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Bioengineering

Biomembrane Fabrication dal solvente assistita doppio strato lipidico (SALB) Metodo

doi: 10.3791/53073 Published: December 1, 2015

Summary

Presentiamo un protocollo sperimentale per formare un doppio strato lipidico supportato su substrati solidi senza utilizzare vescicole lipidiche. Si dimostra un metodo di uno stadio per formare un doppio strato lipidico di diossido di silicio e oro così come membrane supportate con dominio colesterolo arricchita per varie applicazioni biologiche.

Abstract

Al fine di simulare le membrane delle cellule, il doppio strato lipidico supportato (SLB) è una piattaforma interessante che permette nelle indagini vitro dei processi a membrana legati mentre conferendo biocompatibilità e biofunzionalità a substrati solidi. L'adsorbimento spontanea e la rottura di vescicole fosfolipidiche è il metodo più comunemente utilizzato per formare SLB. Tuttavia, in condizioni fisiologiche, la fusione delle vescicole (VF) è limitato ad un solo sottoinsieme di composizioni lipidiche e supporti solidi. Qui, si descrive una procedura generale a fase unica definito il metodo di formazione assistita solvente doppio strato lipidico (SALB) per formare SLB che non richiede vescicole. Il metodo SALB comporta la deposizione di molecole lipidiche su una superficie solida, in presenza di solventi organici miscibili con acqua (ad esempio, isopropanolo) e successiva solventi scambio con soluzione tampone acquosa al fine di innescare la formazione di SLB. La fase solvente scambio continuo consente l'applicazione dellaMetodo in una configurazione a flusso adatto per la formazione di monitoraggio doppio strato e successive modifiche utilizzando una vasta gamma di biosensori superficie sensibile. Il metodo può essere usato SALB per fabbricare SLB su un'ampia gamma di superfici solide idrofili, compresi quelli che sono intrattabili di fusione della vescicola. Inoltre, consente la fabbricazione di SLB composto da composizioni lipidiche, che non possono essere preparate con il metodo fusione delle vescicole. Qui, mettiamo a confronto i risultati ottenuti con i metodi di fusione delle vescicole SALB e convenzionali su due superfici idrofile illustrativo, biossido di silicio e oro. Per ottimizzare le condizioni sperimentali per la preparazione di bistrati alta qualità preparati tramite il metodo SALB, l'effetto di vari parametri, tra cui il tipo di solvente organico nella fase di deposizione, il tasso di cambio solvente e la concentrazione di lipidi è discusso con risoluzione dei problemi . La formazione di membrane supportate contenenti elevate frazioni di colesterolo è anche demonitrattato con il metodo SALB, evidenziando le capacità tecniche della tecnica SALB per una vasta gamma di configurazioni di membrana.

Introduction

Il solido supportato doppio strato lipidico 1 (SLB) è una piattaforma versatile che conserva le caratteristiche di base di biomembrane quali lo spessore doppio strato, bidimensionale diffusività lipidi, e la possibilità di ospitare biomolecole associate alla membrana. A causa della complessità delle membrane cellulari naturali, questa semplice piattaforma ha dimostrato di funzionare come una piattaforma efficiente per studi in vitro di processi a membrana correlati come la formazione zattera 2, proteina legante 3, virus e particelle simili a virus di legame 4,5 , e la segnalazione a 6 celle. Formata in prossimità di un supporto solido, la piattaforma SLB è compatibile con una serie di misure tecniche di superficie sensibile come la microscopia a riflessione interna totale (TIRF), cristallo di quarzo microbilancia-dissipazione (QCM-D), e spettroscopia di impedenza.

