Introduction
הרחקה קיבעון או ראש בראש היא טכניקה של לשתק את ראשו של בעל החיים על ידי הצמדת מסגרת או צלחת על הגולגולת להידוק נוקשה. הטכניקה כבר אימצתי לגירוי חושי מדויק, חישת התנהגות עם או בלי הקלטה עצבית בבעלי חיים ער 1-3 ותיוג juxtacellular במהלך מחזור 4 שינה ו. כמו כן הוא משמש לin vivo ההדמיה של מוח 5,6. עכשיו טכניקת קיבוע הראש הוא כלי נפוץ במדעי מוח והתנהגות מחקר.
בעיקרון, קיבעון הראש מסורתי דורש קובץ מצורף כירורגית של ראש-הודעות מתכת על גבי 6-8 הגולגולת. אז הקבצים המצורפים מהודקים לפלטפורמה נייחת, וכתוצאה מכך חוסר תנועה של הראש. מחקר בבעלי חיים neurophysiological ער כגון עצבי ו / או הקלטה אופטית, התערבות חשמלית במוח, הדמיה מוחית מלווה בניתוח השתלה באמצעות אקריליק שיניים. לכן,נראה משימה פשוטה ליישם את קיבעון הראש במעבדות אלה כאשר הוא בניסוי נחוץ. צריכים להיות מתוכננות המסגרות להיות קל משקל וקטן מספיק כדי לא להפריע התנהגות הטבעית של בעלי החיים בכלובים בביתם. הוא גם מספק קשיחות מכאנית כאשר הידק לפלטפורמה הנייחת. עוד יש לו התאמה ביולוגית בהתאם למטרות ניסויים. לכן, זה קשה מבחינה טכנית כדי לעצב ולייצר ראש-הודעות כאלו בציוד מעבדה כללי.
במחקר זה, שיטת קיבוע ראש רומן מתוארת, מתן קשיחות מכאנית באמצעות הידוק נוח מבלי להשתמש בראש-הודעות מתכת. על ידי שימוש בשיטה, קיבעון הראש יכול להיעשות בתנאי מעבדה כלליים, שבו ניתוח השתלה מבוצע בדרך כלל במכרסמים למחקר מוח. הראש-הודעות המתכת מוחלפות במלט שרף אקרילי היצוק באופן חלקי על ידי בר קיבעון ראש מחוייט ודפוס התהליך נעשה במהלך implanניתוח tation. בר הקיבעון מספק תאימות מרחבית גבוהה עם שתלים אחרים, כגון בדיקות הקלטה עצביות, אלקטרודות גירוי. כמו כן הוא מפשט את הפעולות של הידוק הראש של החיה על פלטפורמת הקיבעון על ידי הסרת בורג חיזוק. אנחנו השתמשנו בשיטה זו במחקר ההתנהגות הקודם והגעתי למסקנה שהשיטה זו היא קלה ליישום ונוח בניסויים מעשיים 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרת אתיקה:
ניסוי זה אושר על ידי הוועדה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטה הלאומית Kyungpook, ובוצע על פי מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה (המכון הלאומי לבריאות, 1996). לאחר ניסוי, בעלי החיים הוקרבו תחת המתת חסד פחמן דו חמצני.
1. עיצוב של בר-ראש הקיבעון לחולדות
הערה: שלב זה הוא קו מנחה כללי לעיצוב בר קיבעון. כל שינוי על הממד והחומר אפשרי בהתאם לחיות או שתלים. עיצוב בר ראש-קיבעון באמצעות תוכנות CAD מומלצת אך לא הכרחי.
- השתמש בתוכנת CAD לעצב בר קיבעון.
- עיצוב בר קיבעון של צורה מלבנית (123 מ"מ × 35 × 6) (איור 1 א). הפוך חריץ מלבני (16 × 20 מ"מ; נמל) באמצע הבר הקיבעון. להוסיף מדרונות או חריצים which לשמש כמעקה מדריך על הגבולות של הנמל (איור 1 א-, איור 1 -arrows).
