Introduction
Глава фиксация или голова сдерживающим является методика иммобилизации головы животного путем прикрепления рамы или пластины на черепе для жесткого зажима. Методика была принята для точной сенсорной стимуляции, поведенческих зондирования с или без нейронной записи в активных животных 1-3 и для juxtacellular маркировки во время цикла сон-бодрствование 4. Он также используется для в естественных условиях мозга изображений 5,6. Теперь техника глава фиксация широко используемый инструмент в неврологии и поведенческих исследований.
В основном, традиционные фиксация головки требует хирургического крепление металлических головных сообщений в верхней части черепа 6-8. Приставки затем зажимают в стационарной платформе, в результате чего иммобилизации головы. Нейрофизиологические исследования в активных животных, таких как нервной и / или оптической записи, мозга вмешательства схему, сканирование мозга сопровождается имплантации хирургии с использованием стоматологических акриловых. Следовательно,кажется простой задачей для реализации главного фиксацию в тех лабораториях, когда это необходимо экспериментально. Кадры должны быть разработаны, чтобы быть легкий и достаточно маленький, чтобы не нарушить естественное поведение животного в их клетках. Она также обеспечивает механическую жесткость при крепится к стационарной платформе. Он также имеет биосовместимость в зависимости от экспериментальных целей. Таким образом, это технически сложно спроектировать и изготовить такие головные сообщения в общей лабораторного оборудования.
В этом исследовании, новый метод головы фиксация описано, обеспечивая механическую жесткость через удобный зажим без использования металлических головные сообщения. С помощью метода, руководитель фиксация может быть сделано в соответствии с общими лабораторных условиях, где имплантация операция обычно выполняется на грызунах для изучения мозга. Головной сообщений металлические заменяются акриловой смолы цемента литого частично изготовленной на заказ бар глава фиксации и процесса формования делается во implanставление хирургии. В баре фиксация обеспечивает высокую пространственную совместимость с другими имплантатами, например, нейронных зондов записи, стимулирование электродов. Также это упрощает шаги зажима голову животного на фиксации платформы, удалив винт-крепление. Мы использовали этот метод в предыдущем исследовании поведенческих и мы пришли к выводу, что этот метод прост в реализации и удобен в практическом экспериментов 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
О себе этика:
Этот эксперимент был одобрен Комитетом по Уходу за животными и использованию Kyungpook национального университета, и осуществляется в соответствии с Руководство по уходу и использованию лабораторных животных (Национальный институт здравоохранения, 1996). После эксперимента животных умерщвляли под эвтаназии диоксида углерода.
1. Дизайн-глава фиксации Бар для крыс
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является общим ориентиром для конструкции крепление бар. Любая модификация о размерности и материала можно в зависимости от животных или имплантаты. Проектирование голова фиксации бар, используя программное обеспечение САПР рекомендуется, но не необходимо.
- Используйте программное обеспечение САПР для разработки фиксации бар.
- Дизайн фиксации бар прямоугольной формы (123 × 35 × 6 мм) (рис 1А). Сделать прямоугольную выемку в (16 × 20 мм; порт) в середине бара фиксации. Добавить склоны или углубления whicч служить направляющей на границах порта (рис 1А-а, 1В -arrows).
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что площадь порта охватывает расчетное прямоугольник черепа крысы над мозгом, чтобы вертикальные доступы с помощью стереотаксической манипулятор для большинства областей мозга через трепанации черепа. - Приложить пластины (50 × 20 × 6 мм) с двумя отверстиями крепежных удлиненных по обе стороны панели фиксации. Убедитесь, что эти отверстия проходят винты диаметром 6 мм (Рис 1A-D). Сделайте отверстие диаметром 3 мм в передней части порта для запорного крюка (1А-б).
- Сделать коробку, имеющую пол (135 × 305 мм) и боковые стенки (305 × 76 мм). Просверлите два отверстия диаметром 6 мм, как показано на рисунке 1А (вставка). Добавить несущих стен на панели фиксации (1А-е).
- Дизайн фиксации бар прямоугольной формы (123 × 35 × 6 мм) (рис 1А). Сделать прямоугольную выемку в (16 × 20 мм; порт) в середине бара фиксации. Добавить склоны или углубления whicч служить направляющей на границах порта (рис 1А-а, 1В -arrows).