Diversi metodi sono stati sviluppati per la produzione di diversi tipi di SLB, compreso bolla d'ariacrollo 7 e dip-pen nanolitografia 8 per macchie di lipidi submicron dimensioni,-spin coating 9 per gli stack doppio strato e Langmuir-Blodgett (LB) 10 e la fusione delle vescicole (VF) 11 per full-spanning, rivestimenti singolo doppio strato lipidico. Il metodo consiste VF dell'adsorbimento di piccole vescicole unilamellari ad un supporto solido e la successiva rottura spontanea e fusione per formare un doppio strato lipidico continuo. Tuttavia, in condizioni fisiologiche, rottura delle vescicole spontanea è limitata principalmente ai materiali a base di silicio, quali biossido di silicio, vetro, e mica. Inoltre, la rottura delle vescicole non avviene spontaneamente per vescicole lipidiche di composizioni complesse come quelle contenenti alte frazioni di colesterolo o lipidi carichi negativamente. A seconda del sistema, la rottura delle vescicole può essere indotta da ulteriormente adattando le condizioni sperimentali quali temperatura 12, soluzione pH 13, e 14 salinità, shock osmotico 15 16, o l'aggiunta di ioni bivalenti come Ca2 + 17. In alternativa, la membrana attiva AH peptide può essere introdotto per destabilizzare uno strato di vescicole adsorbite, che porta alla rottura della vescicola e formazione bistrato su una serie di superfici 18-22.

Inoltre, la formazione di doppio strato di successo richiede la preparazione di una popolazione ben controllata di piccole vescicole unilamellari che può richiedere molto tempo e difficile da realizzare per certe composizioni membrana. Pertanto, nonostante la sua elevata efficienza in casi ottimali (ad esempio, dopo ampia congelamento-scongelamento pretrattamento di vescicole 23), l'applicazione generale fusione della vescicola è limitata dalla portata di substrati adatti e composizioni membrana.

Il metodo 24-28 assistita solvente doppio strato lipidico (SALB) è una tecnica di fabbricazione alternativa che non richiede vescicole lipidiche. Il metodo si basa sulla deposizione omolecole lipidiche f SU UN superficie solida, in presenza di un solvente organico miscibile acqua seguita da graduale scambio di questo solvente con una soluzione tampone acquoso al fine di innescare la formazione di SLB. Durante la fase solvente di cambio, la miscela ternaria di lipidi, solvente organico e acqua subisce una transizione di fase serie con crescente frazione acquosa, che porta alla formazione di strutture lamellari di fase nella soluzione di massa e una SLB sul substrato solido. È importante sottolineare che questo percorso autoassemblaggio bypassa la necessità per la rottura delle vescicole, che è di solito il fattore limitante per la trasformazione di vescicole adsorbite in un SLB. Il protocollo è applicabile ad un'ampia varietà di superfici e biossido di silicio, ossido di alluminio, cromo, ossido di indio-stagno, e oro. In questo documento e nel video allegato, un confronto tra la deposizione di lipidi dal SALB e metodi vescicole fusione è presentato. In particolare, l'influenza dei parametri sperimentali, compresa la concentrazione di lipidi, Portata, e la scelta del solvente organico miscibile in acqua, sulla qualità del doppio strato costituito dal metodo SALB sono discussi. Caratterizzazione analitica dei fabbricati SLB è eseguita dal QCM-D, microscopia a fluorescenza, e recupero di fluorescenza dopo photobleaching tecniche (FRAP). Monitoraggio QCM-D è una tecnica di misurazione massa superficiale-sensibile, che, dal momento che il lavoro pionieristico svolto da Keller e Kasemo 29, è stato ampiamente utilizzato per studiare quantitativamente formazione doppio strato. Microscopia a fluorescenza permette l'ispezione della membrana omogeneità e la visualizzazione dei domini di membrana. La tecnica FRAP è uno strumento standard per determinare la mobilità laterale di molecole lipidiche in una SLB, che è una proprietà essenziale delle membrane fluidici.

La prima parte di questo studio prevede l'analisi QCM-D del SALB e metodi di fusione delle vescicole applicata per tentare formazione doppio strato di diossido di silicio e oro. Nella seconda parte,preparazione e caratterizzazione di membrane supportate contenenti una gamma di concentrazioni di colesterolo con il metodo SALB sono dimostrati ei risultati sono confrontati con quelli ottenuti con il metodo di fusione delle vescicole.

