Summary
Nous présentons un protocole expérimental pour former une bicouche lipidique supporté sur des substrats solides, sans utiliser des vésicules lipidiques. Nous démontrons un procédé en une étape pour former une bicouche lipidique de dioxyde de silicium et l'or ainsi que des membranes supportées par domaine enrichi en cholestérol pour diverses applications biologiques.
Abstract
Afin d'imiter les membranes cellulaires, la bicouche lipidique supportée (SLB) est une plate-forme qui permet attrayant dans l'investigation in vitro des processus liés à la membrane, tout en conférant à la biocompatibilité et la biofonctionnalité des substrats solides. L'adsorption spontanée et la rupture des vésicules de phospholipides est la méthode la plus couramment utilisée pour former SLBS. Toutefois, dans des conditions physiologiques, la fusion des vésicules (VF) est limitée à seulement un sous-ensemble de compositions lipidiques et des supports solides. Ici, nous décrivons un procédé général une étape appelée la méthode de formation assistée par solvant-lipide bicouche (SALB) afin de former SLBS qui ne nécessite pas de vésicules. Le procédé implique le dépôt SALB de molécules de lipides sur une surface solide en présence de solvants organiques miscibles à l'eau (par exemple l'isopropanol) et ultérieur solvant d'échange avec une solution tampon aqueuse de manière à déclencher la formation SLB. L'étape d'échange de solvant continu permet l'application de laProcédé selon une configuration d'écoulement à travers convenant à la formation de la bicouche de surveillance et modification ultérieure en utilisant une large gamme de biocapteurs de surface sensible. La méthode SALB peut être utilisé pour fabriquer SLBS sur un large éventail de surfaces hydrophiles solides, y compris ceux qui sont insolubles à la fusion des vésicules. En outre, il permet la fabrication de composés de SLBS compositions lipidiques qui ne peuvent être préparés en utilisant le procédé de fusion de vésicules. Ici, l'on compare les résultats obtenus avec les méthodes et la fusion des vésicules SALB classiques d'illustration sur deux surfaces hydrophiles, du dioxyde de silicium et d'or. Pour optimiser les conditions expérimentales pour la préparation de bicouches de bonne qualité préparés par le procédé SALB, l'effet de divers paramètres, notamment le type de solvant organique dans l'étape de dépôt, la vitesse d'échange de solvant, et la concentration en lipides est traité en même temps que des conseils de dépannage . Formation des membranes supportées contenant fractions élevés de cholestérol est aussi démonstré avec la méthode SALB, soulignant les capacités techniques de la technique SALB pour une large gamme de configurations de membranes.
Introduction
La bicouche lipidique sur support solide 1 (SLB) est une plate-forme polyvalente qui conserve les caractéristiques de base des membranes biologiques tels que l'épaisseur de la bicouche, diffusivité lipidique à deux dimensions, et la capacité d'accueillir des biomolécules associées à la membrane. En raison de la complexité des membranes cellulaires naturelles, cette plate-forme simple a été montré pour fonctionner comme une plate-forme efficace pour les études in vitro de processus liés à la membrane tels que la formation radeau 2, protéine de liaison 3, virus et contraignant particules virus-like 4,5 , et la signalisation cellulaire 6. Formé à proximité à un support solide, la plate-forme SLB est compatible avec une gamme de techniques de mesure en surface sensible comme totale microscopie de réflexion interne (FRBR), microbalance à cristal de dissipation de quartz (QCM-D), et la spectroscopie d'impédance.
Plusieurs méthodes ont été développées pour produire différents types de SLBS, y compris bulle d'aireffondrement 7 et dip-pen nanolithographie 8 pour les taches lipidiques submicroniques, spin-coating 9 pour les piles bicouches et de Langmuir-Blodgett (LB) 10 et la fusion des vésicules (VF) 11 pour l'ensemble de découpage, simples revêtements bicouches lipidiques. Procédé VF consiste en l'adsorption de petites vésicules unilamellaires à un support solide et la rupture spontanée subséquente et de fusion pour former une bicouche lipidique continue. Toutefois, dans des conditions physiologiques, vésicule rupture spontanée est principalement limitée à des matériaux à base de silicium tels que le dioxyde de silicium, le verre et le mica. En outre, les vésicules rupture ne se produit pas spontanément des vésicules lipidiques de compositions complexes, tels que ceux contenant des fractions ou élevés de cholestérol des lipides chargés négativement. Selon le système, vésicule rupture peut être provoquée par la couture en outre les conditions expérimentales telles que la température 12, pH de la solution 13, 14 et de la salinité, un choc osmotique 15 pression 16, ou l'ajout d'ions divalents tels que Ca2 + 17. Alternativement, l'AH peptide de membrane-actif peut être introduit dans le but de déstabiliser une couche de vésicules adsorbées, conduisant à des vésicules rupture et la formation de bicouche sur une gamme de surfaces 18-22.