הערה: ודא שאזור הנמל מכסה את המלבן המשוער של הגולגולת של החולדה על המוח כדי לאפשר כניסות אנכיות באמצעות מניפולטור stereotaxic לרוב האזורים במוח באמצעות פתיחת גולגולת. - צרף צלחות (50 × 20 × 6 מ"מ) עם שני חורי עיגון מוארכים משני צידי הבר הקיבעון. ודא שהחורים האלה עוברים ברגים בקוטר 6 מ"מ (1A-ד איור). לעשות חור בקוטר של 3 מ"מ בחלק קדמי של היציאה לוו נעילה (איור 1 א-ב).
- להפוך את תיבה שיש רצפה (135 × 305 מ"מ) וקירות צדדיים (305 × 76 מ"מ). לקדוח שני חורים בקוטר 6 מ"מ, כפי שמוצג באיור 1 א (הבלעה). להוסיף קירות תומכים בסרגל הקיבוע (איור 1 א-ה).
- עיצוב בר קיבעון של צורה מלבנית (123 מ"מ × 35 × 6) (איור 1 א). הפוך חריץ מלבני (16 × 20 מ"מ; נמל) באמצע הבר הקיבעון. להוסיף מדרונות או חריצים which לשמש כמעקה מדריך על הגבולות של הנמל (איור 1 א-, איור 1 -arrows).
- ייצור בר המעוצב ותיבה ולהרכיב כל אחד מהם באמצעות cyanoacrylate כשמוצג באיור 1 א (הבלעה). להרכיב את הבר בתיבה באמצעות ברגים בקוטר 6 מ"מ. החל מדרון על ידי התאמת עמדת הבורג על הבר לקיבעון ארגונומי ראש (1A-הבלעה איור).
הערה: לעכברים, הממד של בר הקיבעון הוא 60 מ"מ × 20 × 4 (מורכב משתי שכבות של 2 מ"מ פנלי אקריליק סמיך). הנמל הוא ריבוע של 8 מ"מ רוחב (עליון) ו -9 x 10 מ"מ (נמוך) כפי שמוצג באיור 1 ג. צלחות עיגון הן באותו הגודל של חולדות. קירות צלחת התיבה וצד הם 100 מ"מ × 72 × 100 ושל 50 מ"מ, בהתאמה.
2. ראש Mounter בנייה במהלך ניתוח השתלה
זהירות: היה זהיר בעת התמודדות עם שרף אקרילי שיניים. הנוזל עלול לגרום לגירוי בעור. לשים על מסכה וללבוש כפפות. עובד באזור מאוורר היטב.
- הכנה לפני הניתוח
- חוזקה לעטוף את הגבול של נמל AP באמצעות סרגל קיבעוןסרט araffin כדי למנוע הידבקות של שרף אקרילי פנה לבר (ראה איור 1 ואיור 2 א). מעיל הדייר של הנמל המכוסה על ידי סרט פרפין עם שכבה דקה של שרף אקרילי.
- השתמש במכשירי ניתוח עיקור. ביסודיות לחטא מסגרת stereotaxic והסביבה באמצעות 70% אתיל אלכוהול.
- לבצע ניתוח השתלת stereotaxic
- להרדים בעלי חיים על ידי זריקת intraperitoneal של תערובת קוקטייל (2 מיליליטר / קילוגרם) של קטמין 10 מיליליטר (50 מ"ג / מיליליטר), hydrochloride xylazine 1.5 מיליליטר (23.32 מ"ג / מיליליטר), ומלח 2.5 מיליליטר. ודא שהחיה בהרדמה מלאה ואינה מגיבה לצובט זנב ובוהן. להזריק תערובת קוקטייל של 1 מיליליטר / קילוגרם במהלך ניתוח בעת צורך.
- תקן את בעלי החיים למנגנון stereotaxic. החל משחה עיניים על עיניים כדי למנוע יובש במהלך ניתוח. להתגלח ולנקות את הקרקפת עם 70% אתנול. תן הזרקה תת עורית של 2% לידוקאין ולחתוך SCALP לאורך קו האמצע של הגולגולת. לגמרי לגרד periosteum. יש לשטוף מספר פעמים עם מי מלח.
- הפוך קידוח בר-חור ליד השפה של הגולגולת. ברגי שתל 4-5 סיבובים (עד 1 מ"מ עומק) ממשטח הגולגולת כדי למנוע הפרת מאטר הדורה. ודא שאין דליפה של CSF ודם על פני השטח הגולגולת לאחר השתלת בורג. לשטוף עם מי מלח ולייבש את פני השטח הגולגולת באמצעות אוויר-עלים, בעיקר סביב הברגים.
