Introduction
頭部固定や頭の拘束は、剛性クランプ用の頭蓋骨上のフレームまたはプレートを取り付けることによって、動物の頭を固定化する技術です。技術は1-3目を覚まし動物および睡眠-覚醒サイクル 4の間juxtacellular標識のための神経記録の有無にかかわらず、正確な感覚刺激のための行動センシングを採用しています。また、 インビボでの脳イメージング5,6のために使用されます。今頭部固定技術は、神経科学と行動研究で一般的に使用されるツールです。
基本的には、従来の頭部固定は頭蓋骨6-8の上にメタルヘッド・ポストの外科用アタッチメントが必要です。添付ファイルは、その後、ヘッドの固定化の結果、静止プラットフォームにクランプされます。このような神経および/または光記録、脳回路の介入として覚醒した動物における神経生理学的研究は、脳イメージングは、歯科用アクリルを使用して移植手術を伴っています。そのため、それは、実験が必要であるときに、これらの実験室で頭部固定を実現するための簡単な作業です。フレームは軽量かつホームケージ内の動物の自然な行動を邪魔しない程度に小さくなるように設計する必要があります。静止プラットフォームにクランプする際にも機械的剛性を提供します。さらに、実験の目的に応じて、生体適合性を有しています。したがって、一般的な実験装置にかかる頭柱を設計し、製作することは技術的に困難です。
本研究では、新規な頭部固定方法は、金属ヘッドのポストを使用することなく、便利なクランプを介して機械的剛性を提供し、記載されています。この方法を用いることにより、ヘッドの固定は、移植手術は、通常、脳の研究のためにげっ歯類で行われる一般的な実験室の条件下で行うことができます。メタルヘッド・ポストはimplan中に行われたカスタムメイドの頭部固定バーと成形プロセスによって部分的に成形されたアクリル樹脂セメントに置き換えられますテーション手術。固定バーは、ニューラル記録プローブ、刺激電極として他のインプラント、との高い空間の互換性を提供します。また、それはネジ止めを除去することにより、固定プラットフォーム上の動物の頭をクランプする工程を簡素化します。私たちは前の行動の研究では、この方法を使用し、我々は、この方法は、実装が容易で実用的な実験9で便利であると結論しました。
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Protocol
倫理の声明：
この実験は、慶北大学校施設内動物管理使用委員会によって承認され、実験動物の管理と使用（国立衛生研究所、1996）のための案内に従って行きました。実験後、動物は、二酸化炭素の安楽死の下で屠殺しました。
ラット用頭部固定バーの1デザイン
注：この手順は、固定バー設計のための一般的なガイドラインです。寸法および材料についての変更は、動物やインプラントに応じて可能です。 CADソフトウェアを使用して、ヘッドの固定バーを設計する必要は推奨されないが。
- 固定バーを設計するためのCADソフトウェアを使用してください。
- 長方形（123×35×6ミリメートル）（ 図1A）の固定バーを設計します。固定バーの中央に、長方形のノッチ（ポート16×20ミリメートル）を行います。斜面やくぼみを追加whicHは、ポートの境界にガイドレール（ 図1A-A、 図1Bは -arrows）として機能します。
注：ポートの面積は開頭を通じて脳領域のほとんどに定位マニピュレータを使用して垂直方向のアクセスを可能にするために、脳の上にラットの頭蓋骨の推定矩形をカバーしていることを確認してください。 - 固定バーの両側に2つの細長いアンカー穴とプレート（50×20×6 mm）を取り付けます。これらの穴は直径6mm（ 図1A-D）のネジを渡したことを確認してください。ロックフック（ 図1A-B）のためのポートの前に直径3mmの穴を作成します。
- 箱が床（135×305ミリメートル）と側壁（305×76ミリメートル）を有することを確認します。 図1A（挿入図）に示すように、2つの直径6mmの穴をドリル。固定バー（ 図1A-E）に支持壁を追加します。