En outre, la formation de bicouche réussie nécessite la préparation d'une population bien contrôlé de petites vésicules unilamellaires qui peut être fastidieuse et difficile à réaliser pour certaines compositions de membrane. Par conséquent, en dépit de sa grande efficacité dans le meilleur des cas (par exemple, après une vaste prétraitement de gel-dégel de vésicules 23), l'application générale de la fusion des vésicules est limité par la portée des substrats appropriés et des compositions membranaires.
Le procédé assisté par solvant-24-28 bicouche lipidique (SALB) est une technique de fabrication de rechange qui ne nécessite pas des vésicules lipidiques. Le procédé est basé sur le dépôt of molécules lipidiques sur une surface solide en présence d'un solvant organique miscible à l'eau suivi d'un échange progressive de ce solvant avec une solution aqueuse de tampon afin de déclencher la formation SLB. Au cours de l'étape de solvant échange, le mélange ternaire de lipides, de solvant organique et de l'eau subit une phase de série de transitions avec l'augmentation de la fraction d'eau, ce qui conduit à la formation de structures de phases lamellaires dans la solution en vrac et une SLB sur le substrat solide. Fait important, cette voie d'auto-assemblage contourne la nécessité d'une rupture des vésicules, qui est habituellement l'étape limitante pour la transformation de vésicules adsorbées dans un SLB. Le protocole est applicable à une grande variété de surfaces, y compris le dioxyde de silicium, l'oxyde d'aluminium, le chrome, l'indium oxyde d'étain, et l'or. Dans le présent document et dans la vidéo d'accompagnement, une comparaison de dépôt de lipides par la vésicule SALB et méthodes de fusion est présentée. En particulier, l'influence de paramètres expérimentaux, y compris la concentration de lipides, Vitesse d'écoulement, et le choix du solvant organique miscible à l'eau, sur la qualité de la double couche formée par le procédé SALB sont discutés. Caractérisation analytique des SLBS fabriqués est effectuée par le QCM-D, de microscopie par fluorescence, et la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) techniques. Suivi QCM-D est une technique de mesure de la masse de surface sensible qui, depuis le travail de pionnier réalisé par Keller et Kasemo 29, a été largement utilisé pour étudier quantitativement la formation de bicouche. La microscopie à fluorescence permet l'inspection de l'homogénéité de la membrane ainsi que la visualisation des domaines membranaires. La technique de FRAP est un outil standard pour déterminer la mobilité latérale de molécules lipidiques dans une SLB, qui est une propriété essentielle des membranes fluidiques.
La première partie de cette étude consiste à analyser QCM-D de la SALB et des procédés de fusion des vésicules appliqué à la formation de bicouche tenter de dioxyde de silicium et d'or. Dans la deuxième partie,la préparation et la caractérisation de membranes supportées contenant une gamme de concentrations de cholestérol avec le procédé SALB sont mises en évidence et les résultats sont comparés à ceux obtenus par la méthode de fusion de vésicules.
Protocol
1. Formation de prises en charge lipidique en deux couches sur un support solide hydrophile
- Préparer des solutions lipidique sous licence de 10 mg / ml de 1,2-dioleoyl- sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC) et 1 mg / ml de 1,2-dioleoyl- sn-glycéro-3-phosphoethanolamine- N - (lissamine rhodamine B sulfonyl) (Rh-PE) en dissolvant les poudres lipidiques respectifs (adéquatement pesé au préalable avec un bilan de masse analytique) dans une solution d'isopropanol.
- Diluer et mélanger les solutions d'achat d'actions à l'isopropanol afin de préparer le mélange lipidique souhaité à la concentration finale. Pour les expériences de microscopie par fluorescence et FRAP, 0,5% en poids de Rh-PE doit être inclus dans le mélange de lipides.
- Injecter le mélange de lipides dans de l'isopropanol dans le canal microfluidique jusqu'à ce qu'il soit rempli.
- Incuber le mélange de lipides sur la surface en verre pendant environ 10 min.
- Remplacer progressivement la solution lipidique avec une solution d'eau ou un tampon en utilisant une pompe péristaltique à un débit très faible(10 à 50 pi / min). En variante, remplacer le mélange lipidique par pipetage répété.
- Rincer le canal à fond avec le tampon en excès afin d'éliminer l'isopropanol résiduel.
2. Formation des membranes supportées enrichi en cholestérol
Remarque: La surface solide (SiO 2) prend en charge la fusion des vésicules, mais la composition de la membrane (taux élevé de cholestérol) inhibe la fusion des vésicules parce vésicules enrichies en cholestérol ont haute rigidité à la flexion 30.
- Préparer une solution de réserve contenant 10 mg / ml DOPC lipides, 10 mg / ml de cholestérol, et de 1 mg / ml Rh-PE en dissolvant d'abord les poudres respectives dans l'isopropanol.