Protocol

1. Formazione di Supportato doppio strato lipidico su un supporto solido idrofilo

  1. Preparare le soluzioni di lipidi azionari di 10 mg / ml di 1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-fosfocolina (DOPC) e 1 mg / ml di 1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine- N - (lissamina rodamina B sulfonile) (Rh-PE) sciogliendo rispettive polveri lipidi (opportunamente pesati preventivamente con bilancio di massa analitico) in soluzione isopropanolo.
  2. Diluire e mescolare le soluzioni madre in isopropanolo al fine di preparare la miscela lipidica desiderata alla concentrazione finale. Per microscopia a fluorescenza e FRAP esperimenti, 0,5 wt% Rh-PE dovrebbe essere incluso nella miscela lipidica.
  3. Iniettare la miscela lipidica in isopropanolo nel canale microfluidico fino a riempirlo.
  4. Incubare la miscela lipidico sulla superficie del vetro per circa 10 min.
  5. Gradualmente sostituire la soluzione lipidica con acqua o soluzione tampone con una pompa peristaltica ad una portata molto bassa(10-50 ml / min). In alternativa, sostituire la miscela lipidica pipettando ripetuta.
  6. Risciacquare il canale accuratamente con tampone in eccesso al fine di rimuovere l'isopropanolo residuo.

2. La formazione di membrane supportate colesterolo arricchita

Nota: La superficie solida (SiO 2) supporta la fusione delle vescicole, ma la composizione della membrana (colesterolo alto) inibisce la fusione delle vescicole perché vescicole colesterolo alto hanno arricchito la piegatura di rigidità 30.

  1. Preparare una soluzione madre contenente 10 mg / ml DOPC lipidi, 10 mg / ml di colesterolo, e 1 mg / ml Rh-PE dapprima sciogliendo le rispettive polveri in isopropanolo.
  2. Ripetere i passaggi 1,2-1,6 utilizzando le soluzioni madre previste al punto 2.1.

3. fluidità di membrana Assay

  1. Immergere il vetrino in una soluzione di sodio dodecil solfato (SDS) (1%) per 10 min.
  2. Lavare i vetrini con acqua deionizzata e risciacquare ingegnoh etanolo.
  3. Blow-secco diapositive utilizzando una leggera corrente di azoto.
  4. Esporre i vetrini a plasma di ossigeno per 30 sec alla massima potenza a radiofrequenza nella camera di plasma di ossigeno.
  5. Rimuovere lo strato protettivo del fondo commerciale camera di microfluidica (Figura 1A), utilizzando una pinzetta e fissare il vetrino sul lato adesivo della camera (Figura 1B).
  6. Assemblare i connettori e tubi nelle posizioni di ingresso e uscita della camera e posizionare il canale microfluidico sul palco microscopio (Figura 1C).
  7. Formare un doppio strato lipidico fluorescenza marcata supportato nel canale microfluidico [ripetere il passaggio 1 utilizzando la composizione lipidica desiderata (ad esempio, 0,5 mg / ml DOPC) compresa 0,5 wt% Rh-PE in solvente organico].
  8. Individuare il piano doppio strato con un obiettivo ad immersione 60X (NA 1.49) al fine di catturare le immagini.
  9. Prendete due immagini pre-candeggina, poi foto-candeggina 301; m di larghezza punto circolare con un raggio laser mW 532 nm, 100. Prima photobleaching, scaldare il laser fino a quando la sua intensità è diventato stabile. Subito dopo photobleaching, catturare una serie di immagini ogni 1 sec per 2 min per seguire la ripresa in intensità di fluorescenza nel punto sbiancato.