- 長方形（123×35×6ミリメートル）（ 図1A）の固定バーを設計します。固定バーの中央に、長方形のノッチ（ポート16×20ミリメートル）を行います。斜面やくぼみを追加whicHは、ポートの境界にガイドレール（ 図1A-A、 図1Bは -arrows）として機能します。
- 設計バーとボックスを製造し、としてシアノアクリレートを使用して、それらのそれぞれを組み立てます図1A（挿入図）に示します。直径6mmのネジを使用してボックスにバーを組み立てます。人間工学的な頭部固定（ 図1A、挿入図 ）は、バーのネジ位置を調整することによって、勾配を適用します。
注：マウスの場合、固定バーの寸法は、（厚さ2mmのアクリル板の二層からなる）60×20×4mmです。ポートは8 mmの幅（上部）および図1（c）に示すように 9×10 mmの（下側）の正方形です。アンカープレートは、ラットのと同じサイズです。ボックスプレートとサイドの壁はそれぞれ100×72ミリメートルと100×50ミリメートル、です。
移植手術中に2頭マウンター建設
注意：歯科アクリル樹脂を扱うときは注意してください。液体は皮膚の炎症を引き起こす可能性があります。マスクを着用し、手袋を着用してください。換気の良い場所で作業してください。
- 手術前の準備
- しっかりと固定バー使用して、APのポートの境界をラップバーに適用されたアクリル樹脂の付着を防止するaraffin膜（ 図1B及び図2Aを参照）。コートアクリル樹脂の薄層でパラフィンフィルムで覆われたポートの境界。
- 滅菌手術器具を使用してください。完全に定位フレームとその周辺用いて70％のエチルアルコールを消毒します。
- 定位移植手術を行います
- 10 mlのケタミン（50 mg / mlで）、キシラジン塩酸1.5ミリリットル（23.32 mg / mlで）、および生理食塩水2.5ミリリットルのカクテル混合物（2ミリリットル/ kg）を腹腔内注射によって動物を麻酔。動物が完全に麻酔し、尾とつま先ピンチに応答しないことを確認してください。必要な場合に手術中に1ミリリットル/ kgでのカクテル混合物を注入します。
- 定位固定装置に動物を修正。手術中の乾燥を防ぐために、目に眼軟膏を適用します。 70％エタノールで頭皮を剃るし、清掃してください。 2％のリドカインの皮下注射を与え、SCAを切開頭蓋骨の正中線に沿ってのlp。完全に骨膜を削り取ります。生理食塩水で数回すすいでください。
- 頭蓋骨のリム付近にバリ穴加工を行います。硬膜の違反を防止するために、頭蓋骨の表面からインプラントのネジ（1ミリメートルの深さまで）4-5ターン。ネジ移植後頭蓋表面上CSFおよび血液のことを確認漏れを行いません。生理食塩水ですすぎ、空気パフを使用して、頭蓋骨の表面を乾燥、特にネジの周り。
- 「歯科用接着剤（スーパーボンドC＆B）」の薄層でコート頭蓋骨の表面。追加の電極注入が予定されている場合、完全にブレグマ含む頭蓋骨の表面を覆わないでください。開頭術座標をマークするためにブレグマを使用してください。インプラント電極および/またはマイクロドライブとその周りにアクリル樹脂を塗布することにより頭蓋骨に固定します。
- 歯科用セメントの上に付加的なアクリル系樹脂を適用します。バーでコーティングされた樹脂のANとの間に十分なフィルアウトスペースを残すためにアクリル樹脂の適切な量を使用しますねじおよび/ または電極（ 図2A）を固定する際の取り付け樹脂を頭文字D。
- 5mm以上頭蓋骨表面上置きヘッド固定バーと、その中心（ 図2A -left）を合わせます。
- 頭蓋骨と初期の実装系樹脂のベースとの間の隙間にアクリル樹脂を適用します。 （ 図2A -center）。樹脂が硬くなるまで待ちます。
- 耳バーを取り外し、固定バーポートから成形マウンタを引き出します。 （ 図2A右回転）。必要に応じて成形マウンタのエッジレールの周りに追加のアクリル樹脂を慎重に適用されます。
- 滅菌生理食塩水で頭皮の傷の表面を洗浄します。手術直後抗生物質（エンロフロキサシン、5ミリグラム/ kgの皮下）と鎮痛剤（酒石酸ブトルファノール、2ミリグラム/ kgの皮下）注入します。ハウス個別に1ケージ内の動物。
