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Bioengineering

Biomembrana Fabrication por la bicapa lipídica (SALB) Método-Solvente asistida

Published: December 1, 2015 doi: 10.3791/53073
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3
1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University, 2Centre for Biomimetic Sensor Science, Nanyang Technological University, 3School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

Summary

Se presenta un protocolo experimental para formar una bicapa lipídica apoyado sobre soportes sólidos sin usar vesículas lipídicas. Se demuestra un método de un solo paso para formar una bicapa lipídica en dióxido de silicio y oro, así como membranas soportadas con dominio enriquecida en colesterol para diversas aplicaciones biológicas.

Abstract

Con el fin de imitar las membranas celulares, la bicapa lipídica apoyado (SLB) es una plataforma atractiva que permite en la investigación in vitro de los procesos relacionados con la membrana, mientras que confiere biocompatibilidad y biofuncionalidad a sustratos sólidos. La adsorción espontánea y la ruptura de las vesículas de fosfolípidos es el método más comúnmente utilizado para formar SLBS. Sin embargo, bajo condiciones fisiológicas, la fusión de vesículas (VF) se limita a sólo un subconjunto de composiciones lipídicas y soportes sólidos. Aquí se describe un procedimiento general de un solo paso llamado el método de formación de disolvente con ayuda de bicapa lipídica (SALB) con el fin de formar SLBS que no requiere vesículas. El método SALB implica la deposición de moléculas de lípidos sobre una superficie sólida en presencia de disolventes orgánicos miscibles en agua (por ejemplo, isopropanol) y de intercambio de disolvente posterior con solución tampón acuosa con el fin de desencadenar la formación SLB. La etapa de intercambio de disolvente continuo permite la aplicación de lamétodo en una configuración de flujo pasante adecuada para la formación de monitoreo bicapa y subsiguientes alteraciones utilizando una amplia gama de biosensores sensibles a la superficie. El método SALB se puede utilizar para fabricar SLBS en una amplia gama de superficies sólidas hidrófilas, incluyendo aquellos que son intratables a la fusión de vesículas. Además, permite la fabricación de SLBS compuestas de composiciones lipídicas que no se pueden preparar utilizando el método de la fusión de vesículas. En este documento, se comparan los resultados obtenidos con los métodos de fusión de vesículas SALB y convencionales sobre dos superficies hidrófilas ilustrativos, dióxido de silicio y el oro. Para optimizar las condiciones experimentales para la preparación de bicapas de alta calidad preparadas a través del método SALB, el efecto de varios parámetros, incluyendo el tipo de disolvente orgánico en la etapa de deposición, la tasa de intercambio de disolvente, y la concentración de lípidos se discute junto con sugerencias para solucionar problemas . Formación de apoyo a las membranas que contienen altas fracciones de colesterol es también demoniostrado con el método SALB, destacando las capacidades técnicas de la técnica SALB para una amplia gama de configuraciones de membrana.

Introduction

El soporte sólido bicapa lipídica 1 (SLB) es una plataforma versátil que conserva las características básicas de las biomembranas tales como el espesor de bicapa, difusividad de los lípidos de dos dimensiones, y la capacidad de alojar biomoléculas asociadas a la membrana. Debido a la complejidad de las membranas celulares naturales, esta plataforma sencilla se ha demostrado que funcionan como una plataforma eficiente para los estudios in vitro de los procesos relacionados con la membrana como la formación de balsa 2, proteína de unión 3, virus y vinculante partícula de virus-like 4,5 y señalización celular 6. Formado en las proximidades de un soporte sólido, la plataforma SLB es compatible con una amplia gama de técnicas de mediciones sensibles de superficie tales como microscopía de reflexión interna total de (TIRF), microbalanza de cristal de cuarzo de disipación (QCM-D), y la espectroscopia de impedancia.

Varios métodos han sido desarrollados para producir diferentes tipos de SLBS, incluyendo burbuja de airecolapso 7 y dip-pen nanolitografía 8 para las manchas de lípidos de tamaño submicrónico, spin-coating 9 para pilas bicapa y Langmuir-Blodgett (LB) 10 y la fusión de vesículas (VF) 11 para-que abarca por completo, recubrimientos individuales bicapa lipídica. El método VF consiste en la adsorción de pequeñas vesículas unilamelares a un soporte sólido y ruptura espontánea posterior y la fusión para formar una bicapa lipídica continua. Sin embargo, bajo condiciones fisiológicas, la rotura espontánea de vesículas se limita principalmente a los materiales basados ​​en silicio, tales como dióxido de silicio, vidrio y mica. Además, la rotura de la vesícula no se produce de forma espontánea para vesículas de lípidos complejos de composiciones tales como los que contienen altas fracciones de colesterol o lípidos cargados negativamente. Dependiendo del sistema, la ruptura de la vesícula puede ser inducida por la adaptación aún más las condiciones experimentales tales como la temperatura 12, la solución de pH 13, 14 y la salinidad, choque osmótico 15 16, o la adición de iones divalentes tales como Ca 2 + 17. Alternativamente, el péptido AH-membrana activa se puede introducir con el fin de desestabilizar una capa de vesículas adsorbidos, lo que lleva a la ruptura de la vesícula y la formación de bicapa en una gama de superficies 18-22.