- Répétez les étapes 1,2-1,6 en utilisant les solutions d'achat d'actions préparés à l'étape 2.1.
3. Membrane Fluidity Assay
- Immerger la lame de verre dans du dodécyl sulfate (SDS) solution de sodium (1%) pendant 10 min.
- Laver les lames avec de l'eau déminéralisée et rincer l'esprith éthanol.
- Séchez diapositives à l'aide d'un faible courant d'azote.
- Exposer les lames à un plasma d'oxygène pendant 30 secondes à la puissance maximale de radiofréquence dans la chambre à plasma d'oxygène.
- Retirez la pellicule protectrice du fond commerciale chambre microfluidique (figure 1A) en utilisant une pince à épiler et fixer la lame de verre sur le côté collant de la chambre (figure 1B).
- Assembler les connecteurs et tubes dans les positions d'entrée et de sortie de la chambre et les placer sur le canal microfluidique la platine du microscope (Figure 1C).
- Former une bicouche lipidique marqué par fluorescence supporté dans le canal microfluidique [répétition de l'étape 1 en utilisant la composition lipidique souhaité (par exemple, 0,5 mg / ml DOPC) comprenant 0,5% en poids de Rh-PE dans un solvant organique].
- Localisez le plan de bicouche avec une immersion dans l'huile objectif 60X (NA 1,49) afin de capturer des images.
- Prenez deux images pré-blanchiment, puis de photo-301; m de large tache circulaire avec un faisceau de 532 nm, 100 mW laser. Avant photoblanchiment, réchauffer le laser jusqu'à ce que son intensité est devenue stable. Immédiatement après photoblanchiment, capturer une série d'images toutes les 1 sec pendant 2 minutes afin de suivre la reprise de l'intensité de fluorescence à l'endroit blanchi.
4. Cholestérol Quantification Assay
- Exposer la puce de capteur à cristal de quartz revêtu de dioxyde de silicium à un plasma d'oxygène pendant 30 secondes à la puissance maximale de radiofréquence dans la chambre à plasma d'oxygène. Retirez la puce de la chambre et montez immédiatement la puce dans la chambre de mesure.
- Avant l'expérience, la première fréquence d'acquérir et de dissipation de la puce de capteur dans l'air afin d'assurer un montage correct.
- Pour l'instrument Q-Sense E1 ou E4 QCM-D commerciale, exécutez le logiciel Q-Soft et cliquez sur "Acquisition" et sélectionnez "Mesure de configuration".
- Dans la nouvelle fenêtre qui apparaît, cochez la 3, 5, 7, 9, 11 et 13 harmoniques et puis cliquez sur Find and Run afin de vérifier les spectres de résonance. Réglez la température à 24 ° C. Si une ou plusieurs fréquences de résonance ne sont pas d'accord avec les valeurs attendues, vérifiez la puce de montage et re-exécuter cette étape jusqu'à ce qu'un accord soit atteint.
- Démarrer la pompe péristaltique et le débit de solution tampon (Tris 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) dans la chambre de mesure à un débit de 100 ul / min.
- Dans le logiciel, cliquez sur "Acquisition" et sélectionnez "Redémarrer mesure" afin d'enregistrer les signaux de dissipation de la fréquence de résonance et de l'énergie. Répétez cette étape jusqu'à ce qu'une ligne de base stable pour la fréquence et de dissipation des changements. Remarque: Pour les étapes ci-après, il y aura des décalages de fréquence et de dissipation supplémentaires qui peuvent être enregistrés en fonction du temps.
- Injecter de l'isopropanol (sans lipides) pendant 10 min.
- Injecter le mélange de lipides DOPC / cholestérol aurapport molaire désiré avec une concentration totale en lipides de 0,5 mg / ml dans de l'isopropanol pendant 10 min.
- Injecter tampon pendant 20 min à un débit de 100 ul / min.
- Injecter une solution de 1 mM de méthyl-β-cyclodextrine (MβCD) préparé dans un tampon (débit 100 pl / min) jusqu'à ce que le signal de fréquence atteint une valeur stable.
- Mesurer les décalages de fréquence positifs relatifs qui est causée par l'étape de traitement MβCD et calculer la masse de cholestérol et DOPC lipides en convertissant les valeurs de Af cho et Af DOPC à des valeurs de masse à l'aide de l'équation Sauerbrey [Δm = - (C / N) × Af, où C = 17,7 ng / cm 2, n: harmonique].
- Calculer la fraction molaire de cholestérol dans le SLB, en prenant en compte les poids moléculaires des lipides DOPC (786,1 g / mol) et de cholestérol (386,6 g / mol).
Representative Results
Fabrication de bicouches lipidiques supportées sur des substrats hydrophiles.