- פני גולגולת מעיל עם שכבה דקה של "דבק שיניים (Super-בונד C & B)". לחלוטין לא מכסה את פני השטח של הגולגולת כולל גבחת אם השתלת אלקטרודה נוספת מתוכננת. השתמש בגבחת לסימון קואורדינטות פתיחת גולגולת. אלקטרודות ו / או דיסק קשיח זעיר שתל ולתקן את זה על ידי החלת גולגולת שרף אקרילי סביבו.
- החל שרף אקרילי נוסף על גבי מלט השיניים. השתמש בכמות מתאימה של שרף אקרילי לעזוב חלל מילוי החוצה מספיק בין שרף מצופה ברשרף הרכבה ראשוני ד כאשר להתקבע הברגים ו / או אלקטרודות (איור 2 א).
- הנח בר הראש-קיבעון 5 מ"מ או יותר מעל פני השטח הגולגולת וליישר מרכזה (איור 2 א מרט).
- החל שרף אקרילי לפער בין בסיס הגולגולת ושרפי הרכבה ראשוני. (איור 2 א מרכז). חכה עד שהשרף הפך קשה.
- הסר אוזן-בר ולמשוך את mounter היצוק מהנמל בר קיבעון. (איור 2 א ה"זכות). זהירות להחיל שרף אקרילי נוסף סביב מסילות קצה mounter היצוק במידת צורך.
- יש לשטוף את משטח הפצע בקרקפת עם תמיסת מלח סטרילית. להזריק אנטיביוטיקה (Enrofloxacin, 5 מ"ג / קילוגרם sc) ו( tartrate butorphanol, 2 מ"ג / קילוגרם sc) משכך כאבים מייד לאחר ניתוח. בית החיה בנפרד בכלוב אחד.
3. בעלי חיים הרגלה לראש קיבעון
הערה: דה צעד זהסופרי לוחות זמנים התרגלות מבוססים על ההערכות המוצלחות באופן אמפירי של המחברים. לסקירה כללית של הליך התרגלות לראש-קיבעון, לראות את העבודה של של 10 שוורץ או גואו 11.
- תן תקופת התאוששות מספקת (שבוע או יותר) לבעלי חיים. ביום 1, ידית בעלי חיים לעתים קרובות במפגשים קצרים חלוקים.
- ביום שלמחרת (יום 2), לחשוף את בעלי החיים לסביבת הקיבעון (תיבה). אל תכניסו את ראשם mounter ליציאה של בר הקיבעון. השאר בעלי חיים כדי להתרגל לסביבה. מאובטח לתפוס mounter הראש בעזרת יד ל1 עד 2 שניות ולשחרר אותו באופן מיידי. חזור על קיבעון טווח קצר על ידי מספר פעמים ביד לתפוס.
- ביום 3, להרגיל בעלי חיים לראש-קיבעון.
- להביא חיות מכלובי הבית וליישב אותם בתיבת בימוי ראשים לכיוון נמל בר הקיבעון. תפוס את mounter הראש ולהכניס אותו ליציאה של בר הקיבעון.
- תחייב את mounter (חיה שלראש) לוו הנעילה של בר הקיבעון באמצעות גומייה. לעמוד במשך 5 דקות.
הערה: אל תיגעי בתא המטען או הזנב של החיה לאחר קיבוע, אשר מובילה את בעלי החיים לחריקה ולהיאבק הגדלת הלחץ של בעלי החיים. כאשר בעלי החיים ממשיכים נאבקים דקות יותר מ 1, לשחרר אותו ולנסות מאוחר יותר. מהצעד הזה, בעלי חיים מראים הפרשת שתן וצואה בכל פעם שנחשפה לראש קיבעון אבל זה בהדרגה מקבל מופחת כתמורת התרגלות. - אחזר את הגומייה הנעילה ולהוציא את mounter מחוץ לנמל. שים את החיות בחזרה לכלוב בבית ולספק פיסת דגנים או זרעי חמניות לכלוב בבית כפרס. המשפט הבא מתחיל ב 30 דקות. חזור 3.4.1 ל3.4.4 חמש או יותר תוך יום.
- ביום 4 עד 7, לחשוף את בעלי החיים לראש קיבעון, כמתואר בפרוטוקול 3.4. בהדרגה להגדיל את משך הזמן של קיבעון הראש (10 דקות, 20 דקות, 30 דקות, 50 דקות וכתמורת הרגלה).
