Introduction
Head fiksering eller hoved fastholdende er en teknik til immobilisering af dyrets hoved ved at fastgøre en ramme eller plade på kraniet for stive fastspænding. Teknikken er blevet vedtaget for præcis sensorisk stimulation, adfærdsmæssige sensing med eller uden neurale optagelse vågne dyr 1-3, og for juxtacellular mærkning under søvn-vågne cyklus 4. Det er også bruges til in vivo hjernescanning 5,6. Nu hoved fiksering teknik er et almindeligt anvendt redskab i neurovidenskab og adfærdsforskning.
Dybest set, traditionelle hoved fiksering kræver kirurgisk fastgørelse af metal hoved-stillinger oven på kraniet 6-8. De vedhæftede klemmes derefter til en stationær platform, hvilket resulterer i immobilisering af hovedet. Neurofysiologisk forskning i vågne dyr såsom neurale og / eller optisk optagelse, hjerne kredsløb indgriben, er hjernescanning ledsaget af implantation kirurgi hjælp dental akryl. Derfor,det synes en enkel opgave at gennemføre hovedet fiksering i disse laboratorier, når det er eksperimentelt nødvendigt. Rammerne bør designet til at være let og lille nok til ikke at forstyrre dyrets naturlige adfærd i deres bure. Det giver også mekanisk stivhed, når fastspændt på den stationære platform. Det har endvidere biokompatibilitet afhængigt af forsøg. Derfor er det teknisk vanskeligt at designe og fabrikere sådanne hoved-stillinger i almindelighed laboratorieudstyr.
I denne undersøgelse, er en hidtil ukendt hoved fiksering beskrevne metode, hvilket giver mekanisk stivhed gennem praktisk fastspænding uden brug af metal hoved-stillinger. Ved at bruge den metode, kunne hoved fiksering ske under almindelige laboratorieforhold, hvor implantation kirurgi er normalt udføres i gnavere for hjernens undersøgelse. Metal hoved-indlæg er erstattet med akryl harpiks cement støbt delvist af en skræddersyet hoved fiksering bar og støbeprocessen er gjort under implanførelsen kirurgi. Fiksering bar giver høj rumlig kompatibilitet med andre implantater, såsom neurale optagelse sonder, stimulering elektroder. Også det forenkler trinnene fastspænding af dyrets hoved på fiksering platform ved at fjerne skruefæstesystem. Vi brugte denne metode i den tidligere adfærdsmæssige undersøgelse, og vi konkluderede, at denne metode er let at implementere og praktisk i praktisk eksperimenter 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Statement:
Dette eksperiment blev godkendt af Kyungpook Nationale Universitet Institutional Animal Care og brug Udvalg, og blev udført i henhold til Vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr (National Institute of Health, 1996). Efter eksperimentet blev dyrene aflivet under kuldioxid eutanasi.
1. Design af Head-fiksering Bar for rotter
BEMÆRK: Dette trin er en generel retningslinje for en fiksering bar design. Enhver ændring om dimension og materialet er muligt, afhængigt af dyr eller implantater. Design af et head-fiksering bar ved hjælp af CAD-software anbefales, men ikke nødvendigt.
- Brug CAD-software til at designe en fiksering bar.
- Design en fiksering bar af en rektangulær form (123 × 35 × 6 mm) (Figur 1A). Lav en rektangulær indskæring (16 × 20 mm port) i midten af fikseringen bar. Tilføj skråninger eller fordybninger which tjene som styreskinne på grænsen af havnen (figur 1A-a, figur 1B -arrows).
BEMÆRK: Sørg for, at det område af havnen dækker anslåede rektangel af rottens kranie i hjernen til at tillade lodrette adgange ved hjælp af en stereotaktisk manipulator til de fleste af de områder i hjernen via en kraniotomi. - Fastgør pladerne (50 × 20 × 6 mm) med to aflange ankerhullerne på begge sider af fiksering bar. Sørg for, at disse huller passere skruer med en diameter på 6 mm (figur 1A-d). Lave et hul med en diameter på 3 mm foran porten for en låsehage (figur 1A-b).
- Foretag en kasse med en bund (135 × 305 mm) og sidevægge (305 × 76 mm). Bor to huller med en diameter 6 mm som vist i figur 1A (indsat). Tilføj støttevægge på fiksering bar (figur 1A-e).
- Design en fiksering bar af en rektangulær form (123 × 35 × 6 mm) (Figur 1A). Lav en rektangulær indskæring (16 × 20 mm port) i midten af fikseringen bar. Tilføj skråninger eller fordybninger which tjene som styreskinne på grænsen af havnen (figur 1A-a, figur 1B -arrows).