Les méthodes de formation et VF SALB ont été tentées sur le dioxyde de silicium et d'or et les processus de formation ont été surveillées en temps réel par la technique de mesure QCM-D. L'instrument mesure QCM-D variations de la fréquence de résonance (f Δ) d'un cristal de quartz piézo-électrique oscillant à la masse adsorption sur la surface du cristal. En outre, l'instrument QCM-D mesure la dissipation de l'énergie d'oscillation dans le but de caractériser les propriétés viscoélastiques (rigidité et la douceur de la couche multiple). Expériences de fusion des vésicules ont été réalisées comme décrit précédemment 31. En bref, une ligne de base a été d'abord établi pour les signaux de fréquence et de dissipation dans une solution aqueuse tampon [Tris 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5; (Figure 2A et B)]. Ensuite, de petites vésicules lipidiques unilamellaires DOPC dans le même tampon étaientjected à t = 10 min (flèche 1) sur du dioxyde de silicium (figure 2A) et l'or (figure 2B). Pour la fusion des vésicules de dioxyde de silicium, en deux étapes cinétique d'adsorption ont été observées avec des changements dans la fréquence finale et la dissipation d'énergie de -26 (± 1) Hz et 0,3 (± 0,2) × 10 - 6, respectivement. Ces valeurs sont en accord avec la formation d'une bicouche lipidique supportée 29.
Comme le montre la figure 2B, l'addition de la solution de vésicules à la surface d'or conduit à une diminution simultanée et augmentation des signaux f et Δ D ô, respectivement, jusqu'à ce que leurs valeurs ont atteint -150 (± 10) Hz et (7,5 ± 2) × 10-6, respectivement. Ces valeurs correspondent à la formation d'une couche adsorbée de vésicules. Ainsi, comme prévu, une SLB n'a pas été formé sur l'or par l'intermédiaire de la méthode de fusion de vésicules.
QCAnalyse MD pour la formation de deux couches de dioxyde de silicium et de l'or par le procédé SALB est présentée en figure 2C et D. Le dioxyde de silicium, des changements f et Δ D ô finales de -25,6 (± 0,55) et 0,4 Hz (± 0,27) × 10-6, respectivement, ont été atteints et ces valeurs indiquent formation d'un SLB. Gammes similaires de Δ f et Δ D (Δ f Au: -27,3 ± 2,7 Hz, Δ D Au: 0,48 (± 0,26) × 10 - 6) ont été observés sur l'or. Ces résultats confirment que le procédé permet la formation d'SALB bicouches lipidiques supportées sur les surfaces qui empêchent la rupture des vésicules.
Effet du débit de solvant d'échange sur la qualité des bicouches lipidiques supportées.
Pour déterminer les conditions optimales pour la fabrication de haute qualité soutenus bicouches lipidiques viun procédé SALB, l'influence de la concentration en lipides, le taux d'échange de solvant et le choix du solvant organique ont été examinés.
La figure 3 montre la variation de la fréquence QCM-D au cours de la dernière étape du protocole SALB, comme effectués sur du dioxyde de silicium à deux taux différents d'écoulement (100 et 600 pl / min) et deux concentrations de lipides différents (0,125 et 0,5 mg / ml) .
Lorsque 0,5 mg / ml DOPC lipides a été utilisé (figure 3A), la formation de bicouche n'a pas été affectée par le taux d'écoulement et un changement Af finale d'environ -26 Hz a été obtenu à deux débits.
En revanche, lorsque la concentration de lipide inférieure a été utilisé, la quantité de lipide adsorbé après échange de solvant complète a été significativement affectée par le débit d'écoulement (figure 3B). A un débit moyen de 100 ul / min, la formation de bicouche était complète (environ -26 Af Hz). Cependant, à un débit de 6 fois plus élevée (600 ul / min), une bicouche complet n'a pas été formé (Af environ -17 Hz). Ces résultats fournissent un guide pour choisir les bonnes conditions expérimentales pour la formation de bicouches avec succès en utilisant le procédé SALB avec de l'isopropanol comme solvant organique de choix.
Caractérisation des bicouches lipidiques supportées formés à partir de différentes concentrations de lipides dans les différentes solutions d'alcool.
Concentration de lipide est un autre paramètre qui affecte la qualité de SLBS obtenu en utilisant le procédé SALB. La microscopie à fluorescence a révélé que, à 0,05 mg / ml concentration de lipide, seuls isolés, les structures lipidiques sous-microscopiques sont formées (figure 4A). Avec l'augmentation de la concentration en lipides utilisée dans la procédure SALB, l'intensité de fluorescence des structures lipidiques devient plus homogène. A 0,1 mg / ml concentration de lipide, il y avait des plaques lipidiques microscopiques, bien que les structures ne couvrent pas l'ensemble du f traversield de vue (figure 4B). Toutefois, lorsque 0,25 mg / concentration lipidique ml a été utilisée, une bicouche lipidique homogène a été formé (figure 4C). Par conséquent, il ya une concentration de lipides minimum requis pour former un système complet, SLB complet couvrant.