Por otra parte, la formación de bicapa exitosa requiere la preparación de una población bien controlada de pequeñas vesículas unilamelares que puede llevar mucho tiempo y difícil de lograr para ciertas composiciones de membrana. Por lo tanto, a pesar de su alta eficiencia en casos óptimos (por ejemplo, después de una extensa pretratamiento de congelación-descongelación de vesículas 23), la aplicación general de la fusión de vesículas está limitada por el alcance de sustratos adecuados y composiciones de membrana.

El método disolvente asistida bicapa lipídica (SALB) 24-28 de es una técnica de fabricación alternativa que no requiere vesículas lipídicas. El método se basa en la deposición of moléculas de lípidos sobre una superficie sólida en presencia de un disolvente orgánico miscible en agua, seguido por intercambio gradual de este disolvente con una solución tampón acuosa con el fin de desencadenar la formación SLB. Durante la etapa de intercambio de disolvente, la mezcla ternaria de lípidos, disolvente orgánico, y el agua se somete a una serie de transiciones de fase con el aumento de la fracción de agua, que conduce a la formación de estructuras de fase lamelar en la solución a granel y un SLB en el sustrato sólido. Es importante destacar que esta ruta auto-ensamblaje evita la necesidad de ruptura de la vesícula, que suele ser la etapa limitante para la transformación de vesículas adsorbidos en un SLB. El protocolo es aplicable a una amplia variedad de superficies, incluyendo dióxido de silicio, óxido de aluminio, cromo, óxido de indio y estaño, y oro. En este documento y en el vídeo que acompaña, se presenta una comparación de la deposición de lípidos por el SALB y métodos de fusión de vesículas. En particular, la concentración de lípidos de la influencia de los parámetros experimentales, incluyendo, Se discuten velocidad de flujo, y la elección de disolvente orgánico miscible agua, en la calidad de la bicapa formada por el método SALB. Caracterización analítica de los SLBS fabricadas se lleva a cabo por el QCM-D, microscopía de fluorescencia, y la recuperación después de fluorescencia photobleaching (FRAP) técnicas. Monitoreo QCM-D es una técnica de medición sensible a la masa de la superficie que, desde el trabajo pionero conducido por Keller y Kasemo 29, se ha utilizado ampliamente para investigar cuantitativamente formación de bicapa. Microscopía de fluorescencia permite la inspección de la homogeneidad de la membrana, así como la visualización de los dominios de membrana. La técnica FRAP es una herramienta estándar para determinar la movilidad lateral de moléculas de lípidos en un SLB, que es una propiedad esencial de las membranas de fluidos.

La primera parte de este estudio implica el análisis QCM-D de la SALB y métodos de fusión de vesículas aplicado para intentar formación de bicapa en dióxido de silicio y el oro. En la segunda parte,la preparación y caracterización de las membranas soportado que contiene un rango de concentraciones de colesterol con el método SALB se demuestran y los resultados se compararon con los obtenidos por el método de la fusión de vesículas.

Protocol

1. Formación de admitidos bicapa lipídica sobre un soporte sólido hidrófilo

  1. Preparar soluciones de lípidos del stock de 10 mg / ml de 1,2-sn -glicero dioleoyl--3-fosfocolina (DOPC) y 1 mg / ml de 1,2-sn -glicero dioleoyl--3-phosphoethanolamine- N - (lisamina rodamina B sulfonil) (Rh-PE) por disolución de los polvos respectivos lípidos (apropiadamente pesó de antemano con una balance de masa analítica) en una solución de isopropanol.
  2. Diluir y mezclar las soluciones madre en isopropanol a fin de preparar la mezcla de lípidos deseada a la concentración final. Para la microscopía de fluorescencia y FRAP experimentos, 0,5% en peso de Rh-PE debería incluirse en la mezcla de lípidos.
  3. Inyectar la mezcla de lípidos en isopropanol en el canal microfluídico hasta que se llena.
  4. Incubar la mezcla de lípidos en la superficie de vidrio durante aproximadamente 10 min.
  5. Poco a poco reemplazar la solución de lípidos con una solución de agua o tampón usando una bomba peristáltica a un caudal muy bajo(10-50 l / min). Alternativamente, reemplace la mezcla de lípidos mediante pipeteo repetido.
  6. Enjuague el canal a fondo con el exceso de tampón con el fin de eliminar el isopropanol residual.

