Akryl Resin Molding Based Leder Fixation Technique i Gnagere

Introduction

Hodet fiksering eller hodet besøksforbud er en teknikk for å immobilisere dyrets hode ved å feste en ramme eller plate på skallen for rigid fastspenning. Teknikken har blitt vedtatt for nøyaktig sansestimulering, atferds sensing med eller uten nevrale opptak i våken dyr ^1-3 og for juxtacellular merking under søvn-våkne syklus ^fire. Det er også brukt for in vivo avbildning av hjernen ^5,6. Nå hodet fiksering teknikken er et vanlig verktøy i nevrovitenskap og atferdsforskning.

I utgangspunktet tradisjonelle hodefiksering krever kirurgisk feste metallhodestolper på toppen av skallen ^6-8. Vedleggene blir deretter festet til en stasjonær plattform, noe som resulterer i immobilisering av hodet. Nevrofysiologiske undersøkelser i våken dyr som nevrale og / eller optisk opptak, hjerne kretser intervensjon, er avbildning av hjernen ledsaget av implantasjon kirurgi ved hjelp av tann akryl. Derfor,synes det en enkel oppgave å implementere hodet fiksering i de laboratoriene når det er nødvendig eksperimentelt. Rammene bør være utformet for å være lette og små nok til ikke å forstyrre dyrets naturlige atferd i sine egne bur. Det gir også mekanisk stivhet når klemt til den stasjonære plattform. Den har videre biokompatibilitet avhengig eksperimentelle formål. Derfor er det teknisk vanskelig å designe og dikte slike hode innlegg i generelt laboratorieutstyr.

I denne studien er en roman hodet fiksering metoden beskrevet, og gir mekanisk stivhet gjennom praktisk klem uten å bruke metall hode-innlegg. Ved anvendelse av fremgangsmåten, kan hodet fiksering foregå under de generelle laboratoriebetingelser, hvor implantasjon operasjon utføres vanligvis i gnagere for hjernen studien. Metallhode innlegg er erstattet med akryl sement støpt delvis av en skreddersydd hodet fiksering bar og støpeprosessen er ferdig i løpet av implantering kirurgi. Fiksering bar gir høy romlig kompatibilitet med andre implantater, for eksempel nevrale opptak sonder, stimuleringselektroder. Også det forenkler trinnene klem dyrets hode på fiksering plattformen ved å fjerne skruefeste. Vi brukte denne metoden i forrige atferdsstudie og vi konkluderte med at denne metoden er enkel å implementere og praktisk i praktisk eksperimentering ^9.

Protocol

Etikk Uttalelse:
Dette eksperimentet ble godkjent av Kyungpook National University Institutional Animal Care og bruk komité, og ble utført i henhold til guide for Care og bruk av forsøksdyr (National Institute of Health, 1996). Etter forsøket ble dyrene avlivet etter karbondioksid dødshjelp.

1. Design av Head-fiksering Bar for Rats

MERK: Dette trinnet er en generell retningslinje for en fiksering bar design. Enhver endring om dimensjon og materialet er mulig avhengig av dyr eller implantater. Designe et head-fiksering bar ved hjelp av CAD-programvare er anbefalt, men ikke nødvendig.