4. Colesterolo Quantificazione Assay

  1. Esporre il cristallo di quarzo chip del sensore biossido di silicio rivestito al plasma di ossigeno per 30 sec alla massima potenza a radiofrequenza nella camera di plasma di ossigeno. Rimuovere il chip dalla camera e immediatamente montare il chip nella camera di misura.
  2. Prima esperimento, prima acquisire la frequenza e la dissipazione del chip sensore in aria al fine di garantire un montaggio corretto.
    1. Per lo strumento Q-Sense E1 o E4 QCM-D commerciale, eseguire il software Q-Soft e fare clic su "Acquisizione" e selezionare "Setup di misura".
    2. Nella nuova finestra che appare, controlla il 3, 5, 7, 9, 11 e 13 toni e quindi scegliere Trova ed eseguire al fine di verificare gli spettri di risonanza. Impostare la temperatura a 24 ° C. Se una o più frequenze di risonanza non sono d'accordo con i valori attesi, controllare il chip di montaggio e ri-eseguire questo passaggio fino al raggiungimento di un accordo.
  3. Avviare la pompa peristaltica e portata della soluzione tampone (10 mM Tris, NaCl 150 mM, pH 7,5) nella camera di misura ad una portata di 100 l / min.
  4. Nel programma software, fare clic "Acquisizione" e selezionare "Restart di misura" al fine di registrare i segnali di dissipazione di frequenza di risonanza e di energia. Ripetere questa operazione fino ad ottenere una linea di base stabile per gli spostamenti di frequenza e di dissipazione. Nota: Per i passaggi di seguito, ci sarà di frequenza e dissipazione turni aggiuntivi che possono essere registrati in funzione del tempo.
  5. Iniettare isopropanolo (senza lipidi) per 10 minuti.
  6. Iniettare la miscela di DOPC lipidi / colesterolo alrapporto molare desiderato con una concentrazione di lipidi totale di 0,5 mg / ml in isopropanolo per 10 min.
  7. Iniettare buffer per 20 min ad una portata di 100 l / min.
  8. Iniettare una soluzione di 1-metil mM β-ciclodestrina (MβCD) preparato in tampone (portata 100 l / min) fino a quando il segnale di frequenza raggiunge un valore stabile.
  9. Misurare i relativi spostamenti di frequenza positivo che è causato dalla fase di trattamento MβCD e calcolare la massa dei lipidi e del colesterolo DOPC convertendo i valori Af cho e Af DOPC ai valori di massa utilizzando l'equazione di Sauerbrey [Δm = - (C / n) × Af, dove C = 17,7 ng / cm 2, n: armonico].
  10. Calcolare la frazione molare di colesterolo nel SLB, tenendo conto dei pesi molecolari di DOPC lipidi (786,1 g / mol) e colesterolo (386.6 g / mol).

Representative Results

Fabbricazione di doppi strati lipidici supportati su substrati idrofile.

I metodi di formazione VF e SALB sono state tentate in biossido di silicio e l'oro ed i processi di formazione sono stati monitorati in tempo reale con la tecnica di misurazione QCM-D. Le QCM-D strumento misura variazioni della frequenza di risonanza (Δ f) di un quarzo piezoelettrico oscillante su adsorbimento massa sulla superficie del cristallo. Inoltre, lo strumento QCM-D misura la dissipazione dell'energia di oscillazione per caratterizzare le proprietà viscoelastiche (rigidità e morbidezza) del adlayer. Esperimenti di fusione delle vescicole sono state eseguite come descritto in precedenza 31. Brevemente, una linea di base è stato stabilito prima per i segnali di frequenza e di dissipazione in soluzione tampone acquosa [Tris 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5; (Figura 2A e B)]. Successivamente, poche unilamellari DOPC vescicole lipidiche nello stesso tampone eranoproiettata a t = 10 min (freccia 1) sul biossido di silicio (Figura 2A) e oro (Figura 2B). Per fusione delle vescicole di diossido di silicio, in due fasi cinetica di adsorbimento sono stati osservati con modifiche finali in frequenza ed energia dissipata -26 (± 1) Hz e 0,3 (± 0,2) × 10 - 6, rispettivamente. Questi valori sono coerenti con la formazione di un doppio strato lipidico supportato 29.

Come mostrato in Figura 2B, l'aggiunta della soluzione vescicole alla superficie d'oro ha portato ad una riduzione simultanea e aumento segnali F e D Δ Í caratteristica rispettivamente, fino a che i valori raggiunti -150 (± 10) Hz e (7.5 ± 2) × 10 - 6, rispettivamente. Questi valori corrispondono alla formazione di uno strato di vescicole adsorbito. Così, come previsto, una SLB non era formata su oro tramite il metodo fusione delle vescicole.

QCAnalisi MD per la formazione doppio strato di diossido di silicio e oro con il metodo SALB è presentato in Figura 2C e D. Su biossido di silicio, finali Δ turni f Δ e D di -25,6 (± 0,55) e 0,4 Hz (± 0,27) × 10-6, rispettivamente, sono stati raggiunti e questi valori indicano la formazione di un SLB. Gamme simili di Δ f Δ e Df Au: -27,3 ± 2,7 Hz, Δ D Au: 0.48 (± 0.26) × 10 - 6) sono stati osservati su oro. Questi risultati confermano che il metodo consente SALB formazione di bistrati lipidici supportati su superfici che impediscono la rottura delle vescicole.