2. La formación de membranas soportadas colesterol enriquecido

Nota: La superficie sólida (SiO2) apoya la fusión de vesículas, pero la composición de la membrana (colesterol alto) inhibe la fusión de vesículas porque vesículas de colesterol enriquecido han doblado alta rigidez 30.

  1. Preparar una solución madre que contiene 10 mg / ml de lípidos DOPC, 10 mg / ml de colesterol, y 1 mg / ml Rh-PE disolviendo primero los polvos respectivos en isopropanol.
  2. Repita los pasos 1,2 a 1,6 usando las soluciones madre preparadas en el paso 2.1.

3. Membrana Fluidez Ensayo

  1. Sumergir el portaobjetos de vidrio en solución de sodio dodecil sulfato (SDS) (1%) durante 10 min.
  2. Se lavan los portas bien con agua desionizada y enjuague ingenioh etanol.
  3. Blow-seca diapositivas utilizando una corriente suave de nitrógeno.
  4. Exponer los portaobjetos a plasma de oxígeno durante 30 segundos a la máxima potencia de radiofrecuencia en la cámara de plasma de oxígeno.
  5. Retire el revestimiento de película protectora del fondo comercial cámara de microfluidos (Figura 1A), utilizando una pinza y coloque la placa de vidrio sobre la cara adhesiva de la cámara (Figura 1B).
  6. Montar los conectores y tubos en las posiciones de entrada y de salida de la cámara y coloque el canal microfluídico en la platina del microscopio (Figura 1C).
  7. Formar una bicapa lipídica marcado fluorescentemente apoyado en el canal microfluídico [repita el paso 1 usando la composición lipídica deseado (por ejemplo, 0,5 mg / ml DOPC), incluyendo 0,5% en peso de Rh-PE en un disolvente orgánico].
  8. Localice el plano bicapa con un objetivo de inmersión en aceite de 60X (NA 1.49) con el fin de capturar imágenes.
  9. Tome dos imágenes antes de la lejía, a continuación, la foto-Bleach 301; m mancha circular de ancho, con un haz de láser 532 mW nm, 100. Antes de photobleaching, calentar el láser hasta que su intensidad se ha convertido estable. Inmediatamente después de photobleaching, capturar una serie de imágenes cada 1 s durante 2 min con el fin de seguir la recuperación de la intensidad de fluorescencia en el lugar blanqueada.

Ensayo Cuantificación 4. Colesterol

  1. Exponer el chip sensor revestido de cristal de cuarzo-dióxido de silicio a plasma de oxígeno durante 30 segundos a la máxima potencia de radiofrecuencia en la cámara de plasma de oxígeno. Retirar el chip de la cámara y de inmediato montar el chip en la cámara de medición.
  2. Antes de experimento, primero adquirir la frecuencia y la disipación del chip sensor en el aire con el fin de asegurar el montaje correcto.
    1. Para el instrumento Q-Sense E1 o E4 QCM-D comercial, ejecute el programa de software Q-Soft y haga clic en "Adquisición" y seleccione "Medición de configuración".
    2. En la nueva ventana que aparece, marque el 3, 5, 7, 9, 11 y 13 matices y luego haga clic en Buscar y Ejecutar el fin de comprobar los espectros de resonancia. Ajuste la temperatura a 24 DO. Si una o más frecuencias de resonancia no están de acuerdo con los valores esperados, revise el chip de montaje y vuelva a realizar este paso hasta que se alcance un acuerdo.
  3. Arrancar la bomba peristáltica y el flujo de solución tampón (Tris 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) en la cámara de medición a una velocidad de flujo de 100 l / min.
  4. En el programa de software, haga clic en "Adquisición" y seleccione "Medición Reiniciar" para registrar las señales de disipación de frecuencia de resonancia y la energía. Repita este paso hasta que se obtiene una línea de base estable para los desplazamientos de frecuencia y la disipación. Nota: Para ver los pasos de aquí en adelante, no habrá cambios de frecuencia y de disipación adicionales que se pueden grabar en función del tiempo.
  5. Inyectar isopropanol (sin lípido) durante 10 min.
  6. Se inyecta la mezcla de lípidos DOPC / colesterol en larelación molar deseada con una concentración lipídica total de 0,5 mg / ml en isopropanol durante 10 min.
  7. Inyectar tampón durante 20 min a un caudal de 100 l / min.
  8. Inyectar una solución de 1 mM metil-β-ciclodextrina (MβCD) preparado en tampón (caudal 100 l / min) hasta que la señal de frecuencia alcanza un valor estable.
  9. Medir los desplazamientos de frecuencia positivos relativos que es causada por la etapa de tratamiento MβCD y calcular la masa de colesterol y DOPC lípidos mediante la conversión de los valores? F cho y Df DOPC a los valores de masa mediante el uso de la ecuación de Sauerbrey [Delta M = - (C / N) x ? f, donde C = 17,7 ng / cm 2, n: sobretono].
  10. Calcular la fracción molar de colesterol en el SLB, teniendo en cuenta los pesos moleculares de los lípidos DOPC (786,1 g / mol) y colesterol (386,6 g / mol).