1. Bruke CAD-programvare for å designe en fiksering bar.
   1. Utforme en fiksering bar av en rektangulær form (123 × 35 × 6 mm) (figur 1A). Lage et rektangulært hakk (16 x 20 mm; port) i midten av bindingslinjen. Legg bakkene eller fordypninger hh tjene som en styreskinne på grensene til porten (figur 1A-en, -arrows Figur 1b).
      MERK: Kontroller at arealet av porten dekker estimert rektangel av rotte skallen over hjernen til å tillate vertikal tilganger bruker en stereotaksisk manipulator til det meste av hjerneområder gjennom en kraniotomi.
   2. Feste plater (50 x 20 x 6 mm) med to langstrakte forankringshull på begge sider av festelinjen. Sørg for at disse hullene passerer skruer med mm diameter (Figur 1A-d) 6. Lag et hull med diameter 3 mm foran porten for en låsehake (figur 1A-b).
   3. Lag en boks med en etasje (135 × 305 mm) og sidevegger (305 × 76 mm). Bore to hull med diameter 6 mm som vist i figur 1A (innfelt). Legg bærevegger på festelinjen (figur 1A-e).
2. Produsere utformet bar og boksen og montere hver av dem ved hjelp cyanoacrylate somvist i figur 1A (innfelt). Monter bar på boksen med skruer av 6 mm diameter. Påfør skråningen ved å justere skruen posisjonen til baren for ergonomisk hodefiksering (figur 1A-innfelt).
   NB: For mus, er dimensjonen av bindingslinjen 60 x 20 x 4 mm (bestående av to lag med 2 mm tykkelse akryl paneler). Porten er kvadratet av 8 mm bredde (øvre) og 9 x 10 mm (lavere) som vist i figur 1C. Forankringsplatene er samme størrelse på rotter '. Boksen plate og sidevegger er 100 x 72 mm og 100 x 50 mm, respektivt.

2. Leder Mounter Anlegg under Implantasjon Surgery

FORSIKTIG: Vær forsiktig når du arbeider med dental akryl. Væsken kan irritere huden. Sett på en maske og bruke hansker. Arbeid i et godt ventilert område.

1. Forberedelser før operasjon
   1. Tett vikle grensen av havnen i fiksering bar ved hjelp av aparaffin film for å hindre vedheft av anvendt akryl harpiks til bar (se Figur 1B og figur 2A). Coat grensen av porten dekket av parafinfilm med et tynt lag av akrylharpiks.
   2. Bruk steriliserte kirurgiske instrumenter. Grundig desinfisere stereotaxic ramme og dens omkringliggende bruker 70% etylalkohol.
2. Utfør stereotaksisk implantasjon kirurgi
   1. Bedøve et dyr ved intraperitoneal injeksjon av en cocktail blanding (2 ml / kg) av ketamin 10 ml (50 mg / ml), xylazin-hydroklorid 1,5 ml (23,32 mg / ml), og saltløsning 2,5 ml. Bekrefte at dyret fullt bedøvet og ikke svare på halen og tå klyper. Injiser cocktail blanding av 1 ml / kg i løpet av operasjonen når det er nødvendig.
   2. Fest dyret til stereotaxic apparat. Påfør oftalmisk salve på øynene for å hindre tørrhet under operasjonen. Barbere og rense hodebunnen med 70% etanol. Gi subkutan injeksjon på 2% lidokain og innsnittet SCAlp langs midtlinjen av skallen. Helt skrape av periosteum. Skyll med saltvann flere ganger.
   3. Gjør Burr-hullsboring nær kanten av skallen. Implant skruer 4-5 svinger (opp til 1 mm dybde) fra skallen overflaten for å hindre brudd på dura mater. Pass på at ingen lekkasje av CSF og blod på skallen overflaten etter skrue implantasjon. Skyll med saltvann og tørk skallen overflaten ved hjelp av luft-puff, spesielt rundt skruene.
   4. Coat skull overflate med et tynt lag av "dentaladhesiv (Super-Bond C & B)". Ikke helt dekker overflaten av hodeskallen inkludert bregma hvis ytterligere elektrode implantasjon er planlagt. Bruk bregma for merking kraniotomi koordinater. Implant elektroder og / eller Microdrive og fikse det på skallen ved å bruke akryl rundt det.
   5. Påfør ekstra akryl på toppen av dental sement. Bruk passende mengde akryl harpiks å forlate tilstrekkelig fylle ut mellomrommet mellom bar-belagt resin end innledende montering harpiks når feste skruene og / eller elektroder (figur 2A).
3. Plassere hodet-fiksering bar 5 mm eller mer over skallen overflaten og innrette sitt senter (figur 2A -Venstre).
4. Anvende akrylharpiks inn i gapet mellom bunnen av skallen og innledende monterings harpikser. (Figur 2A -Center). Vent inntil harpiksen blir hardt.
5. Fjern øre-bar og trekk den støpte Mounter ut av fiksering bar port. (Figur 2A -Rett). Bruk ekstra akryl nøye rundt kanten skinnene i støpt Mounter om nødvendig.
6. Skyll såroverflaten i hodebunnen med sterilt saltvann. Sprøyt et antibiotikum (Enrofloxacin, 5 mg / kg sc) og et smertestillende (butorphanoltartrat, 2 mg / kg sc) umiddelbart etter operasjonen. Huse dyr individuelt i en enkelt merd.