- Производство проектной бар и поле и собрать каждый из них с помощью Цианоакрилат впоказано на фиг.1А (вставка). Соберите бар на коробке, используя винты диаметром 6 мм. Применить крутизну регулировки положения шнека баре для эргономичной фиксации головы (1А-вставка).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для мышей, размерность в баре фиксации 60 × 20 × 4 мм (состоящий из двух слоев толщиной 2 мм акриловые панели). Порт квадрат 8 мм ширины (верхний) и 9 х 10 мм (нижний), как показано на рисунке 1С. Анкерные пластины имеют тот же размер крыс. В окно пластины и боковые стенки 100 × 72 мм и 100 × 50 мм, соответственно.
2. Руководитель Mounter Строительство во время имплантации хирургии
ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны при работе с зубной акриловой смолы. Жидкость может вызвать раздражение кожи. Положите маску и надеть перчатки. Работа в хорошо проветриваемом помещении.
- Подготовка перед операцией
- Плотно оберните границу порту фиксация бар с использованием арaraffin фильм, чтобы предотвратить прилипание прикладного акриловой смолы в бар (рис 1B и рис 2А). Шерсть границе порта, охватываемого парафиновой пленки с тонким слоем акриловой смолы.
- Используйте стерилизованные хирургических инструментов. Тщательно продезинфицировать стереотаксической рамы и окружающие его с помощью 70% этиловый спирт.
- Выполните стереотаксической хирургии имплантация
- Обезболить животное путем внутрибрюшинной инъекции коктейля смеси (2 мл / кг) кетамин 10 мл (50 мг / мл), гидрохлорида ксилазина 1,5 мл (23,32 мг / мл), и солевым раствором 2,5 мл. Убедитесь, что животное полностью под наркозом и не отвечает на хвост и ног щепотки. Вводят коктейль смеси 1 мл / кг во время операции, когда это необходимо.
- Fix животное в стереотаксической аппарата. Применить глазной мази на глазах, чтобы предотвратить сухость во время операции. Бритье и очистить кожу головы с 70% этанола. Дайте подкожную инъекцию лидокаина 2% и надрезать SCALP вдоль средней линии черепа. Полностью соскрести надкостницы. Промыть засоленных несколько раз.
- Сделать заусенцев сверление вблизи обода черепа. Имплантаты винты 4-5 витков (до 1 мм глубина) от поверхности черепа, чтобы предотвратить нарушение твердой мозговой оболочки. Убедитесь в отсутствии утечки CSF и крови на поверхности черепа после винта имплантации. Промыть физиологическим раствором и высушить поверхность черепа использовании воздушного затяжке, особенно вокруг винтов.
- Пальто череп поверхность тонким слоем клея "стоматологическая (Super-Bond C & B)". Не совсем покрывают поверхность черепа, включая брегмы если дополнительный электрод имплантации запланировано. Используйте брегмы для маркировки трепанации черепа координаты. Имплантаты электроды и / или Microdrive и закрепить его на черепе путем нанесения акриловой смолы вокруг него.
- Применение дополнительного акриловую смолу на верхней части зубной цемент. Используйте соответствующее количество акриловой смолы, чтобы оставить достаточно заполняемой пространство между бар покрытием смолы апд начальная установка смолы при фиксации винтов и / или электроды (рис 2а).
- Поместите голова фиксации планку 5 мм или более над поверхностью черепа и выровнять ее центр (2А) -Выберите.
- Применение акриловой смолы в зазор между основанием черепа и начальных монтажных смол. (Фиг.2А -Center). Подождите, пока смола становится трудно.
- Удалить уха-бар и тянуть формованной Mounter из фиксация бар порту. (Фиг.2А -Верно). Осторожно применять дополнительные акриловой смолы по краям рельсов литого монтажник, если необходимо.
- Промыть раневой поверхности кожи головы стерильным физиологическим раствором. Вводите антибиотик (энрофлоксацин, 5 мг / кг подкожно) и анальгезирующее (буторфанола тартрат, 2 мг / кг подкожно) сразу же после операции. Дом животное индивидуально в одном клетке.
3. приучая животных Head-фиксацию
Примечание: Этот шаг декнижники привыкания графики, основанные на эмпирически успешных оценок авторов. Для обзора процедуры привыкания для головы фиксации, см 11 работа Шварца 10 или Го.
- Дайте достаточный период восстановления (в неделю или более) животных. В День 1, Ручка животных часто в разделенных короткими сессиями.