Representative Results

Fabricación de bicapas lipídicas soportadas sobre sustratos hidrófilos.

Los métodos de formación de FV y SALB se intentaron en dióxido de silicio y el oro y los procesos de formación fueron monitorizados en tiempo real por la técnica de medición QCM-D. El instrumento mide QCM-D cambios en la frecuencia de resonancia (Δ f) de un cristal de cuarzo piezoeléctrico oscilante sobre la masa de adsorción sobre la superficie del cristal. Además, el instrumento QCM-D mide la disipación de la energía de oscilación con el fin de caracterizar las propiedades viscoelásticas (rigidez y suavidad) de la adlayer. Experimentos de fusión de vesículas se realizaron como se ha descrito previamente 31. Brevemente, una línea de base se estableció por primera vez para las señales de frecuencia y disipación en solución tampón acuosa [Tris 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5; (Figura 2A y B)]. A continuación, vesículas unilamelares pequeñas de lípidos DOPC en el mismo tampón estaban enproyectada en t = 10 min (flecha 1) sobre dióxido de silicio (Figura 2A) y oro (Figura 2B). Para la fusión de vesículas en dióxido de silicio, cinética de adsorción de dos pasos se observaron con cambios finales en la frecuencia y la energía de disipación de -26 (± 1) Hz y 0,3 (± 0,2) x 10 - 6, respectivamente. Estos valores son consistentes con la formación de una bicapa lipídica apoyado 29.

Como se muestra en la Figura 2B, la adición de la solución de la vesícula a la superficie de oro condujo a una disminución simultánea y el aumento de las señales F y Δ D delta, respectivamente, hasta que sus valores alcanzados -150 (± 10) Hz y (7.5 ± 2) x 10 - 6, respectivamente. Estos valores corresponden a la formación de una capa de vesículas adsorbido. Por lo tanto, como se esperaba, un SLB no fue formada en el oro por el método de la fusión de vesículas.

QCAnálisis MD para la formación de bicapa en dióxido de silicio y el oro por el método de SALB se presenta en la Figura 2C y D. El dióxido de silicio, los cambios fy Δ D delta finales de -25,6 (± 0,55) Hz y 0,4 (± 0,27) x 10-6, respectivamente, fueron alcanzados y estos valores indican la formación de un SLB. Se observaron en el oro - rangos similares de Δ f y Δ D (6 0,48 (± 0,26) x 10 Δ f Au:: -27,3 ± 2,7 Hz, Δ D Au). Estos resultados apoyan que el método SALB permite la formación de bicapas lipídicas apoyados en superficies que impiden la ruptura de la vesícula.

Efecto de la velocidad de flujo de intercambio de disolvente sobre la calidad de bicapas lipídicas soportadas.

Para determinar las condiciones óptimas para la fabricación de alta calidad apoyados bicapas lipídicas viun método SALB, se examinó la influencia de la concentración de lípidos, de la velocidad de intercambio de disolvente y la elección de disolvente orgánico.

La Figura 3 muestra el cambio en la frecuencia de QCM-D durante la etapa final del protocolo SALB, tal como se realizó en dióxido de silicio a dos velocidades diferentes de flujo (100 y 600 l / min) y dos concentraciones de lípidos diferentes (0,125 y 0,5 mg / ml) .

Cuando se usó 0,5 mg / ml de lípidos DOPC (Figura 3A), formación de bicapa no fue afectada por la velocidad de flujo y un cambio final de? F de aproximadamente -26 Hz se obtuvo en ambos caudales.

Por el contrario, cuando se utilizó una concentración de lípidos inferior, la cantidad de lípido adsorbido después de intercambio de disolvente completa fue significativamente afectada por la velocidad de flujo (Figura 3B). A una tasa de flujo promedio de 100 l / min, formación de bicapa era completa (Df alrededor de -26 Hz). Sin embargo, a un caudal de 6 veces superior (600 l / min), una bicapa completa no se formó (Df alrededor de -17 Hz). Estos resultados proporcionan una guía para elegir las condiciones experimentales adecuadas para formación de bicapa con éxito utilizando el método SALB con isopropanol como disolvente orgánico de elección.

Caracterización de las bicapas lipídicas formadas a partir de diferentes soportados concentraciones de lípidos en diversas soluciones de alcohol.