- Fremstilling af designet bar og kasse og samle hver af dem ved hjælp cyanoacrylate somvist i figur 1A (indsat). Saml baren på kassen med skruer på 6 mm i diameter. Påfør hældning ved at justere skruen position baren for ergonomiske hoved fiksering (figur 1A-indsat).
BEMÆRK: mus, dimensionen af fiksering bar er 60 × 20 × 4 mm (bestående af to lag 2 mm tykke akryl paneler). Porten er kvadratet på 8 mm bredde (øvre) og 9 x 10 mm (lavere) som vist i figur 1C. Forankringspladerne er af samme størrelse rotter '. Boksen plade og sidevægge er 100 × 72 mm og 100 x 50 mm.
2. Leder Mounter Byggeri under implantation Kirurgi
ADVARSEL: Vær forsigtig, når der beskæftiger sig med dental akryl harpiks. Væske kan forårsage hudirritation. Sæt en maske og handsker. Arbejde i et godt ventileret område.
- Klargøring før operation
- Tæt wrap grænsen til havnen i fikseringen bar ved hjælp af aparaffin film for at forhindre adhæsion af anvendt acrylharpiks til linjen (se figur 1B og 2A). Coat grænsen til havnen omfattet af paraffin film med et tyndt lag af acrylharpiks.
- Brug steriliserede kirurgiske instrumenter. Desinficere grundigt stereotaktisk ramme og dens omgivende anvendelse af 70% ethylalkohol.
- Udfør stereotaktisk implantation kirurgi
- Bedøver et dyr ved intraperitoneal injektion af en cocktail blanding (2 ml / kg) af ketamin 10 ml (50 mg / ml), xylazinhydrochlorid 1,5 ml (23,32 mg / ml) og saltvand 2,5 ml. Bekræft, at dyret fuldt bedøvet og reagerer ikke på hale og tå trykker. Injicer cocktail blanding af 1 ml / kg i løbet af operation, når det er nødvendigt.
- Fastgør dyret til stereotaktisk apparat. Påfør oftalmologiske salve på øjnene for at undgå tørhed under operationen. Barbere og rengør hovedbunden med 70% ethanol. Giv subkutan injektion af 2% lidocain og incise SCAlp langs midterlinjen af kraniet. Helt skrabe periost. Skyl med saltvand flere gange.
- Gør grat-hul boring nær randen af kraniet. Implant skruer 4-5 omgange (op til 1 mm dybde) fra kraniet overflade for at forhindre en overtrædelse af dura mater. Sørg for, at ingen lækage af CSF og blod på kraniet overflade efter skrue implantation. Skyl med saltvand og tør kraniet overfladen ved anvendelse af luft-sug, især omkring skruerne.
- Coat kraniet overflade med et tyndt lag af "dental lim (Super-Bond C & B)". Må ikke helt dække overfladen af kraniet med bregma hvis yderligere elektrode implantation er planlagt. Brug bregma for mærkning kraniotomi koordinater. Implant elektroder og / eller Microdrive og ordne det på kraniet ved at anvende akryl harpiks omkring det.
- Påfør yderligere akryl harpiks oven på dental cement. Brug passende mængde akryl harpiks til at forlade tilstrækkelig fill-out rum mellem bar-belagt harpiks etd indledende montering harpiks, når fiksere skruerne og / eller elektroder (figur 2A).
- Placer hoved-fiksering bar 5 mm eller mere over kraniet overflade og tilpasse sin centrum (figur 2A -venstre).
- Påfør akryl harpiks ind i mellemrummet mellem bunden af kraniet og indledende montering harpiks. (Figur 2A -Center). Vent, indtil harpiksen bliver hårdt.
- Fjern øre-bar og træk det støbte Mounter ud af fiksering bar porten. (Figur 2A -Lige). Anvende omhyggeligt ekstra akryl harpiks omkring kanten skinner det støbte Mounter om nødvendigt.
- Skyl såroverfladen i hovedbunden med sterilt saltvand. Injicere et antibiotikum (enrofloxacin, 5 mg / kg sc) og et analgetikum (butorphanoltartrat, 2 mg / kg sc) umiddelbart efter operationen. Huse dyret individuelt i en enkelt bur.
3. habituating Dyr, Head-fiksering
Bemærk: Dette trin deskriftkloge tilvænnings- skemaer baseret på ophavsmændenes empirisk succesfulde vurderinger. For en oversigt over tilvænning procedure for hoved-fiksering, se Schwartz 's 10 eller Guo 11 arbejde.