Effetto della portata solvente scambio sulla qualità di bistrati lipidici supportati.

Per determinare le condizioni ottimali per la fabbricazione di alta qualità supportati doppi strati lipidici viun metodo SALB, l'influenza della concentrazione di lipidi, solventi cambio e la scelta del solvente organico sono stati esaminati.

La Figura 3 mostra il cambiamento della frequenza QCM-D durante la fase finale del protocollo SALB, interpretato in biossido di silicio a due diverse portate (100 e 600 microlitri / min) e due diverse concentrazioni lipidiche (0,125 e 0,5 mg / ml) .

Quando è stato utilizzato 0,5 mg / ml DOPC lipidi (Figura 3A), la formazione di doppio strato non è stata influenzata dalla portata e uno spostamento Af finale di circa -26 Hz ottenuto a due portate.

Al contrario, quando è stata utilizzata una minore concentrazione di lipidi, la quantità di lipidi adsorbita dopo completa scambio solvente è stato significativamente influenzato dal flusso (Figura 3B). Ad un tasso medio del flusso di 100 ml / min, la formazione di doppio strato era completa (Af intorno -26 Hz). Tuttavia, con una portata di 6 volte superiore (600 microlitri / min), un doppio strato completo non è stato formato (Af circa -17 Hz). Questi risultati forniscono una guida per la scelta delle condizioni sperimentali giuste per formazione bistrato successo utilizzando il metodo SALB con isopropanolo come solvente organico di scelta.

Caratterizzazione di doppi strati lipidici supportati formati da diverse concentrazioni di lipidi in varie soluzioni alcoliche.

Concentrazione di lipidi è un altro parametro che influenza la qualità della SLB ottenuta utilizzando il metodo SALB. Microscopia a fluorescenza ha rivelato che, a 0,05 mg / ml concentrazione di lipidi, solo isolati, strutture lipidiche sub-microscopiche sono formate (figura 4A). Con l'aumento della concentrazione di lipidi usato nella procedura SALB, l'intensità di fluorescenza delle strutture lipidiche divenne più omogenea. A 0,1 mg / ml concentrazione di lipidi, c'erano macchie lipidiche microscopiche sebbene le strutture non estendersi su tutta la field di vista (Figura 4B). Tuttavia, quando si usava 0,25 mg / ml concentrazione di lipidi, un doppio strato lipidico omogeneo è stato formato (Figura 4C). Pertanto, vi è una concentrazione minima di lipidi necessaria per formare un completo, pieno estende SLB.

L'influenza della concentrazione di lipidi sul risultato finale degli esperimenti SALB stato anche esaminato su un'ampia gamma di concentrazione di lipidi (0.01 al 5 mg / ml) e in solventi organici diversi (isopropanolo, etanolo, n-propanolo e). I valori Δ D corrispondente alla fase finale del procedimento SALB f Δ e sono presentati nella Figura 5.

Abbiamo definito formazione bistrato basato su cambiamenti finali in frequenza ed energia dissipata tra -25 e -30 Hz e minore di 0,5 x 10 -6 rispettivamente. Sulla base di questi criteri, la gamma ottimale concentrazione di lipidi per formare un doppio strato lipidico supportato è stato determinato per essere tra 0,1 e 0,5 mg/ ml largamente indipendenti dal tipo di solvente organico. Le deviazioni nella Δ f acquisita e Δ D sposta al di fuori della gamma citata è dovuta alla presenza di massa aggiuntiva (ad esempio, pile doppio strato), la presenza di morfologie non doppio strato (ad esempio, vescicole, vermiformi micelle), e la presenza di isole frammentate doppio strato con morfologia incompleta sul substrato.