3. habituating Dyr to Head-fiksering

Merk: Dette trinnet deskriftlærde tilvenning tidsplaner basert på forfatternes empirisk vellykkede vurderinger. For en oversikt over tilvenning prosedyre for head-fiksering, se Schwartz ^{10 eller} Guo er ¹¹ arbeid.

1. Gi tilstrekkelig utvinning periode (en uke eller mer) til dyr. På dag 1, Håndtak dyrene ofte på delt korte økter.
2. På neste dag (dag 2), utsette dyret for fiksering miljøet (boks). Ikke stikk hodet Mounter inn i porten på fiksering bar. La dyr å venne seg til miljøet. Sikkert ta tak i hodet Mounter bruker hånden for 1 til 2 sek og slipp den umiddelbart. Gjenta kortsiktig fiksering av håndgripe flere ganger.
3. På dag tre, tilvenne dyr til head-fiksering.
   1. Ta med dyr fra hjemmet bur og bosette dem i boksen regi hoder mot porten på fiksering bar. Ta tak i hodet Mounter og sett den inn i porten på fiksering bar.
   2. Binde Mounter (dyretshode) til låsekroken av fiksering bar ved hjelp av en gummistrikk. Stå i 5 min.
      MERK: Ikke ta stammen eller hale av dyret etter fiksering, noe som fører dyret til knirker og slite øke dyrets stress. Når dyret fortsetter sliter mer enn 1 min, slipper det og prøve senere. Fra dette trinnet, dyr viser urin og avføring utskillelse når de utsettes for hodet fiksering, men dette gradvis blir redusert som tilvenning provenyet.
   3. Hente låsegummistrikk og løse ut Mounter ut av porten. Sette dyrene tilbake til hjemmet buret og gi et stykke kornblanding eller en solsikke frø inn i hjemmet buret som en belønning. Det neste forsøk begynner i 30 min. Gjenta 3.4.1 til 3.4.4 fem eller mer i løpet av en dag.
4. På dag 4 til 7, utsette dyret til hodet fiksering som beskrevet i protokoll 3.4. Gradvis øke varigheten av hodet fiksering (10 min, 20 min, 30 min, 50 min og som tilvenning utbytte).
   MERK: Hvis dyr gjør ingent mate maten belønning, det kan være et tegn på et høyt nivå av stress. Ikke øk fiksering tid. Hvis dyr viser gjentatte sliter atferd, tilvenne dem for en lengre periode.
5. Sjekk dyrets kroppsvekt daglig. Vurdere mislykket tilvenning når kroppsvekt er avtagende. Fortsett til atferds oppgaver med hodet fiksering etter vellykket tilvenning.
   MERK: Vellykket tilvenning forenkler påfølgende atferdstrening (Figur 3E og F).

Representative Results

Dette hodet fiksering metoden gjelder for både rotter og mus. Totalt åtte rotter fikk bilateral implantasjon av stimulerende elektroder i mediale forebrain bunt. For fire av dem, ble tilpasset wolfram trådelektroder (Microdrive) i tillegg implantert i M1 forbena området (Figur 2C). For mus (n = 2), fire rustfrie stålelektroder ble implantert i frontal / oksipitale hjernebark. Under operasjonen ble det hode mounters støpt for hodet fiksering i både rotter og mus, som beskriver i protokoll § 2. Etter utvinning fra kirurgi, ble de utsatt for daglige økter med hodet fiksering for enten tilvenning eller atferdsmessige oppgave. Den støpte hode mounters bodde gjennom slutten av forsøket (40,5 ± 1,73 (gjennomsnitt ± SD) dager for rotter og 81 ± 5.66 (gjennomsnitt ± SD) dager for mus etter operasjonen). Rottene ble eksponert daglig 40 til 60 minutter hode opptaket i løpet av atferd oppgave; mus ble eksponert daglig 20-40 min av å værehavior oppgave.