La concentración lipídica es otro parámetro que afecta a la calidad de SLBS obtenido mediante el método SALB. Microscopía de fluorescencia reveló que, a 0,05 mg / ml la concentración de lípidos, sólo aislados, estructuras lipídicas sub-microscópicas se formaron (Figura 4A). Con el aumento de la concentración de lípidos usado en el procedimiento SALB, la intensidad de fluorescencia de las estructuras de lípidos se hizo más homogénea. A 0,1 mg / ml concentración de lípidos, había parches de lípidos microscópicas aunque las estructuras no se extienden a través de toda la field de vista (Figura 4B). Sin embargo, cuando se usó 0,25 mg / ml la concentración de lípidos, una bicapa lipídica homogénea se formó (Figura 4C). Por lo tanto, hay una concentración mínima de lípido requerido para formar un completo, con todas las que abarca SLB.

La influencia de la concentración de lípidos en el resultado final de los experimentos SALB También se examinó en un rango de concentración de lípido más amplia (0.01 a 5 mg / ml) y en diferentes disolventes orgánicos (isopropanol, etanol y n-propanol). Los valores Δ D correspondientes a la etapa final en el procedimiento de SALB f Δ y se presentan en la Figura 5.

Hemos definido formación de bicapa basado en cambios finales en frecuencia y la disipación de energía entre -25 y -30 Hz y menos de 0,5 x 10 -6, respectivamente. Basándose en estos criterios, la gama óptima concentración de lípidos para formar una bicapa lipídica apoyado se determinó que era entre 0,1 y 0,5 mg/ ml en gran medida independiente del tipo de disolvente orgánico. Las desviaciones en la Δ f adquirida y Δ D desplaza fuera del rango antes mencionado se debe a la presencia de masa adicional (por ejemplo, pilas de doble capa), la aparición de morfologías no bicapa (por ejemplo, vesículas, micelas similares a gusanos), y la presencia de islas bicapa fragmentados con morfología incompleta a través del sustrato.

Si bien el procedimiento SALB para obtenidos bicapas lipídicas soportadas es relativamente robusta, la concentración de lípidos óptima para la formación de bicapa de alta calidad puede requerir de sintonización dependiendo de la configuración experimental específica. Básicamente, no hay sólo una concentración de lípidos mínimo, pero también una concentración máxima de lípidos requerida para la formación de bicapa óptima a través del método SALB. El intervalo de concentración óptima depende de la velocidad de flujo y puede ser también verse afectada por la composición del sustrato y de los lípidos. Empíricamente, en muchos casos, tenemos found que una concentración de lípidos de 0,5 mg / ml y un caudal de 100 l / min es el conjunto óptimo de condiciones para la formación de una bicapa lipídica homogénea compatible. Sin embargo, dependiendo de la composición de lípidos y celda de flujo geometría-el último de los cuales afecta al perfil de flujo durante la optimización de intercambio de disolvente adicional de la concentración de lípidos podría ser necesario. Por lo tanto, se recomienda la realización de experimentos piloto SALB utilizando un / concentración de lípidos ml 0.5 mg y evaluar la calidad de dos capas usando las técnicas de microscopía QCM-D o de fluorescencia. Si las bicapas aparecen incompletos, entonces la concentración de lípidos se debe aumentar en incrementos del 10% hasta que se logren resultados satisfactorios. Si la bicapa parece coexistir con estructuras de lípidos adicionales, entonces la concentración de lípidos debe disminuirse en incrementos del 10% hasta que se logren resultados satisfactorios.

Fabricación de bicapas de lípidos compatibles con varias composiciones de lípidos y dfracciones de colesterol ifferent.

A continuación, se emplearon los métodos SALB y VF con el fin de formar SLBS enriquecida en colesterol. La Figura 6 muestra imágenes de fluorescencia representativas (100 × 100 M) de apoyo a las membranas que contienen colesterol preparadas por el método SALB. Las membranas consisten en dominios de tinte-excluido de forma circular rodeada por una fase continua caracterizadas por el brillo fluorescente uniforme. Los dominios oscuros aumentaron en la zona con el aumento de la fracción de colesterol en la mezcla de lípidos precursor. A continuación, FRAP mediciones se realizaron con el fin de examinar la fluidez de las películas bicapa lipídica. Las mediciones revelaron FRAP recuperación casi completa de fluorescencia en la fase circundante, lo que indica la movilidad lateral de los lípidos y por lo tanto la formación de una única bicapa lipídica. Puesto que las particiones Rh-PE preferentemente en la fase fluida, los dominios oscuros son más probable componen de estructuras de colesterol enriquecido densos. Para la comparación, también se intentó la fabricación de bicapas DOPC / Chol utilizando el método de la FV. DOPC vesículas con el aumento de fracciones de colesterol (10 - 40 mol%) se prepararon por el método de extrusión de vesículas. Rh-PE de lípidos (0,5% en peso) se utilizó como marcador fluorescente para la imagen. La figura 7 muestra imágenes de fluorescencia representativas (100 × 100 M) de estructuras creadas tras la incubación de los sustratos de vidrio con vesículas que contienen colesterol. FRAP análisis mostró la formación de una bicapa lipídica fluídico utilizando vesículas que contenían 20% en moles o menos Chol. Sin embargo, las muestras preparadas mediante el uso de vesículas con las fracciones más altas de colesterol no exhibió la recuperación, lo que indica la presencia de vesículas adsorbida pero no rotos.