- На следующий день (день 2), выставить животное к фиксации окружающей среды (BOX). Не вставляйте их головы Mounter в порт баре фиксации. Оставьте животных, чтобы привыкнуть к окружающей среде. Надежно захватите голову Mounter, используя руку за 1 до 2 сек и немедленно освободить его. Повторите короткий срок фиксации вручную, захватить несколько раз.
- На 3-й день, приучить животных к головной фиксации.
- Принесите животных от домашних клетках и урегулировать их в поле, направляющего головы в сторону порта в баре фиксации. Возьмите голову Mounter и вставьте его в порт баре фиксации.
- Привязать Mounter (животногоголова) к запорный крюк бара фиксации с использованием резинкой. Стенд в течение 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к стволу или хвост животного после фиксации, что приводит животное пищать и бороться увеличением напряжения животного. Когда животное продолжает изо всех сил более чем на 1 мин, отпустите его и попробуйте позже. От этого шага, животные показывают мочи и кала выведение когда подвергается возглавить фиксацию, но это постепенно уменьшается, как получает привыкания доходов. - Получить замок резинку и извлечь Mounter из порта. Положите животных обратно в клетку и дать кусок каши или подсолнечное семя в клетку в качестве награды. Следующее испытание начинается в 30 мин. Повторите 3.4.1 3.4.4 пять или более в день.
- На 4-й день до 7, подвергать животное к голове фиксации, как описано в протоколе 3.4. Постепенно увеличивают продолжительность головной фиксации (10 мин, 20 мин, 30 мин и 50 мин как привыкания протекает).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если животные не делатьт кормить награду пищи, это может быть признаком высокого уровня стресса. Не увеличивайте время фиксации. Если животные показывают повторяется изо всех сил поведение, приучить их в течение более длительного периода. - Проверьте вес тела животного в день. Рассмотрим неудачную привыкания, когда масса тела сокращается. Приступить к поведенческим задач с головным фиксации после успешного привыкания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Успешное приучение облегчает последующее поведенческое обучение (рис 3E и F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот метод фиксации головы применим как крыс и мышей. Всего восемь крысам двустороннего имплантации электродов в стимулировании медиальной переднего мозга расслоения. Для четырех из них, индивидуальные проволочные электроды вольфрама (Microdrives) дополнительно имплантируют в области передних конечностей M1 (фиг.2с). Для мышей (п = 2), четыре из нержавеющей стали проволочные электроды были имплантированы в лобных / затылочных областях коры. Во время операции, голова монтажники формуют для головы фиксации в крыс и мышей, как описано в разделе протокола 2. После восстановления после операции, они были подвержены ежедневных сеансов головного фиксации для любой привыкания или поведенческих задач. Формованные монтажники голова остался до конца эксперимента (40,5 ± 1,73 (среднее ± SD) дней для крыс и 81 ± 5,66 (среднее ± SD) дней для мышей после операции). Крысы подвергались воздействию ежедневно от 40 до 60 мин Глава фиксация во задачей поведения; мыши подвергались воздействию ежедневно 20 до 40 мин бытьповеде задачей.
Ранее мы использовали эту технику, чтобы обучать крыс толкать и тянуть рычаг под голову фиксации. Награда была прямой электрической стимуляции медиального переднего мозга расслоения. Хотя это вызывает поведение преувеличены двигательную, глава крепление надежно поддерживаться без случайного разделения MOUNTER.
После привыкания, стыковка головной Mounter в порту баре фиксации была завершена через несколько секунд, заблокировав резинку на крючок. Когда впервые в голову фиксации животных подарки борется поведения, таких как бег на месте, выправить свои ноги (рис 3А и В). Тем не менее, такое поведение уменьшилась с привыканием. Успешное приучение может быть подтверждено, что животные не проявляют более борется поведение во время глава фиксированной (3С и D).
Рисунок 1. Дизайн бара голова фиксации.
(А) Комплектующие имена баре глава фиксации. а) порт; б) блокировки крюк; в) фиксация бар тела; г) закрепление отверстия; е) поддержка стену; е) пластины крепления. Дизайн коробки фиксации изображен на вставке. Два отверстия в боковой стенке используются для размещения эргономически бар фиксации. (Б) Перспектива разработанной головной фиксации панели для крыс. Черные стрелки указывают на границу покрытия парафиновые фильмы. (C) Дизайн порт для головной фиксации у мышей. (Модифицированный из рис 1 Ро и др. 9) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Строительство MOUNTER литья во время операции.
