Summary
Studies van gehemelte ontwikkeling worden gemotiveerd door de incidentie van gespleten gehemelte, een aangeboren afwijking die een enorme gezondheid last oplegt en kunnen verlaten blijvende verminking. We tonen hier een techniek om cultuur palatini die kunnen worden gebruikt om verschillende signaalwegen betrokken bij palatinale ontwikkeling en fusie bestuderen.
Abstract
Schisis behoren tot de meest voorkomende van alle aangeboren afwijkingen. De secundaire gehemelte vormen van mesenchymale planken bedekt met epitheel die voldoet aan de middellijn epitheliale naad (MES). De theorieën suggereren dat MES cellen volgen een epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT), apoptose en migratie, het maken van een gesmolten smaak 1. Volledige desintegratie van de MES is de laatste essentiële fase van palatal samenloop met omliggende mesenchymale cellen. Wij bieden een methode voor het gehemelte orgelcultuur. De ontwikkelde in vitro protocol maakt het onderzoek mogelijk van het biologische en moleculaire processen tijdens fusion. De toepassingen van deze techniek zijn talrijk, inclusief het evalueren respons op exogene chemische agentia, van regulerende en groeifactoren en eiwitten. Palatal orgelcultuur heeft een aantal voordelen, waaronder manipulatie in verschillende stadia van ontwikkeling die niet mogelijk is met in vivo studies.
Introduction
Orofacial kloven zijn de meest overheersende craniofaciale aangeboren afwijkingen. Ook rekening houdend met alle mogelijke craniofaciale afwijkingen, dit zijn de tweede meest voorkomende geboorte afwijkingen bij pasgeborenen 2. Gespleten gehemelte optreden bij ongeveer 1 op elke 700 geboorten in de Verenigde Staten (VS) per jaar, de incidentie van gespleten gehemelte is gelijk aan 475 kinderen geboren met een gespleten gehemelte per maand of 15 kinderen met spleten per dag 3. Ongeveer 1% van de kinderen geboren in de wereld elk jaar vertonen een bepaalde vorm van craniofaciale dysmorfologie.
Spleten van het gehemelte en de lip hebben een zeer dure en ingewikkelde procedure levenslange gevolgen voor patiënten die deze anomalie. De geschatte kosten voor elke patiënt met orale gespleten is ongeveer $ 100.000 4. De behandeling van een patiënt met schisis vereist een team van artsen, waaronder craniofaciale chirurgen, otolaryngologists, genetici, anesthesisten,spraak-taal pathologen, voedingsdeskundigen, orthodontisten, prosthodontists, psychologen, neurochirurgen en oogartsen.
In palatogenesis de secundaire gehemelte rijst gepaarde uitwassen, die aanvankelijk verticaal groeien ondergaan palatale elevatie boven het dorsum van de tong. Na verhoging, de gepaarde palatal schappen groeien naar de middellijn (op E14.5 -E15 bij muizen en week 9 bij de mens). De mediale rand epitheel (MEE), die de plank tip dekt houdt zich het vormen van de middellijn epitheliale naad.
Dit wordt gevolgd door epitheliale naar mesenchymale overgang en / of apoptose laten mesenchymale confluentie. Hechting van tegengestelde MEE is een belangrijk evenement waarvan wijziging veroorzaakt gespleten gehemelte. Echter, slechts weinig studies onderzochten de initiële hechting van palatal planken 5. Het harde gehemelte vormen door differentiatie van mesenchymale cellen in osteoblasten. De abnormale ontwikkeling van het gehemelte kunnen sleutel producerent smaakpapillen met of zonder betrokkenheid van de lip.
Gehemelte orgelcultuur technieken werden op grote schaal gebruikt voor vele laboratoria in de afgelopen 30 jaar 6,7.
In dit protocol beschrijven we in detail een werkwijze palatale dissectie en statische orgaankweek. Het voordeel van een bewegingloze orgaankweek is dat het mogelijk palatini fuseren. Deze techniek werd met succes gebruikt in ons laboratorium voor vele fusie-experimenten en signalering 8,9. Het toepassingsgebied van de techniek is enorm en kan worden gebruikt als statische orgaankweek systeem nodig en een evaluatie van respons op exogene chemische stoffen, de gevolgen van regulerende groeifactoren in verschillende trajecten en specifieke eiwitten.
Figuur 1. Mouse Palatogenesis. Ontwikkelingsstadia van de muizen gehemelte. (BF) Scanning elecTRON microfoto (SEM) van de secundaire gehemelte bij representatief ontwikkelingsstoornissen tijden. Rode pijlen: tonen de oorspronkelijke deel van palatale hechting en fusion. Gele pijlen wijzen op de ruimte tussen de primaire en secundaire fijnproevers die zal verdwijnen na fusie (herdrukt van Kaufman 11 met toestemming van PLoS ONE).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures beschreven moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften voor het gebruik van gewervelde dieren, met inbegrip van de voorafgaande goedkeuring door de lokale Institutional Animal Care en gebruik Comite.