La fracción de colesterol que se incorporó en última instancia en las bicapas lipídicas soportadas se cuantificó como una función de la fracción de colesterol que se había incluido en el labio precursorIdentificación mezcla en un disolvente orgánico en el método SALB o en las vesículas en solución acuosa en el método de la FV. Utilizando la técnica de QCM-D, formación de bicapa se controló y luego MβCD se añadió con el fin de extraer específicamente Chol de las bicapas lipídicas soportadas 32. La pérdida de masa debido a la eliminación del colesterol condujo a una disminución en el valor absoluto del cambio de frecuencia (| Δ f |) asociado con el SLB. Los desplazamientos de frecuencia positivos relativos causados ​​por la etapa de tratamiento MβCD se muestran en la Figura 8A. La fracción molar de colesterol se calcula en base al desplazamiento de frecuencia, tal como se presenta en la Figura 8B.

La fracción de colesterol incorporado en bicapas lipídicas soportado preparado por el método SALB era casi linealmente proporcional al contenido de colesterol en la mezcla de lípidos precursor. Curiosamente, la fracción de colesterol en bicapas preparado por el método VF (vesículas que contiene hasta20% en moles Chol) fue sustancialmente menor que la contenida en las vesículas precursoras. De hecho, la mayor fracción de colesterol obtenido por el método VF fue sólo alrededor de 10% en moles.

Observación de la superestructura de la raya en la región de coexistencia β-dos fases del colesterol-fosfolípido compatible bicapas lipídicas.

SALB experimentos se llevaron a cabo adicionalmente usando una mezcla de lípidos con una fracción aún más altos de colesterol. Cuando un 4: se utilizó mezcla 6 de DOPC y colesterol, una segregación progresiva de una fase líquida uniforme en dos fases coexistentes visualizado como dominios en forma de raya-brillantes sobre un fondo oscuro (tinte de exclusión) se observó (Figura 9). Se establece que Rh-PE está excluido de los dominios ricos en colesterol 33, y por lo tanto los dominios oscuros predominantes que aparecían como fondo son regiones de colesterol enriquecido. La formación de dominios brillantes de tamaño micrométrico en un fondo oscuro en hifracción de colesterol gh (> 50% en moles) es consistente con la región β en el diagrama de fases monocapa de colesterol / fosfolípidos mezclas 34,35. Por otra parte, la formación de los dominios de la raya, que surgen a partir de una débil tensión de la línea, sugiere que la mezcla está cerca de un punto crítico miscibilidad.