3.頭部固定に動物をHabituating
注：この手順のデ著者の経験的に成功した評価に基づい慣れスケジュールをスクライブ。ヘッド固定用慣れ手順の概要については、シュワルツの10または郭の11作品を参照してください。
- 動物への十分な回復期間（週またはそれ以上）を与えます。 1日目に、頻繁に分割短いセッションで動物を処理します。
- 次の日（2日目）には、固定環境（ボックス）に動物を公開します。固定バーのポートに自分の頭マウンタを挿入しないでください。環境に慣れるために動物のままにしておきます。しっかり1〜2秒間、手を使ってヘッドマウンタを取得し、すぐにそれを解放。ハンドグラブ数回短期固定を繰り返します。
- 3日目、頭部固定に動物を慣らします。
- ホームケージから動物を持参し、固定バーのポートに向かって頭を向けるボックスでそれらを決済します。ヘッドマウンタをつかみ、固定バーのポートに挿入します。
- （動物のマウンタをバインドゴムバンドを使用して、固定バーのロッキングフックの頭）。 5分間放置。
注：きしむ音、動物のストレスを増加苦労した動物をリードする、固定後の動物のトランクまたは尾に触れないでください。動物は1分以上に苦労し続けた場合、それを解放し、後で試してください。頭部固定にさらされるたびに、このステップから、動物は尿と糞排泄を示すが、これは徐々に慣れが進むにつれて減少します。 - ロックゴムバンドを取得し、ポートからマウンタを取り出します。バックホームケージに動物を入れて、報酬としてホームケージに穀物の一部またはヒマワリ種子を提供しています。次の試験は30分に開始されます。日以内3.4.4 5以上に3.4.1を繰り返します。
- 7日目4日、プロトコル3.4で説明したように固定を頭ために動物を公開します。徐々に（10分、20分、30分、および馴化が進むにつれて50分）ヘッド固定の持続時間を増加させます。
注：動物が行うとなしtはそれがストレスの高レベルの徴候である可能性があり、食品の報酬を養います。定着時間を増加させないでください。動物は繰り返し苦労挙動を示す場合は、より長い期間のためにそれらを慣らします。 - 毎日の動物の体重をチェックしてください。体重が減少している失敗慣れを考慮してください。成功慣れた後、頭部固定と行動のタスクに進みます。
注：成功慣れは、その後の行動訓練（ 図3EおよびF）を容易にします。
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Representative Results
このヘッドの固定方法は、ラットとマウスの両方に適用可能です。合計8匹のラットは、内側前脳束に電極を刺激する二国間の注入を受けました。それらのうち4については、カスタマイズされたタングステンワイヤ電極（マイクロドライブ）を追加的にM1前肢領域（ 図2C）に移植しました。マウスについて（N = 2）は、4つのステンレス鋼ワイヤ電極を、前頭/後頭部皮質領域に移植しました。手術からの回復後にプロトコル部2で説明するように手術中、ヘッドマウンタは、ラットとマウスの両方で頭部固定用に成形した、彼らは慣れまたは行動のタスクのいずれかのヘッド固定の日々のセッションに暴露しました。成形ヘッドマウンタは実験終了（40.5±1.73（平均±SD）ラットおよび81±5.66日間（手術後のマウスのためにSD）日平均値±）を介して滞在しました。ラットは、行動タスクの間に40〜60分の頭部固定毎日暴露しました。マウスがあることの40分に毎日20暴露しましたhaviorタスク。
これまで我々は、頭部固定の下でレバーを押すとプルラットを訓練するためにこの技術を使用していました。報酬は内側前脳束の直接電気刺激しました。それは誇張された運動行動を誘発するが、頭部固定はしっかりと偶発マウンタ分離せずに維持しました。
馴化後、固定バーのポートにヘッドマウンタをドッキングは、フックにゴムバンドをロックすることによって、数秒で完了しました。第1ヘッド固定に導入すると、動物はそのような場所で実行されているような行動を苦労して提示し、自分の足（ 図3AおよびB）をまっすぐ。しかし、そのような行動は慣れて減少しました。成功慣れは頭が（ 図3CおよびD）固定しながら、動物がこれ以上苦労挙動を示さないことが確認できます。