L'influence de la concentration de lipides sur le résultat final de ces expériences SALB a également été examinée sur une plus large plage de concentration de lipide (0,01 à 5 mg / ml) et dans différents solvants organiques (éthanol, isopropanol, n-propanol et). Le f de Δ et Δ D valeurs correspondant à l'étape finale de la procédure SALB sont présentés sur la figure 5.
Nous avons défini la formation de bicouche basé sur les derniers changements dans la fréquence et la dissipation d'énergie entre -25 et -30 Hz et moins de 0,5 x 10 -6, respectivement. Sur la base de ces critères, la gamme de concentration optimale de lipides pour former une bicouche lipidique supportée été déterminée comme étant comprise entre 0,1 et 0,5 mg/ ml en grande partie indépendant de la nature du solvant organique. Les écarts dans le f Δ acquise et Δ D déplace à l'extérieur de l'intervalle précité est due à la présence de la masse supplémentaire (par exemple, des piles de bicouche), l'apparition de morphologies non-bicouche (par exemple, des vésicules, des micelles de type ver), et la présence d'îles bicouches fragmentés avec la morphologie incomplète à travers le substrat.
Alors que la procédure de SALB obtenus bicouches lipidiques pris en charge est relativement solide, la concentration en lipides optimal pour la formation de deux couches de haute qualité peut exiger réglage en fonction de la configuration expérimentale spécifique. Fondamentalement, il est non seulement une concentration en lipide minimum mais aussi une concentration lipidique maximale requise pour la formation de bicouche optimale par le procédé SALB. La plage de concentration optimale dépend de la vitesse d'écoulement et peut être également être affectée par la composition du substrat et des lipides. Empiriquement, dans de nombreux cas, nous avons found qu'une concentration de lipide de 0,5 mg / ml et un débit de 100 ul d'écoulement / min est l'ensemble optimal de conditions de formation d'une bicouche lipidique supportée homogène. Toutefois, en fonction de la composition lipidique et le débit de cellules géométrie de celui-ci, ce qui affecte le profil d'écoulement au cours de l'optimisation de l'échange de solvant, en outre de la concentration en lipide peut être nécessaire. Ainsi, nous recommandons de réaliser des expériences pilote SALB utilisant un 0,5 mg / ml concentration lipidique et d'évaluer la qualité de bicouche en utilisant les techniques de microscopie QCM-D ou de fluorescence. Si les bicouches semblent incomplètes, alors la concentration lipidique devrait être augmentée en incréments de 10% jusqu'à ce que les résultats satisfaisants sont obtenus. Si la bicouche apparaît à coexister avec d'autres structures lipidiques, puis la concentration en lipides doit être réduite en incréments de 10% jusqu'à ce que des résultats satisfaisants sont obtenus.
Fabrication de prises en charge bicouches lipidiques avec différentes compositions lipidiques et dDIFFÉRENTES fractions de cholestérol.
Ensuite, les méthodes et SALB FV ont été employés pour former SLBS enrichi de cholestérol. La figure 6 montre des images de fluorescence représentatives (100 x 100 um) des membranes contenant du cholestérol supportés préparés par le procédé SALB. Les membranes sont constituées de domaines de colorant exclu de forme circulaire entourée par une phase continue, caractérisé par une luminosité uniforme fluorescent. Les domaines sombres ont augmenté avec l'augmentation de la superficie fraction de cholestérol dans le mélange précurseur lipidique. Ensuite, les mesures de FRAP ont été effectuées afin d'examiner la fluidité des films bicouches lipidiques. Les mesures de FRAP révélé récupération presque complète de la fluorescence dans la phase environnante, ce qui indique la mobilité latérale des lipides et donc la formation d'une seule bicouche lipidique. Depuis partitions Rh-PE préférentiellement dans la phase fluide, les domaines sombres sont probablement composés de structures enrichies en cholestérol denses. A titre de comparaison, la fabrication de bicouches DOPC / Chol selon la méthode VF a également été tentée. Avec l'augmentation de vésicules DOPC fractions de cholestérol (10 - 40% en moles) ont été préparés par le procédé d'extrusion des vésicules. Rh-PE lipides (0,5% en poids) a été utilisé comme marqueur fluorescent pour l'imagerie. La figure 7 montre des images de fluorescence représentatives (100 x 100 um) des structures créées lors de l'incubation des substrats en verre avec des vésicules contenant du cholestérol. FRAP analyse a montré la formation d'une bicouche lipidique des vésicules en utilisant fluidique qui contenaient 20% en moles ou moins Chol. Cependant, les échantillons préparés en utilisant des vésicules avec des fractions de cholestérol plus élevés ne présente pas la récupération, indiquant la présence de vésicules adsorbé mais non rompus.