Figura 1
Figura 1. cámara de microfluidos para la formación SALB en una configuración adecuada para la microscopía de epifluorescencia. (A) cámara de microfluidos Comercial, (B) cubreobjetos de cristal atado en el lado adhesivo de la cámara, (C) instalación completa en un soporte de microscopio con un tubo conectado a los puertos de entrada y salida de la cámara, y (D) de la bomba peristáltica utilizan para controlar la velocidad de intercambio de disolvente. Los lípidos disueltos en isopropanol se inyectan en la medición chamber con la ayuda de la bomba peristáltica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Análisis de QCM-D de los experimentos de fusión de vesículas y SALB en sustratos de dióxido de silicio y oro. Frecuencia QCM-D (Df, azul) y la disipación (Dd, rojo) las respuestas para el tercer armónico (n = 3) se registraron como en función del tiempo durante la adsorción de lípidos en (A y C) de dióxido de silicio, (B y D) de oro. Paneles A y B presentan el método de la fusión de vesículas. Vesículas lipídicas DOPC se inyectaron en t = 10 min (flecha 1). Paneles c y d corresponden a el método de formación SALB. Las flechas indican la inyección de tampón (1), isopropanol (2), mezcla de lípidos [0,5 mg / ml de lípidos DOPC en isopropanol; (3)] ​​y pulaintercambio er (4). La curva de trazos en el panel B corresponde a un experimento de control en el que no se inyectó lípidos. Se especifican los valores finales de Df y Delta d para cada superficie. Los esquemas muestran las estructuras de lípidos reunidos propuestos como se infiere a partir de los cambios de frecuencia y de disipación de finales. Adaptado de referencia 24 y se utiliza con permiso de la American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. Influencia de la tasa de cambio de disolvente en el proceso de formación SALB. Desplazamientos de frecuencia QCM-D (Df) correspondiente a la etapa final (véase la flecha 4 en la Figura 2C) en el método SALB se midieron en dióxido de silicio en dos tipos de cambio diferentes, 100 y 600 l / min, u cantar (A) 0,5 mg / ml y (B) 0,125 mg / ml de lípidos DOPC en isopropanol. También se especifican Los valores finales Delta F, en comparación con la línea de base de medición en la solución tampón acuosa. Adaptado de referencia 24 y se utiliza con permiso de la American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Umbral of Lipid Concentración para la formación completa de microscopía de epifluorescencia SALB de capas lipídicas sobre dióxido de silicio preparado por SALB usando (A) 0,05 mg / ml.; (B) 0,1 mg / ml; y / ml concentración de lípidos (C) 0.25 mg. Adaptado de referencia 26 y se utiliza con permiso de la American Chemical Society./files/ftp_upload/53073/53073fig4large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. Influencia de la concentración de lípidos y disolvente orgánico en la formación de bicapa lipídica apoyado por el método SALB. Los últimos cambios en QCM-D (A) y frecuencia (B) de disipación de energía para los experimentos SALB utilizando diversos disolventes orgánicos, como una función de los lípidos concentración. Las líneas verdes discontinuas corresponden a los cambios de frecuencia y de disipación esperados para una bicapa completa (-30 Hz <Df <-25 Hz y Dd <1 x 10 -6). Adaptado de referencia 26 y se utiliza con permiso de la American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6. recuperación después de fluorescencia photobleaching análisis de bicapas lipídicas soportadas con diferentes fracciones de colesterol preparadas por el método SALB sobre un sustrato de vidrio. Micrografías (AE) de fluorescencia de bicapas prepararon utilizando diversas fracciones de colesterol en la mezcla precursora. Las imágenes fueron grabadas inmediatamente (arriba) y 1 min (mediana) después de photobleaching. La mancha oscura en el centro de la imagen corresponde a la región photobleached. Las barras de escala son 20 micras. También se presentan histogramas Superficie de dominios colorante excluidos individuales dentro de cada muestra (abajo). Adaptado de referencia 36 y se utiliza con permiso de la American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7
Figura 7. Análisis de bicapas soportadas FRAP que contienen colesterol preparadas por el método de la fusión de vesículas. Micrografías (AD) de fluorescencia de bicapas prepararon utilizando diversas fracciones de colesterol (10 a 40% en moles), en las vesículas precursoras. Las imágenes fueron grabadas inmediatamente (arriba) y 1 min (abajo) después de photobleaching. La mancha oscura en el centro de la imagen corresponde a la región photobleached. Las barras de escala son 20 micras. Adaptado de referencia 36 y se utiliza con permiso de la American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8
Figura 8. Quantification de la fracción de colesterol en las bicapas lipídicas soportadas. (A) El cambio positivo QCM-D de frecuencia después de la inyección de 1 mM MβCD en bicapas lipídicas soportadas con diferentes fracciones molares de colesterol en la mezcla precursora (entre 0 y 50% en moles). (B) por ciento en moles de colesterol empobrecido de las bicapas preparados por el SALB y métodos de fusión de la vesícula como una función de la fracción de colesterol en las mezclas precursoras o vesículas. Adaptado de referencia 36 y se utiliza con permiso de la American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9
Figura 9. Tiempo de evolución dependen de la microestructura de fluorescencia en una bicapa soportada de DOPC / Col (4: 6 molar contacaniza 0,5% Rodamina-PE) preparado por el método SALB. Una fase uniforme gradualmente fase se separa en una región coexistencia líquido-líquido en el intercambio completa del disolvente. Adaptado de referencia 37 y se utiliza con permiso de la American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

En este trabajo, un protocolo de intercambio de disolvente se presenta en el cual los lípidos en alcohol (isopropanol, etanol o n-propanol) se incuban con un soporte sólido y luego el alcohol se sustituye gradualmente con una solución tampón acuosa con el fin de conducir una serie de transiciones de fase con el tiempo producir bicapas lipídicas laminares de fase 24. Se muestra que el método permite la fabricación de bicapas lipídicas soportadas en superficies tales como oro, que es intratable con el método de la fusión de vesículas.

Un intervalo de concentración de lípidos óptima (0,1 - 0.5 mg / ml) se ha determinado para la formación de bicapa completa en formatos estándar experimentales ensayadas hasta el momento. A concentraciones de lípidos por debajo de 0,1 mg / ml, discretos parches, microscópicas de bicapas formado. Por otra parte, a concentraciones superiores a 0,1 mg / ml y menor que 0,5 mg / ml, se forma una bicapa completa y uniforme. A concentraciones de lípidos por encima de este rango, una bicapa fluida todavía estaba formada como verified por análisis FRAP, sin embargo, la microscopía de fluorescencia revela la presencia de estructuras de lípidos adicionales en la parte superior de la bicapa. Sorprendentemente, la morfología de estas estructuras de lípidos adicionales, tal como se determina por análisis de QCM-D, dependía del alcohol que se usó durante la etapa de incubación. En el caso del etanol, las relativamente altas turnos F y Δ D delta se asemejan a la firma QCM-D obtenido para una capa de vesículas adsorbido. Cuando se utilizó en lugar isopropanol o n-propanol, el Δ f fue ligeramente mayor que el valor esperado para una bicapa (Δ f final entre -30 a -40 Hz), mientras que el Δ D era apreciablemente mayor. Tales respuestas QCM-D se espera para las estructuras de lípidos prolongados (por ejemplo, micelas similares a gusanos) que sobresalen hacia fuera desde la superficie de la membrana (tan visibles por microscopía de fluorescencia en algunos casos).