ヘッド固定バーの図1.デザイン。
（A）頭部固定バーのコンポーネント名。 a）ポート。 b）のフックをロックします。 c）の固定バー本体と、 d）の穴を固定します。 e）の壁をサポートします。 f）のアンカープレート。固定ボックスの設計は、挿入図に示されています。側壁の二つの穴は、人間工学的に固定棒を位置決めするために使用されます。 （B）のラットのために設計され頭部固定バーの斜視図。黒矢印は、パラフィンフィルムをカバーするの境界を示しています。 （C）マウスにおける頭部固定用のポートのデザイン。 （盧ら 9の図1から変更された） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
手術中マウンタ成形の2構築図。
（A）評論アルは、ヘッドマウンタを成形する手順。 （左）ネジ（黒のT形状）が頭蓋骨（グレー）面に垂直に注入されるべきです。歯科用接着性レジンセメント（緑）の薄層は、ネジと頭蓋骨の表面を覆っています。実験目的に応じて注入した後、（センター）は、追加のアクリル系樹脂（オレンジ色）が頭蓋骨表面のポートと、ベース樹脂にコーティングされた初期の樹脂との間の隙間に充填し、ヘッドマウンタの一部となるされています。追加されたアクリル系樹脂は、ハード設定されている（右）した後、ヘッドマウンタは、ポートからスライドさせて解除することができます。黒い実線は、パラフィンフィルムを示しています。 （ ら盧図1から変更された。9）（B）を構築ヘッドマウンタラットにおける（A-センターの工程の後に）放出するための準備ができています。 （CD）は、ヘッドマウンタとしてアクリル樹脂を成形しました。手術後、まだ麻酔下で、動物を固定バーから解放されます。黒矢印は、ポートの形状に一致するガイドレールを示しています。 PS：//www.jove.com/files/ftp_upload/53064/53064fig2large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.ラットとマウスをヘッドが固定されました。
動物を最初に固定し頭にさらされているとき（AB）は、彼らが行動を苦労して放出します。馴化が進むにつれて（CD）は、動物はあまり苦労挙動を示し、通常は、固定プラットフォームの床に座ります。成功したから行動タスク性能（E）及び（ ら盧図3から変更された。9）頭部固定環境の失敗（F）馴化の（EF）結果。リワード番号は（目的を成形するための）自由および偶発レバープルの両方を包含する。両方のセッションでは、十分に慣れたラットのみ偶発レバーによる非偶発的な動作から引く報わとパフォーマンスの低下を示しています。= "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53064/53064fig3large.jpg"ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dental acrylic resin | Lang Dental Manufacturing | Ortho-Jet | to make molded mounter |
| Paraffin film | Bemis | Parafilm | to prevent adhesion of acrylic resin to the bar |
| Dental adhesive | Sun Medical | Super-Bond C&B | to bond between acrylic resin and skull |
| Plexglass or other acrylic plate | to make fixation bar and box platform | ||
| Cyanoacrylate | to bond acrylic plates |
References
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