Tidligere har vi brukt denne teknikken til å trene rotter dytte og dra en spak under hodet fiksering. Belønningen var direkte elektrisk stimulering av den mediale brain bunt. Selv om det utløser overdrevet bevegelsesatferd, ble hodet fiksering fast opprettholdes uten utilsiktet Mounter separasjon.

Etter tilvenning, ble dokke hodet Mounter inn i porten på fiksering bar gjennomført i noen andre ved å låse gummistrikk til kroken. Når først introdusert til hodet fiksering, gaver dyr sliter atferd som kjører på plass, rette ut bena (figur 3A og B). Men slik oppførsel redusert med tilvenning. Vellykket tilvenning kan bekreftes at dyr viser ingen flere sliter atferd mens hodet fast (figur 3C og D).

Figur 1. Design av hodet-fiksering bar.
(A) Komponent navnene på hodet fiksering bar. a) port; b) låsing krok; c) fiksering bar kroppen; d) forankringshull; e) støttevegg; f) forankringsplaten. Design av fiksering boksen er avbildet i innfelt. To hull i sideveggen benyttes for å ergonomisk plassering av fikseringslinjen. (B) i perspektiv designet hodefiksering bar for rotter. Sorte piler angir grensen for å dekke parafin filmer. (C) Utformingen av port for hodet fiksering hos mus. (Modifisert fra Figur 1 av Roh et al. ⁹⁾ Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Bygging av Mounter molding under operasjonen.
(A) Critic al skritt støping hodet Mounter. (Venstre) Skruer (T figurer i svart) bør implanteres vinkelrett på skallen (grå) overflate. Et tynt lag av dentalklebeharpikssement (grønn) omfatter skruer og skalleoverflaten. (Center) etter implantering, avhengig av eksperimentelle formål, er flere akrylharpikser (oransje) fylt i gapet mellom første harpiksbelegg på babord og base-harpikser i skallen overflaten, og blir en del av hodemonterings. (Høyre) Etter lagt akrylharpikser er vanskelig sett, kan hodet Mounter frigis ved å skyve ut av porten. Hele sorte linjene indikerer parafin filmer. (Modifisert fra figur 1 fra Roh et al. ⁹⁾ (B) Konstruert monteringshodet i rotter er klar for frigjøring (etter trinnet med A-Center). (CD) Støpt akrylharpikser fungerer som et hode Mounter. Etter operasjonen fortsatt under narkose, dyrene er frigitt fra fiksering bar. Sorte piler indikerer styreskinner som samsvarer med formen på porten. ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53064/53064fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Leder fiksert rotte og mus.
(AB) Når dyr blir først utsatt til hodet fiksering, avgir de sliter atferd. (CD) Som tilvenning provenyet, dyr viser mindre sliter atferd og vanligvis sette seg ned på gulvet av den stasjonære plattformen. (EF) Resultat av atferdsoppgave forestillinger fra vellykket (E) og mislykket (F) tilvenning av hodet fiksering miljø (Modifisert fra figur 3 av Roh et al. ^9). Belønning antall favner både gratis (for å forme formål) og betinget spaken pull. I begge øktene, utilstrekkelig tilvent rotta viser dårlig ytelse med bare belønnet ved utilsiktet spaken trekker fra non-kontingent atferd.= "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53064/53064fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dental acrylic resin	Lang Dental Manufacturing	Ortho-Jet	to make molded mounter
Paraffin film	Bemis	Parafilm	to prevent adhesion of acrylic resin to the bar
Dental adhesive	Sun Medical	Super-Bond C&B	to bond between acrylic resin and skull
Plexglass or other acrylic plate			to make fixation bar and box platform
Cyanoacrylate			to bond acrylic plates