הערה: אם בעלי חיים לא יעשולא להאכיל את גמול מזון, זה יכול להיות סימן לרמה גבוהה של לחץ. לא להגדיל את זמן הקיבוע. אם בעלי החיים מראים חזר נאבקים התנהגות, להרגיל אותם לתקופה ארוכה יותר. - לבדוק את משקל גופו של בעל חיים יומיומי. שקול התרגלות לא מוצלחת כאשר משקל גוף הולך ופוחת. המשך למשימות התנהגותיות עם קיבעון ראש אחרי התרגלות מוצלחת.
הערה: התרגלות מוצלחת מאפשרת אימון שלאחר מכן התנהגות (איור 3E וF).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיטת קיבוע ראש זה חל על שני חולדות ועכברים. שמונה חולדות סה"כ קיבלו השתלה דו-צדדית של גירוי אלקטרודות לתוך צרור המוח הקדמי המדיאלי. לארבעה מתוכם, אלקטרודות חוט טונגסטן מותאמות אישית (microdrives) הושתלו גם לאזור forelimb M1 (איור 2 ג). לעכברים (n = 2), ארבע אלקטרודות חוט נירוסטה הושתלו לתוך אזורים חזיתיים / עורפי בקליפת המוח. במהלך ניתוח, mounters הראש היו מעוצב לקיבוע הראש בשני חולדות ועכברים, כפי שמתארים בסעיף פרוטוקול 2. לאחר התאוששות מניתוח, הם נחשפו למפגשים יומיים של קיבעון ראש לאו התרגלות או משימה התנהגותיות. Mounters הראש היצוק נשאר עד סוף הניסוי (40.5 ± 1.73 (ממוצע ± ימי SD) לחולדות ו -81 ± 5.66 (ממוצע ± ימי SD) לעכברים לאחר ניתוח). חולדות נחשפו מדי יום 40 עד 60 דקות קיבעון הראש במהלך משימת התנהגות; עכברים נחשפו מדי יום 20 עד 40 דקות של להיותמשימת havior.
בעבר השתמשנו בטכניקה זו כדי לאמן חולדות לדחוף ולמשוך את ידית בקיבעון הראש. הפרס היה גירוי חשמלי ישיר של חבילת המוח הקדמי המדיאלי. למרות שזה מעורר של תנועה מוגזמת התנהגות, קיבעון הראש נשמר היטב ללא הפרדת mounter מקרית.
אחרי ההתרגלות, עגינת mounter הראש ליציאה מקיבעון בר הושלם בכמה שני על ידי נעילת גומייה לקרס. כאשר הוצג לראשונה לקיבוע הראש, בעלי חיים נאבקים מציג התנהגויות כגון ריצה במקום, ליישר את רגליהם (איור 3 א 'וב'). עם זאת, התנהגויות כאלה פחתו עם התרגלות. התרגלות מוצלחת יכולה להיות אישרה כי בעלי חיים לא מראים התנהגות נאבקת יותר ואילו ראש קבוע (איור 3 ג ו-ד ').
עיצוב איור 1. של בר-ראש הקיבעון.
(א) שמות רכיב של בר קיבעון הראש. ) יציאה; ב) נעילת וו; גוף בר קיבעון ג); ד) עיגון חורים; ה) תמיכה בקיר; ו) צלחת עיגון. עיצוב של תיבת הקיבעון מתואר בהבלעה. שני חורים של הקיר הצדדי משמשים למיצוב בר הקיבעון ארגונומית. תצוגה (B) פרספקטיבה של בר קיבעון ראש מיועד לחולדות. חיצים שחורים מציינים את גבול כיסוי סרטי פרפין. (ג) העיצוב של הנמל לקיבוע ראש בעכברים. (השתנה מאיור 1 של רו et al. 9) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. בנייה של דפוס mounter במהלך ניתוח.