La fraction de cholestérol qui a finalement été incorporés dans les bicouches lipidiques supportées a été quantifiée en fonction de la fraction de cholestérol qui a été inclus dans la lèvre de précurseurid mélange dans un solvant organique dans le procédé SALB ou dans les vésicules dans une solution aqueuse dans le procédé VF. En utilisant la technique QCM-D, la formation de bicouche a été contrôlée et ensuite MβCD a été ajouté afin d'extraire spécifiquement Chol des bicouches lipidiques 32 pris en charge. La perte de masse due à l'élimination du cholestérol conduit à une diminution de la valeur absolue du décalage de fréquence (| Δ f |) associée à la SLB. Les décalages de fréquence positifs relatifs causés par l'étape de traitement MβCD sont présentés dans la figure 8A. La fraction molaire de cholestérol a été calculé sur la base du décalage de fréquence, tel que présenté sur la figure 8B.
La fraction de cholestérol incorporé dans des bicouches lipidiques supportés préparés par le procédé SALB était presque linéairement proportionnelle à la teneur en cholestérol dans le mélange précurseur lipidique. Fait intéressant, la fraction de cholestérol dans les bicouches préparé par le procédé VF (vésicules contenant jusqu'à20 mol% Chol) était sensiblement inférieure à celle contenue dans les vésicules de précurseurs. En fait, la plus grande fraction de cholestérol obtenue par le procédé VF était seulement d'environ 10% en moles.
Observation de superstructure bande dans la région de co-existence β-deux phases de cholestérol-phospholipide supporté bicouches lipidiques.
SALB expériences ont en outre été effectuées en utilisant un mélange lipidique avec une fraction encore plus élevé de cholestérol. Quand un mélange 4: 6 de DOPC et le cholestérol a été utilisé, une démixtion progressive d'une phase liquide homogène en deux phases coexistantes visualisée sous la forme de domaines en forme de bandes claires-sombres sur une (à l'exclusion de colorant) de fond a été observée (Figure 9). Il est établi que Rh-PE est exclu de cholestérol-domaines riches en 33, et donc les domaines sombres prédominants qui apparaissaient comme arrière-plan sont des régions enrichies en cholestérol. La formation de la taille du micron domaines vives sur un fond sombre au salutfraction de cholestérol gh (> 50% en moles) est compatible avec la région β dans le diagramme de phase monocouche de phospholipides / cholestérol 34,35 mélanges. En outre, la formation de domaines de bande, qui découlent d'une tension de la ligne faible, suggère que le mélange est à proximité d'un point critique de miscibilité.
Figure 1. chambre microfluidique pour la formation SALB dans une configuration appropriée pour la microscopie à épifluorescence. (A) de la chambre microfluidique commercial, (B) la lamelle en verre fixée sur la face adhésive de la chambre, (C) de configuration complète sur un support de microscope avec des tubes connectés en les ports de la chambre entrée et de sortie, et (D) Pompe péristaltique utilisés pour contrôler le taux de conversion de solvant. Les lipides en solution dans l'isopropanol sont injectés dans la chamb de mesureer à l'aide de la pompe péristaltique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Analyse QCM-D de la fusion des vésicules et SALB expériences sur le dioxyde de silicium et d'or substrats. Fréquence QCM-D (Af, bleu) et la dissipation (AD, rouge) des réponses pour le troisième harmonique (n = 3) ont été enregistrés en tant que en fonction du temps pendant l'adsorption sur lipide (A et C) du dioxyde de silicium, (B et D) l'or. Les panneaux a et b présentent la méthode de fusion de vésicules. DOPC vésicules lipidiques ont été injectés à t = 10 min (flèche 1). Panneaux C et D correspondent au procédé de formation SALB. Les flèches indiquent l'injection de tampon (1), de l'isopropanol (2), mélange lipidique [0,5 mg / ml dans de l'isopropanol DOPC lipide; (3)] et chamoiséchange de ER (4). La courbe en pointillés dans la partie B correspond à une expérience témoin dans laquelle lipide n'a pas été injecté. Les valeurs finales de Af et AD pour chaque surface sont spécifiés. Les schémas montrent les structures assemblées proposées lipidiques comme déduite de la fréquence et de dissipation des changements définitifs. Adapté de la référence 24 et utilisé avec la permission de l'American Chemical Society. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Influence du taux de solvant-échange sur le processus de formation SALB. QCM-D décalages de fréquence (AF) correspondant à la dernière étape (voir la flèche sur la figure 2C 4) dans la méthode SALB ont été mesurés sur du dioxyde de silicium à deux taux de change différents, et 600 ul de 100 / min, u chanter (A) de 0,5 mg / ml et (B) 0,125 mg / ml dans de l'isopropanol DOPC lipide. Les valeurs finales AF sont également spécifiées, par rapport à la ligne de base mesure dans la solution tampon aqueuse. Adapté de la référence 24 et utilisé avec la permission de l'American Chemical Society. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Concentration seuil de lipides pour achever la formation de la microscopie à épifluorescence SALB de couches lipidiques sur du dioxyde de silicium préparé par SALB en utilisant (A) 0,05 mg / ml. (B) 0,1 mg / ml; et (C) 0,25 mg / ml concentration de lipide. Adapté de la référence 26 et utilisé avec la permission de l'American Chemical Society./files/ftp_upload/53073/53073fig4large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Influence de la concentration en lipide et un solvant organique sur soutenu formation bicouche lipidique par le procédé SALB. Les modifications finales dans QCM-D (A) la fréquence et (B) la dissipation d'énergie pour des expériences SALB à l'aide de différents solvants organiques, en fonction du lipide concentration. Les lignes vertes en pointillés correspondent à la fréquence et de dissipation des changements attendus pour une bicouche complète (-30 Hz <Af <-25 Hz et AD <1 x 10 -6). Adapté de la référence 26 et utilisé avec la permission de l'American Chemical Society. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette fifigure.