La tasa de cambio de disolvente es otro parámetro importante que puede ser crítico, especially cuando se utilizan concentraciones de lípidos inferiores (por ejemplo, 0,1 mg / ml). Cambio rápido disolvente a baja concentración de lípidos puede conducir a la formación de bicapas incompletos. En la cámara de medida estándar utilizada para mediciones QCM-D en este trabajo (cámara de medición Q-Sense E4), las tasas de flujo de alrededor de 100 l / min, eran adecuados para la formación de bicapa completa altamente reproducible. Para las células de flujo con otras geometrías y el volumen, la velocidad de flujo óptima puede variar y debe ser determinada empíricamente basado en los pasos sugeridos en el presente documento.

Además de formar bicapas lipídicas soportadas en superficies que son intratables a la fusión de vesículas, la SALB se puede emplear para eludir la necesidad de vesículas lipídicas que puede romperse, abriendo así la puerta a la fabricación de membranas apoyadas con composiciones complejas. Como un ejemplo ilustrativo composición, se examinaron mezclas de lípidos con una alta fracción de colesterol. El colesterol es un componente importante de mammalian las membranas celulares, y su fracción de 45-50 pueden acercarse mol% de la composición lipídica de la membrana (por ejemplo, en los eritrocitos). Por lo tanto, incluso un modelo simple de una bicapa lipídica que representa una membrana de célula humana debe incluir colesterol.

Mientras que la fusión de vesículas podría ser utilizado para fabricar las bicapas lipídicas de fluidos que contienen sólo el 10-15% de colesterol, el método permite SALB formación de bicapas lipídicas de fluidos que contienen altas fracciones de colesterol (hasta 57% en moles, tal como se cuantifica por medio de mediciones QCM-D) 36. Sin embargo, cuando el nivel de colesterol se elevó aún más (hasta 63% en moles), se observaron los dominios de la raya con forma 37. Los dominios coexistentes eran líquidas, que recuerda a los observados en la región β en el diagrama de fases de la monocapa de colesterol / fosfolípidos en la interfase aire-agua.

En general, el método SALB se demuestra que es un enfoque simple y eficiente para formar bicapas lipídicas soportadas, especialmente in casos más allá del alcance del método de la fusión de vesículas convencionales. Hasta ahora, la técnica y la microscopía de fluorescencia QCM-D se utilizan principalmente para caracterizar las bicapas lipídicas apoyados formados por el método SALB. Mirando hacia adelante, una amplia gama de mediciones analíticas técnicas sensibles de superficie, incluyendo resonancia de plasmón superficial (SPR) 38, microscopía de fuerza atómica (AFM) 39,40, transformada de Fourier espectroscopia infrarroja 41, de rayos X 42 y la reflectividad de neutrones 43 puede, ser utilizado para caracterizar y estudiar configuraciones bicapa simples y complejas preparan por el método SALB. Estas capacidades emergentes abren la puerta a un mayor número de científicos que pueden explorar las membranas celulares artificiales mediante el aprovechamiento de un protocolo experimental sencillo y robusto.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer el apoyo de la Fundación Nacional de Investigación (NRF -NRFF2011-01 y NRF2015NRF-POC0001-19), el Consejo Nacional de Investigación Médica (NMRC / CBRG / 0005/2012), y la Universidad Tecnológica de Nanyang a NJC

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QCM-D silicon dioxide-coated substrates QSense AB,  Sweden
QCM-D gold-coated substrates QSense AB,  Sweden
Q-Sense E4 module QSense AB,  Sweden
Plasma Cleaner, PDC-32G Harrick Plasma, Ithaca, NY PDC-001 (115V) 
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids 850375P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE) Avanti Polar Lipids 810150P
cholesterol Avanti Polar Lipids 700000P
Methyl-β-cyclodextrin Sigma  C4555
Isopropanol Sigma  673773
Ethanol Sigma  459844
n-propanol Sigma  279544
Sticky-Slide I 0.1 Luer IBIDI 81128
Male elbow 1/8” Cole-Parmer 30505-70
Silicon tubing 1.6 mm ID IBIDI 10842
Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm IBIDI 10812
Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump Ismatec
Sodium dodecyl sulfate Sigma  71725

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References

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