- Giv tilstrækkelig opsving periode (en uge eller mere) til dyr. På dag 1, Håndtag dyr ofte på opdelte korte sessioner.
- Den næste dag (dag 2), udsættes dyret til optagelsen miljøet (boks). Sæt ikke deres hoved Mounter i porten af fiksering baren. Lad dyr for at vænne sig til omgivelserne. Sikker fat hovedet Mounter hjælp hånd for 1 til 2 sek og slip den med det samme. Gentag kortsigtet fiksering af hånd-grab flere gange.
- På dag 3, vænne dyr til hoved-fiksering.
- Bring dyr fra hjemmet bure og bosætte dem i boksen dirigere hoveder mod havnen i fikseringen baren. Grab hovedet Mounter og indsætte det i havnen i fikseringen baren.
- Binde Mounter (dyretshead) til låsekrogen af fiksering bar ved hjælp af en elastik. Stand i 5 min.
BEMÆRK: Rør ikke ved stammen eller hale af dyret efter fiksering, hvilket fører dyret til at knirke og kamp stigende dyrets stress. Når dyret fortsætter kæmper mere end 1 min, slip den og prøve senere. Fra dette trin, dyr viser urin og afføring udskillelse, når de udsættes for hoved fiksering, men det gradvist bliver reduceret som tilvænnings- skrider frem. - Hent låsning elastik og skubbe Mounter ud af havnen. Sæt dyrene tilbage til hjemmet bur og give et stykke af korn eller et solsikkefrø i hjemmet bur som en belønning. Det næste forsøg begynder i 30 min. Gentag 3.4.1 til 3.4.4 fem eller flere inden for en dag.
- På dag 4 til 7, udsætte dyret til hovedet fiksering som beskrevet i protokol 3.4. Gradvist øge varigheden af hovedet fiksering (10 min, 20 min, 30 min og 50 min som tilvænnings- provenu).
BEMÆRK: Hvis dyr gøre nogett fodre foderbelønning, kan det være et tegn på en høj grad af stress. Må ikke øge fiksering tid. Hvis dyrene viser gentagne kæmper adfærd, vænne dem i en længere periode. - Kontroller dyrets kropsvægt dagligt. Overvej mislykket tilvænning, når kropsvægten er faldende. Fortsæt til adfærdsmæssige opgaver med hoved fiksering efter vellykket tilvænning.
BEMÆRK: Vellykket tilvænning letter efterfølgende adfærdsmæssige uddannelse (Figur 3E og F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette hoved fiksering metode kan anvendes til både rotter og mus. Total otte rotter modtog bilateral implantation stimulere elektroder i den mediale forhjernebundt. For fire ud af dem, blev tilpassede wolfram wire elektroder (Microdrive) derudover implanteret i M1 forben området (Figur 2C). For mus (n = 2), fire rustfrit stål trådelektroder blev implanteret i frontal / occipital kortikale områder. Under operationen blev hoved mounters støbt til hovedet fiksering i både rotter og mus, som beskriver i protokol sektion 2. Efter genopretning fra kirurgi, blev de udsat for daglige arrangementer hoved fiksering til enten tilvænning eller adfærdsmæssige opgave. De støbte hoved mounters holdt ved forsøgets afslutning (40,5 ± 1,73 (gennemsnit ± SD) dage for rotter og 81 ± 5,66 (middel ± SD) dage for mus efter kirurgi). Rotter blev udsat dagligt 40 til 60 min hoved fiksering under opførsel opgave; mus blev udsat dagligt 20 til 40 minutter af værehavior opgave.
Tidligere brugte vi denne teknik til at træne rotter skubbe og trække en løftestang under hoved fiksering. Belønningen var direkte elektrisk stimulation af den mediale forhjernen bundt. Selv om det fremkalder overdrevet bevægeapparatet adfærd blev hoved fiksering fast opretholdes uden utilsigtet Mounter adskillelse.
Efter tilvænning blev docking hovedet Mounter i porten af fiksering bar afsluttet i et par sekunder ved at låse elastik til krogen. Når først indført til hovedet fiksering, præsenterer dyr kæmper adfærd såsom at køre på plads, ordne deres ben (figur 3A og B). Men sådanne adfærd formindsket med tilvænning. Vellykket tilvænning kan bekræftes, at dyr viser ikke mere modstandsadfærd mens hovedet fast (figur 3C og D).
Figur 1. Design af hovedet-fiksering bar.