Figure 6. récupération de fluorescence après photoblanchiment analyse de bicouches lipidiques supportées avec des fractions de cholestérol préparés par le procédé SALB sur un substrat de verre variable. Des micrographies (AE) de fluorescence bicouches préparés en utilisant diverses fractions de cholestérol dans le mélange précurseur. Les images ont été enregistrées immédiatement (en haut) et 1 min (au centre) après photoblanchiment. La tache sombre au centre de l'image correspond à la région décolorées. Les barres d'échelle sont de 20 um. Histogrammes des domaines de colorants exclus individuelles au sein de chaque échantillon Surface sont également présentées (en bas). Adapté de la référence 36 et utilisé avec la permission de l'American Chemical Society. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7. Analyse de FRAP de bicouches supportés contenant du cholestérol préparés par le procédé de fusion de vésicules. Des micrographies (AD) de fluorescence des bicouches préparés en utilisant diverses fractions de cholestérol (de 40 à 10% en moles), dans les vésicules précurseurs. Les images ont été enregistrées immédiatement (en haut) et 1 min (en bas) après photoblanchiment. La tache sombre au centre de l'image correspond à la région décolorées. Les barres d'échelle sont de 20 um. Adapté de la référence 36 et utilisé avec la permission de l'American Chemical Society. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 8. Quantification de fraction de cholestérol dans des bicouches lipidiques supportées. (A) La fréquence QCM-D décalage positif lors de l'injection de 1 mM MβCD sur bicouches lipidiques supportées avec différents au fractions molaires de cholestérol dans le mélange de précurseur (entre 0 et 50% en moles). (B) pour cent en moles de cholestérol appauvri des bicouches préparés par la vésicule SALB et méthodes de fusion en fonction de la fraction de cholestérol dans les mélanges précurseurs ou des vésicules. Adapté de la référence 36 et utilisé avec la permission de l'American Chemical Society. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 9. Temps évolution dépend de la fluorescence microstructure dans une bicouche supportée de DOPC / Chol (4: 6 molaire containing 0,5% Rhodamine-PE) préparé par le procédé SALB. Une phase uniforme progressivement la phase se sépare en une région de coexistence liquide-liquide lors de l'échange complet du solvant. Adapté de la référence 37 et utilisé avec la permission de l'American Chemical Society. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Discussion
Dans ce travail, un protocole solvant d'échange est présenté dans laquelle les lipides dans de l'alcool (isopropanol, l'éthanol ou le n-propanol) sont incubées avec un support solide et ensuite l'alcool est progressivement remplacé par une solution tampon aqueuse de manière à conduire une série des transitions de phase finalement produire des bicouches lipidiques de phases lamellaires-24. Il est démontré que le procédé permet la fabrication de bicouches lipidiques supportées sur des surfaces telles que l'or, qui est insoluble à la vésicule procédé de fusion.
Une plage optimale de la concentration de lipides (de 0,1 à 0,5 mg / ml) a été déterminé pour la formation de bicouche complète dans des formats standards expérimentaux testés jusqu'à présent. A des concentrations inférieures à 0,1 lipidiques mg / ml, discrètes, des correctifs microscopiques de bicouches formé. D'autre part, à des concentrations supérieures à 0,1 mg / ml et inférieure à 0,5 mg / ml, une bicouche complet et uniforme est formée. A des concentrations de lipides au-dessus de cette plage, une bicouche fluide a été formé comme toujours vérified par analyse de FRAP, cependant, la microscopie par fluorescence révèle la présence de structures lipidiques supplémentaires au-dessus de la bicouche. Frappant de constater que la morphologie de ces structures lipidiques supplémentaires, comme déterminé par analyse QCM-D, dépendait de l'alcool qui a été utilisée lors de l'étape d'incubation. Dans le cas de l'éthanol, les variations Δ f et D ô relativement élevées ressemblent à la signature QCM-D pour obtenir une couche de la vésicule adsorbé. Lorsque l'isopropanol ou le n-propanol a été utilisé à la place, le Δ f est légèrement supérieure à la valeur attendue pour une bicouche (f Δ finale entre -30 à -40 Hz), tandis que le Δ D était sensiblement plus élevé. De telles réponses QCM-D seraient attendus pour de longues structures lipidiques (par exemple, des micelles en forme de vers en saillie vers l'extérieur à partir de) la surface de la membrane (comme visible par microscopie de fluorescence dans certains cas).