(А) Критик аль этапа формования головки Mounter. (Слева) Винты (T формы в черный), должны быть имплантированы перпендикулярно черепа (серый) поверхности. Тонкий слой зубного цемента адгезивную смолу (зеленый) охватывает винты и поверхности черепа. (Центр) После имплантации в зависимости от экспериментальных целей, дополнительные акриловые смолы (оранжевые) заполнены в зазоре между начальной смолы, нанесенным на портовых и базовых смол поверхности черепа и становится частью головного монтажник. (Справа) после добавленные акриловые смолы трудно набор, глава монтажник может быть освобожден, сдвинув из порта. Твердые черные линии показывают парафиновые фильмы. (Модифицированный из рис 1 Ро и др. 9) (B), построенный глава монтажник у крыс готов для освобождения (после стадии A-центр). (CD) Литой акриловые смолы, служащие в качестве главного монтажник. После операции, все еще под наркозом, животные освобождаются от панели фиксации. Черные стрелки показывают соответствующие направляющие к форме порту. PS: //www.jove.com/files/ftp_upload/53064/53064fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Руководитель фиксированной крысы и мыши.
(АВ) Когда животные изначально подвергается возглавить фиксацию, они испускают изо всех сил поведения. (CD) Как привыкания доходов, животные показать меньше борющихся поведение и, как правило, садятся на пол стационарной платформы. (EF) Результат поведенческих выступления групп из успешного (E) и неудачная (F), привыкание глава фиксации окружающей среды (модифицированный из рис 3 Ро и др. 9). Количество Награда включает в себя как свободное (для целей формирования) и условное рычаг тянуть. В обеих сессиях, недостаточно приучены крыса показывает плохую работу с только вознаграждены случайного рычага тянет от не-условного поведения.= "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53064/53064fig3large.jpg" целевых = "_blank"> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dental acrylic resin | Lang Dental Manufacturing | Ortho-Jet | to make molded mounter |
| Paraffin film | Bemis | Parafilm | to prevent adhesion of acrylic resin to the bar |
| Dental adhesive | Sun Medical | Super-Bond C&B | to bond between acrylic resin and skull |
| Plexglass or other acrylic plate | to make fixation bar and box platform | ||
| Cyanoacrylate | to bond acrylic plates |
References
- Mayrhofer, J. M., et al. Novel two-alternative forced choice paradigm for bilateral vibrotactile whisker frequency discrimination in head-fixed mice and rats. J Neurophysiol. 109, 273-284 (2013).
- Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice. J Neurosci Methods. 178, 75-79 (2009).
- Ollerenshaw, D. R., et al. Detection of tactile inputs in the rat vibrissa pathway. J Neurophysiol. 108, 479-490 (2012).
- Lee, M. G., Manns, I. D., Alonso, A., Jones, B. E. Sleep-wake related discharge properties of basal forebrain neurons recorded with micropipettes in head-fixed rats. J Neurophysiol. 92, 1182-1198 (2004).
- Lutcke, H., et al. Optical recording of neuronal activity with a genetically-encoded calcium indicator in anesthetized and freely moving mice. Front Neural Circuits. 4, 9 (2010).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56, 43-57 (2007).
- Kimura, R., et al. Reinforcing operandum: rapid and reliable learning of skilled forelimb movements by head-fixed rodents. Journal of neurophysiology. 108, 1781-1792 (2012).
- Hadlock, T., Kowaleski, J., Mackinnon, S., Heaton, J. T. A novel method of head fixation for the study of rodent facial function. Experimental neurology. 205, 279-282 (2007).
- Roh, M., Jang, I. S., Lee, M. G. Push-in Head Restraining Apparatus for Intracranial Self Stimulation Tasks in Rats. Korean J Physiol Pharmacol. 18, 103-108 (2014).
- Schwarz, C., et al. The head-fixed behaving rat--procedures and pitfalls. Somatosensory & motor research. 27, 131-148 (2010).
- Guo, Z. V., et al. Procedures for Behavioral Experiments in Head-Fixed Mice. PLoS ONE. 9, (2014).
- Osborne, J. E., Dudman, J. T. RIVETS: a mechanical system for in vivo and in vitro electrophysiology and imaging. PLoS One. 9, e89007 (2014).
