protector laboratory hood | Labconco | ||
| Incubator | Thermo Scientific | Farma | |
| Series11 water Jacket | |||
| CO2 incubator | |||
| PBS | GIBCO | 10010-023 | 1X |
| Fiber optic Light source | Fiber-light Dolan-Jenner | PL-750 | |
| Embedding cassette | Statlab | EC301 | |
| Kim Wipes | VWR | 470173-504 |
References
- Nawshad, A. Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).
- Strong, E. B., Buckmiller, L. M. Management of the cleft palate. Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).
- Witt, P. D., Marsh, J. L. Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate. Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).
- 4miloro, principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).
- Mima, J. Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation. PloS one. 8, e61653 (2013).
- Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy. Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).
- Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos. The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).
- San Miguel, S. Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).
- Kang, P., Svoboda, K. K. PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).
- RD, L. Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. , 3rd edn, McGraw Hill Book Co. New York. (1965).
- Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. , Elsevier. (1992).
- Taher, L. Global gene expression analysis of murine limb development. PloS one. 6, e28358 (2011).