1. Voorbereiding van ontleden Instruments en Cultuur Media
- VOORWAS alle instrumenten voor gebruik in dissectie met 3% waterstofperoxide en daarna autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 min. Filter BGJb media met antibiotica en antimycotische oplossing om met een 0,22 pm porie-sized filter met afzuiging in een kap.
2. Voorbereiding van Cultuur Equipment
- Snijd membraanfilters van polycarbonaat dat de palatal organen zal ondersteunen in kleine driehoekjes, spray met 70% alcohol en laat ze drogen. Bereid Center-Well Organ Culture Dish (60x15 mm) door het plaatsen van een schone en gesteriliseerd gelijkzijdige driehoek-vormige draadrooster (20 mm) over de orgelcultuur plaat. Vul dan het goed met 1 ml van BGJB mediacultuur media. OPMERKING: De media moet voldoende zijn om het niveau van het rooster te bereiken zonder de smaakpapillen te dompelen. Plaats de filters membraan, glanzende zijde omlaag, boven op het rooster (3-4 membranen per raster) .Depending het experiment, kan de behandeling (eiwitten, antilichamen of remmers) worden toegevoegd aan de media
3. Mouse embryoteams en Voorbereiding voor Cultuur
- Met wild-type muis embryo's te verkrijgen, gebruik getimede 13,5 zwanger CD-1 muis genetische achtergrond stam. Reinig de dissectie met 70% ethanol.
OPMERKING: Andere muizenstammen kunnen worden gebruikt. Wij geven de voorkeur CD-1 muizen, vanwege de grotere nest nummer. - Euthanaseren zwangere muizen op E13.5 DPC (dagen na de coïtus) met 5% Isofluraan gevolgd door cervicale dislocatie aan de dood te verzekeren met behulp van goedgekeurde protocollen.
- Spray 70% ethanol aan de ventrale buikoppervlak te voorkomen dat de Buikhaar vasthouden aan de instrumenten. Open vervolgens de buikholte ventraalmet een scherp-botte operating schaar en micro ontleden tang om de baarmoeder te lokaliseren. Met behulp van de tang, til de gehele baarmoeder en scheiden van het lichaam door te snijden in de baarmoeder lichaam en de uiteinden van de baarmoederhoorns een lichte werkende schaar.
- Plaats de baarmoeder op een schone papieren handdoek over ijs (Volgens het protocol gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren). Bedek de baarmoeder met een andere schone papieren handdoek om besmetting te voorkomen. Steriliseren van de instrumenten met behulp van 70% ethanol spuiten voordat verder te gebruiken. De baarmoeder en de embryo kan worden getransporteerd naar het laboratorium op ijs.
- In een open laminaire stroming kap, voorzichtig een kleine opening in de dooierzak met scherpe stompe operating schaar en micro ontleden tang. Maak de opening breder en vervolgens voorzichtig duw hem naar het embryo uit de dooierzak exterioriseren.
- Breng de embryo's onmiddellijk naar een petrischaal met koude fosfaatgebufferde zoutoplossing 1X (PBS) pH 7,4. Om de juiste podium, ex verzekerenamine het embryo onder een stereomicroscoop voor het lichaam, hoofdomvang en leden morfologie.
OPMERKING: Embryo's die niet in het juiste stadium van ontwikkeling worden niet gebruikt voor het experiment.
Figuur 2. Limb Bud morfologie. De voor- en achterpoten worden gecontroleerd op de mate van singels inkeping tussen de cijfers. Bij E13.5, alle cijfers verdichtingen zijn prominent aanwezig, met de singels en distale inkepingen tussen de cijfers te zien zijn zeer verschillend. De achterpoten cijfers achter door een halve dag 12 Bovenste rij:. Voorpoot, onderste rij: achterste ledematen.
4. Palate Dissection
- Plaats één embryo per keer in een petrischaal met PBS onder de stereomicroscoop. Met behulp van kleine ontleden schaar en pincet scheiden het hoofd van het lichaam van het embryo.
- Zorgvuldig met de muis schedel boven ooghoogte met een pincet (vermijdende bovenkaak proces) maken twee incisies aan beide zijden van de lip lijn. Verwijder vervolgens de onderkaak en tong. Isoleer de bovenkaak proces regio door het maken van een snede op ooghoogte en verwijder de hersenen, de ogen, neustussenschot en omliggende weefsels.