(A) Komponent navne på hovedet fiksering baren. a) port; b) låsehage; c) fiksering bar krop; d) forankring huller; e) støtte væggen; f) forankringsplade. Design af fiksering feltet er vist i det indsatte. To huller i sidevæggen anvendes til ergonomisk positionering af fiksering bar. (B) i perspektiv designet hoved fiksering bar for rotter. Sorte pile angiver grænsen dække paraffin film. (C) Udformningen af port til hovedet fiksering i mus. (Modificeret fra figur 1 i Roh et al. 9) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Konstruktion af Mounter støbning under operationen.
(A) Critic al skridt støbning hovedet Mounter. (Venstre) Skruer (T figurer i sort) skal implanteres vinkelret på kraniet (grå) overflade. Et tyndt lag af dental Resincement (grøn) omfatter skruer og kraniet overflade. (Center) Efter implantation afhængigt af eksperimentelle formål, er yderligere akryl harpiks (orange) fyldt i mellemrummet mellem indledende harpiks belagt på havne- og basisharpikser i kraniet overflade og bliver en del af hovedet Mounter. (Højre) Efter tilføjet acrylharpikser er hårde sæt, kan hovedet Mounter frigøres ved at skubbe ud af havnen. Solid sorte streger angiver paraffin film. (Modificeret fra figur 1 i Roh et al. 9) (B) er indrettet hovedet Mounter i rotter er klar til frigivelse (efter trinnet med A-Center). (CD) Støbt acrylharpikser tjener som et hoved Mounter. Efter operationen, stadig under anæstesi, dyr frigives fra fiksering bar. Sorte pile angiver styreskinner matchende til formen af havnen. ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53064/53064fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Head-fast rotter og mus.
(AB) Når dyr er i første omgang udsat til hovedet fiksering, de udsender kæmper adfærd. (CD) Som tilvænnings- skrider frem, dyr viser mindre kæmper adfærd og normalt sidder ned på gulvet i den stationære platform. (EF) Resultat af adfærdsmæssige opgave forestillinger fra vellykket (E) og forgæves (F) tilvænning af hoved fiksering miljø (Modificeret fra figur 3 i Roh et al. 9). Reward nummer favner både fri (til at forme formål) og betingede løftestang træk. I begge sessioner, utilstrækkeligt vant rotte viser dårlige resultater med kun belønnet af utilsigtet løftestang trækker fra ikke-kontingent adfærd.= "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53064/53064fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dental acrylic resin | Lang Dental Manufacturing | Ortho-Jet | to make molded mounter |
| Paraffin film | Bemis | Parafilm | to prevent adhesion of acrylic resin to the bar |
| Dental adhesive | Sun Medical | Super-Bond C&B | to bond between acrylic resin and skull |
| Plexglass or other acrylic plate | to make fixation bar and box platform | ||
| Cyanoacrylate | to bond acrylic plates |
References
- Mayrhofer, J. M., et al. Novel two-alternative forced choice paradigm for bilateral vibrotactile whisker frequency discrimination in head-fixed mice and rats. J Neurophysiol. 109, 273-284 (2013).
- Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice. J Neurosci Methods. 178, 75-79 (2009).
- Ollerenshaw, D. R., et al. Detection of tactile inputs in the rat vibrissa pathway. J Neurophysiol. 108, 479-490 (2012).
- Lee, M. G., Manns, I. D., Alonso, A., Jones, B. E. Sleep-wake related discharge properties of basal forebrain neurons recorded with micropipettes in head-fixed rats. J Neurophysiol. 92, 1182-1198 (2004).
- Lutcke, H., et al. Optical recording of neuronal activity with a genetically-encoded calcium indicator in anesthetized and freely moving mice. Front Neural Circuits. 4, 9 (2010).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56, 43-57 (2007).
- Kimura, R., et al. Reinforcing operandum: rapid and reliable learning of skilled forelimb movements by head-fixed rodents. Journal of neurophysiology. 108, 1781-1792 (2012).
- Hadlock, T., Kowaleski, J., Mackinnon, S., Heaton, J. T. A novel method of head fixation for the study of rodent facial function. Experimental neurology. 205, 279-282 (2007).
- Roh, M., Jang, I. S., Lee, M. G. Push-in Head Restraining Apparatus for Intracranial Self Stimulation Tasks in Rats. Korean J Physiol Pharmacol. 18, 103-108 (2014).
- Schwarz, C., et al. The head-fixed behaving rat--procedures and pitfalls. Somatosensory & motor research. 27, 131-148 (2010).
- Guo, Z. V., et al. Procedures for Behavioral Experiments in Head-Fixed Mice. PLoS ONE. 9, (2014).
- Osborne, J. E., Dudman, J. T. RIVETS: a mechanical system for in vivo and in vitro electrophysiology and imaging. PLoS One. 9, e89007 (2014).