Mentre la procedura di SALB ottenuti bistrati lipidici supportati è relativamente robusto, la concentrazione di lipidi ottimale per la formazione doppio strato di alta qualità può richiedere sintonizzazione a seconda della configurazione sperimentale specifico. Fondamentalmente, non c'è solo una minima concentrazione di lipidi, ma anche una concentrazione massima di lipidi di formazione del doppio strato ottimale tramite il metodo SALB. L'intervallo di concentrazione ottimale dipende dalla portata e può essere anche essere influenzata dal substrato lipidico e composizione. Empiricamente, in molti casi, si ha found che una concentrazione di lipidi di 0,5 mg / ml e una portata di 100 ml / min è l'insieme ottimale di condizioni per la formazione di un doppio strato lipidico supportato omogenea. Tuttavia, a seconda della composizione dei lipidi e cella a flusso geometria quest'ultimo che colpisce il profilo di flusso durante l'ottimizzazione cambio ulteriormente solvente la concentrazione di lipidi potrebbe essere necessario. Pertanto, si consiglia di eseguire esperimenti pilota SALB utilizzando un 0,5 mg / ml concentrazione di lipidi e valutare la qualità doppio strato utilizzando le tecniche di microscopia QCM-D o fluorescenza. Se i bistrati appaiono incomplete, poi la concentrazione di lipidi deve essere aumentata con incrementi del 10% fino a ottenimento di risultati soddisfacenti. Se il doppio strato sembra coesistere con le strutture lipidiche supplementari, quindi la concentrazione di lipidi deve essere ridotta in incrementi del 10% fino a quando si ottengono risultati soddisfacenti.

Fabbricazione di doppi strati lipidici supportati con varie composizioni lipidiche e dfrazioni di colesterolo ifferent.

Successivamente, i metodi SALB e VF sono stati impiegati per formare SLB arricchite con colesterolo. La Figura 6 mostra immagini rappresentative di fluorescenza (100 × 100 micron) di membrane supportate colesterolo contenenti preparati con il metodo SALB. Le membrane sono costituite da domini colorante escluso forma circolare circondata da una fase continua caratterizzato da luminosità fluorescente uniforme. I domini scure aumentati in zona con crescente frazione di colesterolo nella miscela precursore lipidica. Successivamente, sono state effettuate misurazioni FRAP per esaminare la fluidità dei film doppio strato lipidico. Le misurazioni FRAP rivelato recupero di fluorescenza quasi completa nella fase circostante, indicando la mobilità laterale dei lipidi e quindi la formazione di un singolo doppio strato lipidico. Poiché partizioni Rh-PE preferenzialmente nella fase fluida, i domini scure sono probabilmente composte da strutture arricchite con colesterolo densi. Per confronto, la fabbricazione di bistrati DOPC / Chol utilizzando il metodo VF è anche tentato. DOPC vescicole con l'aumento frazioni di colesterolo (10-40 mol%) sono state preparate con il metodo delle vescicole di estrusione. Rh-PE lipidi (0,5% in peso) è stato utilizzato come etichetta fluorescente per l'imaging. La Figura 7 mostra immagini rappresentative di fluorescenza (100 × 100 micron) di strutture create sulla incubazione dei substrati di vetro con vescicole contenenti colesterolo. Analisi FRAP ha mostrato la formazione di un doppio strato lipidico fluidico con vescicole contenenti 20 moli% Chol o meno. Tuttavia, i campioni preparati utilizzando vescicole con le frazioni di colesterolo superiori non hanno mostrato recupero, indicando la presenza di adsorbito ma vescicole unruptured.

La frazione di colesterolo che è stato infine incorporato nei bistrati lipidici supportati è stato quantificato in funzione della frazione di colesterolo che era stato incluso nel labbro precursoremiscela id in solvente organico nel metodo SALB o nelle vescicole in soluzione acquosa nel metodo VF. Utilizzando la tecnica QCM-D, la formazione di doppio strato è stata monitorata e quindi MβCD stato aggiunto per estrarre specificamente Chol dai doppi strati lipidici supportati 32. La perdita di massa a causa della rimozione del colesterolo ha portato ad una diminuzione del valore assoluto dello spostamento di frequenza (| Δ f |) associato al SLB. Gli spostamenti relativi frequenza positivi dovuti alla fase di trattamento MβCD sono mostrati nella Figura 8A. La frazione molare del colesterolo è stata calcolata sulla base della variazione di frequenza, come illustrato nella figura 8B.