Figuur 3. Palate weefsel van 13,5 embryo's, wanneer het gehemelte schappen had verheven verzameld, maar contact niet gemaakt. De palatal planken werden op een filter in de lucht media-interface voor 72 uur in de statische model in orgelcultuur geplaatst. (A) Niveau van dissectie op E13.5 embryo. (B) Blauw sterren bakenen gebieden om het weefsel met een tang tijdens dissectie te houden. (C) Weergave van ontleed palatal planken geplaatst op een trapeziumvormige filter membraan. (D) Zijaanzicht van de cultuur schotel na plaatsing van de ontleed smaakpapillen en toevoeging van de cultuur media.
- Plaats de palatinale orale kant op en verwijder het neustussenschot en het weefsel eromheen, het houden van de primaire gehemelte bevestigd te oriënteren helpen van anterior naar posterior. Gebruik een lepel spatel en heel voorzichtig overdracht van de palatal planken (neus naar beneden) naar de voorbereide filters op de roosters in de cultuur gerechten. LET OP: Stel het volume van de media om een goede lucht-media-interface mogelijk te maken.
- Onder de stereo microscoop, ontleden de primaire gehemelte en gebruiken pincet om de palatal schappen dicht bij elkaar te plaatsen. De palatal planken zal niet smelten als ze niet in contact worden gebracht. Snijd de driehoekige membraanfilter waarbij het voorste gedeelte van de tong ligt. De trapezium vorm zal helpen bij het lokaliseren van het voorste deel van het gehemelte.
- Cultuur palatini alleen of met twee of drie in hetzelfde orgaan kweekschaal gebruikt BGJb kweekmedia.
5. Het kweken Muis Palatal Planken
- Incubeer de tissus bij 37 ° C in een bevochtigde gasmengsel (5% CO2 en 95% lucht) gedurende 72 uur, en verandert het medium elke 24 uur.
6. Palate Verwerking voor histologische analyse
- Bevestig de smaakpapillen na 72 uur in kweek met 4% formaldehyde / fosfaat gebufferde zoutoplossing O / N bij 4 ° C. vervolgens voorzichtig met een transferpipet wast het weefsel in de kweekschaal met PBS. Wikkel de fijnproevers in een stuk van laboratorium doekjes en plaats in het inbedden van cassettes.
LET OP: Het verpakken van de fijnproevers in het laboratorium doekjes voorkomen hun verlies tijdens het droogproces. - Dehydrateer het weefsel na 70%, 80% en tot 100% ethanol wasbeurten gedurende 1 uur, gevolgd door de normale paraffine inbedding procedure. Voor het inbedden plaatst het voorste deel van het gehemelte tegenover de lade.
- Snijd Serial 6 micrometer secties in het coronale oriëntatie van anterior naar posterior. Een complete sectie gehemelte zal 350-450 secti opleverenons. Vlekken op de secties met hematoxyline en eosine (H & E). 10 Score elke 20 ste sectie in de eerder beschreven Mean Fusion Score (MFS) schaal (Tabel 1). 8
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De techniek kan worden toegepast op verschillende soorten experiments.The volgende studie werd ontworpen om de teratogene effecten van nicotine in vitro op palatale fusie te testen. Twee stammen van muizen werden gebruikt voor dit experiment, CD1 en C57.Palatal weefsel werd behandeld met 0,06 en 6 mM concentraties van nicotine hemisulfaat. Waargenomen werd dat palatinale fusie patronen en timing waren in de twee verschillende stammen. In CD1 muizen palatal planken uit de controlegroep bleef fusie in tijdsafhankelijke manier. In de behandelde groep nicotine vertraagd fusion bijzonder bij 6 mM nicotine concentratie (Figuur 4A). Histologie secties van CD1 muis fijnproevers toonde totale fusie na 72 uur in de controle monsters. Bij lagere doses van nicotine de palatal planken houden maar de epitheelcellen blijft na 3 dagen in de cultuur. Palatini gekweekt bij hoge doses nicotine niet contact op te nemen na 72 uur incubatie.
(Figuur 4B). Histologie gedeelten van C57 muizen smaak bleek dat de behandelingsgroepen een doorlopende naad epitheliale bleef in de middellijn. Fusie werd alleen waargenomen in de controlegroep bij 72 uur.