מגיב () אל מרתיע קריצה mounter הראש. ברגים (משמאל) (צורות T בשחור) צריכים להיות מושתלים בניצב למשטח הגולגולת (האפור). שכבה דקה של בטון שיניים שרף דביק (ירוקה) מכסה ברגים ומשטח הגולגולת. (מרכז) לאחר השתלה בהתאם למטרות ניסוי, שרפים נוספים אקריליק (כתומה) מלאים בפער בין שרף הראשוני המצופה על רפי הנמל ובסיס של משטח הגולגולת והופך לחלק מmounter הראש. (מימין) לאחר שרפי אקריליק הוסיפו הם קבוצה קשה, mounter הראש יכול להיות שפורסם על ידי הזזה מהנמל. קווים שחורים מוצקים מצביעים סרטי פרפין. (השתנה מאיור 1 של רו et al. 9) (ב) נבנה mounter הראש בחולדות מוכן לשחרור (לאחר הצעד של-מרכז). (CD) ציפוי שרף אקרילי המשמש כmounter ראש. לאחר ניתוח, עדיין תחת הרדמה, בעלי החיים שוחררו מבר הקיבעון. חיצים שחורים מצביעים על מסילות מדריך התאמה לצורה של הנמל. נ.ב.: //www.jove.com/files/ftp_upload/53064/53064fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. ראש-קבוע חולדה ועכבר.
(AB) כאשר בעלי חיים בתחילה נחשפים לראש קיבעון, הם פולטים נאבקים התנהגות. (CD) כתמורת הרגלה, בעלי חיים מראים התנהגות פחות נאבקת ובדרך כלל לשבת על הרצפה של הפלטפורמה הנייחת. תוצאה (EF) של הופעות משימה התנהגותיות ממוצלחת (E) והתרגלות לא מוצלחת (F) של סביבת קיבעון הראש (השתנו מאיור 3 של רו et al. 9). מספר זכתה מחבק שתי משיכה מנוף חופשית (לעיצוב מטרות) ומותנית. בשני המפגשים, מספיק חולדה מורגלת מציגה ביצועים גרועים עם מתוגמל רק על ידי מנוף מקרי מושך מהתנהגות בלתי מותנית.= יעד "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53064/53064fig3large.jpg" = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dental acrylic resin | Lang Dental Manufacturing | Ortho-Jet | to make molded mounter |
| Paraffin film | Bemis | Parafilm | to prevent adhesion of acrylic resin to the bar |
| Dental adhesive | Sun Medical | Super-Bond C&B | to bond between acrylic resin and skull |
| Plexglass or other acrylic plate | to make fixation bar and box platform | ||
| Cyanoacrylate | to bond acrylic plates |
References
- Mayrhofer, J. M., et al. Novel two-alternative forced choice paradigm for bilateral vibrotactile whisker frequency discrimination in head-fixed mice and rats. J Neurophysiol. 109, 273-284 (2013).
- Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice. J Neurosci Methods. 178, 75-79 (2009).
- Ollerenshaw, D. R., et al. Detection of tactile inputs in the rat vibrissa pathway. J Neurophysiol. 108, 479-490 (2012).
- Lee, M. G., Manns, I. D., Alonso, A., Jones, B. E. Sleep-wake related discharge properties of basal forebrain neurons recorded with micropipettes in head-fixed rats. J Neurophysiol. 92, 1182-1198 (2004).
- Lutcke, H., et al. Optical recording of neuronal activity with a genetically-encoded calcium indicator in anesthetized and freely moving mice. Front Neural Circuits. 4, 9 (2010).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56, 43-57 (2007).
- Kimura, R., et al. Reinforcing operandum: rapid and reliable learning of skilled forelimb movements by head-fixed rodents. Journal of neurophysiology. 108, 1781-1792 (2012).
- Hadlock, T., Kowaleski, J., Mackinnon, S., Heaton, J. T. A novel method of head fixation for the study of rodent facial function. Experimental neurology. 205, 279-282 (2007).
- Roh, M., Jang, I. S., Lee, M. G. Push-in Head Restraining Apparatus for Intracranial Self Stimulation Tasks in Rats. Korean J Physiol Pharmacol. 18, 103-108 (2014).
- Schwarz, C., et al. The head-fixed behaving rat--procedures and pitfalls. Somatosensory & motor research. 27, 131-148 (2010).
- Guo, Z. V., et al. Procedures for Behavioral Experiments in Head-Fixed Mice. PLoS ONE. 9, (2014).
- Osborne, J. E., Dudman, J. T. RIVETS: a mechanical system for in vivo and in vitro electrophysiology and imaging. PLoS One. 9, e89007 (2014).