Le taux de change solvant est un autre paramètre important qui peut être critique, especially lorsque les concentrations de lipides inférieurs (par exemple, 0,1 mg / ml) sont utilisés. Rapid échange de solvant à faible concentration en lipides peut conduire à la formation de bicouches incomplets. Dans la chambre de mesure standard utilisée pour les mesures QCM-D dans le présent document (chambre de mesure Q-Sense E4), les taux de l'ordre de 100 pi / min de débit, sont appropriés pour la formation de bicouche complète hautement reproductible. Pour les cellules d'écoulement avec d'autres geometries et le volume, le débit optimal peut varier et doit être déterminée empiriquement sur la base des étapes proposées ici.
En plus de former des bicouches lipidiques supportées sur des surfaces qui sont insolubles à la fusion des vésicules, la SALB peut être utilisée pour contourner le besoin de vésicules lipidiques qui peuvent se rompre, ce qui ouvre la porte à la fabrication de membranes supportées par des compositions complexes. A titre d'exemple illustratif de composition, des mélanges de lipides avec une fraction élevé de cholestérol ont été examinés. Le cholestérol est une composante importante de mammalian Les membranes cellulaires, et peuvent approcher sa fraction de 45 à 50% en moles de la composition lipidique membranaire (par exemple, dans les globules rouges). Ainsi, même un modèle simple d'une bicouche lipidique qui représente une membrane cellulaire humaine devrait comprendre cholestérol.
Bien que la fusion des vésicules peut être utilisé pour fabriquer des bicouches lipidiques fluides ne contenant que 10 à 15% de cholestérol, le procédé SALB permet la formation de bicouches lipidiques fluides contenant des fractions élevées de cholestérol (jusqu'à 57% en moles, telle que quantifiée par des mesures QCM-D) 36. Toutefois, lorsque le taux de cholestérol a été encore élevée (jusqu'à 63% en moles), en forme de bande domaines ont été observés 37. Les domaines de co-existantes étaient liquide, rappellent ceux observés dans la région de β dans le diagramme de phase du cholestérol / phospholipides monocouche à l'interface air-eau.
Dans l'ensemble, la méthode SALB se révèle être une approche simple et efficace pour former des bicouches lipidiques supportées, notamment in cas au-delà du champ d'application de la méthode de vésicule fusion classique. Jusqu'à présent, la technique de microscopie par fluorescence et de QCM-D ont été principalement utilisées pour caractériser les bicouches lipidiques supportées formés par le procédé SALB. Pour l'avenir, un large éventail de mesures analytiques techniques de surface sensible, y compris la résonance plasmonique de surface (SPR) 38, la microscopie à force atomique (AFM) 39,40, Fourier-spectroscopie infrarouge à transformée 41, X-ray 42 et réflectivité de neutrons 43, peut être utilisés pour caractériser et étudier les configurations de bicouches simples et complexes à préparer par le procédé SALB plus loin. Ces capacités émergentes ouvrent la porte à un plus grand nombre de scientifiques qui peuvent explorer les membranes cellulaires artificiels en profitant d'un protocole expérimental simple et robuste.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le soutien de la National Research Foundation (NRF -NRFF2011-01 et NRF2015NRF-POC0001-19), le Conseil national de la recherche médicale (NMRC / CBRG / 0005/2012), et l'Université technologique de Nanyang à CNM
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QCM-D silicon dioxide-coated substrates | QSense AB, Sweden | ||
| QCM-D gold-coated substrates | QSense AB, Sweden | ||
| Q-Sense E4 module | QSense AB, Sweden | ||
| Plasma Cleaner, PDC-32G | Harrick Plasma, Ithaca, NY | PDC-001 (115V) | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE) | Avanti Polar Lipids | 810150P | |
| cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma | C4555 | |
| Isopropanol | Sigma | 673773 | |
| Ethanol | Sigma | 459844 | |
| n-propanol | Sigma | 279544 | |
| Sticky-Slide I 0.1 Luer | IBIDI | 81128 | |
| Male elbow 1/8” | Cole-Parmer | 30505-70 | |
| Silicon tubing 1.6 mm ID | IBIDI | 10842 | |
| Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm | IBIDI | 10812 | |
| Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump | Ismatec | ||
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 71725 |
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