Waargenomen dat palatale fusie in beide soorten muizen werd beïnvloed door hoge doses nicotine. Echter, smaakpapillen van C57 waren verstandiger aan nicotine. Samenvattend tonen onze resultaten aan dat genetische achtergrond van muizen beïnvloedt nicotine reacties bij palatinale weefsels.
| Partituur | Criteria |
| 1 | Non-fusie met geen hechting. |
| 2 | Non-fusion met enkele duidelijke hechting. |
| 3 | Adhesie met enkele desintegratie van MEE lagen en duidelijke gedeeltelijke mesenchymale samenvloeiing. |
| 4 | Volledige fusie met enkele sporen van MEE cellen of naad overgebleven. |
| 5 | Volledige fusie met geen bewijs van MEE cellen of naad zichtbaar. |
Tabel 1: Gemiddelde Fusion Score (MFS) schaal (Kang en Svoboda, 2002). Bereken de scores voor elke smaak voor de voorste (secties 1-150), midden (paragrafen 150-300) en de achterste (paragrafen 300-450). 8
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol in dit artikel een werkwijze voor het ontleden palatal planken uit embryo's op embryonale dag 13,5. Palatini van muizenembryo's werden gekweekt in een serumvrij kweekmedium in een atmosfeer van 95% O 2 5% CO2 bij 37 ° C. Succesvol palatinale dissectie kritisch afhankelijk van meerdere factoren bij elke stap tijdens de procedure van de embryonale moment van de muizen gedood om de voltooiing van de kweek. Een van de belangrijkste factoren palatinale fusie is de tijd voor de orgelcultuur starten; embryo's moeten worden op embryonale dag 13,5 als secundair gehemelte planken horizontaal, maar zijn niet begonnen (figuur 1) smelten.
Een ander kritisch punt tijdens de procedure is de uittreding van embryo's uit de dooierzak. Deze stap vereist grote zorg om schade aan de gezichtsstructuren voorkomen. Zodra het embryo uit de zak, wordt de kop uithet lichaam en geplaatst in een petrischaal te worden bekeken met een stereomicroscoop met glasvezel verlichting van beide kanten. De onderkaak en de tong worden verwijderd, waardoor het gehemelte. De hersenen en het resterende weefsel verwijderd op ooghoogte. Op dit punt is het belangrijk om de epitheellaag rond de schappen te overwegen. Het is noodzakelijk om het weefsel te manipuleren zorgvuldig de integriteit van deze cellen houden. Epitheliale cellen zijn verantwoordelijk voor de naleving en de vorming van de MES.
Elke ontleed gehemelte is ingeschakeld mondeling naar beneden om eventuele kraakbeen van het neustussenschot reinigen. Dit weefsel is op de voorste zijde van het gehemelte en lijkt witter en meer gecondenseerde. Palatini vrij van ongewenste weefsel worden verplaatst naar een kweekschaal en bovenop het filtermembraan. De positie van de planken wordt opnieuw gecontroleerd onder de stereo stereomicroscoop. Zij moeten samen worden geduwd om therapietrouw en verder palatal fusie mogelijk te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BGJb | Invitrogen | ||
| Penicillin/Streptomycin | Lonza Inc. | 17-602E | 100X |
| Petri dishes | VWR | 25384-088 | 100 x15 mm |
| Center-well organ culture dish | Falcon | #353037 | 60 x15 mm |
| Wire triangular grid | Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well. | ||
| Polycarbonate filter | GE& Water and Process Technologies | K04BP04700 | Black 0.4 micron, 47 mm |
| Stereo microscope | ZEISS Stemi SR | ||
| Culture hood | NUAIRE Laminar Flow | ||
| Microdissecting forceps | Dumont Medical | #5 | |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS14003-G | Vannas Scissors, straight, 8 cm long, 0.1mm tips, 5 mm blades, German made |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS500086 | Vannas Scissors, straight, 8.5 cm long, 0.025 mm x 0.015 mm tips, 7 mm blades |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS14127-G | Spring scissors curved curved, 10.5 cm long, 8 mm blades, German made |
| Surgical currete (spoon spatula) | Hu-friedy | CM 2/4 | |
| Protector laboratory hood | Labconco | ||
| Incubator | Thermo Scientific | Farma | |
| Series11 water Jacket | |||
| CO2 incubator | |||
| PBS | GIBCO | 10010-023 | 1X |
| Fiber optic Light source | Fiber-light Dolan-Jenner | PL-750 | |
| Embedding cassette | Statlab | EC301 | |
| Kim Wipes | VWR | 470173-504 |
References
- Nawshad, A. Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).
- Strong, E. B., Buckmiller, L. M. Management of the cleft palate. Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).
- Witt, P. D., Marsh, J. L. Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate. Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).
- 4miloro, principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).
- Mima, J. Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation. PloS one. 8, e61653 (2013).
- Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy. Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).
- Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos. The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).
- San Miguel, S. Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).
- Kang, P., Svoboda, K. K. PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).
- RD, L. Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. , 3rd edn, McGraw Hill Book Co. New York. (1965).
- Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. , Elsevier. (1992).
- Taher, L. Global gene expression analysis of murine limb development. PloS one. 6, e28358 (2011).