La frazione colesterolo incorporato in bistrati lipidici supportati preparati secondo il metodo SALB era quasi linearmente proporzionale al contenuto di colesterolo nella miscela precursore lipidica. È interessante notare che la frazione di colesterolo in bistrati preparato secondo il metodo VF (vescicole contenenti fino a20% in moli Chol) è stato sostanzialmente inferiore a quello contenuto nelle vescicole precursori. Infatti, la più alta frazione di colesterolo ottenuto con il metodo VF era solo circa il 10% in moli.

Osservazione di banda sovrastruttura regione coesistenza β-bifase di colesterolo-fosfolipide supportato bistrati lipidici.

SALB esperimenti sono stati ulteriormente eseguite utilizzando una miscela lipidica con una frazione ancora più elevato di colesterolo. Quando un 4: è stato usato 6 miscela di DOPC e colesterolo, un graduale demiscelazione di una fase liquida omogenea in due fasi coesistenti visualizzato come domini a forma di banda luminose su uno scuro (colorante esclusa) sfondo è stato osservato (Figura 9). È accertato che Rh-PE è escluso dai domini ricchi di colesterolo 33, e quindi le predominanti domini scuri che apparivano come sfondo sono regioni colesterolo arricchito. La formazione di domini luminosi micron di dimensioni su uno sfondo scuro in hifrazione del colesterolo gh (> 50% in moli) è coerente con la regione β nel diagramma di fase monostrato di colesterolo / fosfolipidi miscele 34,35. Inoltre, la formazione di domini a strisce, che derivano da una tensione linea debole, suggerisce che la miscela è vicino ad un punto critico miscibilità.

Figura 1
Figura 1. Camera Microfluidic per la formazione SALB in una configurazione adatta per epifluorescenza. (A) Camera microfluidica commerciale, (B) coprioggetto in vetro fissata sul lato adesivo della camera, (C) l'installazione completa su un supporto microscopio con tubo collegato in le luci di entrata e di uscita della camera, e (D) la pompa peristaltica usati per controllare il cambio solvente. I lipidi disciolti in isopropanolo sono iniettati nel chamb misuraER con l'ausilio della pompa peristaltica. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. QCM-D analisi degli esperimenti fusione della vescicola e SALB su substrati di biossido di silicio e oro. Frequenza QCM-D (Af, blu) e dissipazione (ΔD, rosso) risposte per la terza armonica (n = 3) sono stati registrati come in funzione del tempo durante l'assorbimento dei lipidi su (A e C) di biossido di silicio, (B e D) oro. Pannelli A e B presentano il metodo fusione delle vescicole. DOPC vescicole lipidiche sono state iniettate in t = 10 min (freccia 1). Pannelli ced corrispondono al metodo di formazione SALB. Le frecce indicano l'iniezione di tampone (1), isopropanolo (2), miscela lipidica [0,5 mg / ml DOPC lipidi in isopropanolo; (3)] ​​e appassionatoscambio er (4). La curva tratteggiata in pannello B corrisponde a un esperimento di controllo in cui non è stato iniettato lipidico. I valori finali di Af e ΔD per ogni superficie sono specificati. Gli schemi mostrano le strutture lipidiche assemblate proposte come si evince dalla frequenza e dissipazione turni finali. Adattato da riferimento 24 e utilizzato con il permesso della American Chemical Society. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. L'influenza del tasso di cambio solvente sul processo di formazione SALB. Frequenza turni QCM-D (Af) corrispondente alla fase finale (vedi freccia 4 nella Figura 2C) nel metodo SALB stati misurati su biossido di silicio a due diversi cambi, 100 e 600 microlitri / min, u sing (A) 0,5 mg / ml e (B) 0,125 mg / ml DOPC lipidi in isopropanolo. I valori finali Af sono anche specificati, rispetto alla baseline di misurazione in soluzione tampone acquosa. Adattato da riferimento 24 e utilizzato con il permesso della American Chemical Society. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Soglia of Lipid Concentrazione per Completa SALB Formazione epifluorescenza microscopia di strati lipidici di biossido di silicio preparato da SALB utilizzando (A) 0,05 mg / ml.; (B) 0,1 mg / ml; e (C) 0,25 mg / ml concentrazione di lipidi. Adattato da riferimento 26 e utilizzato con il permesso della American Chemical Society./files/ftp_upload/53073/53073fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. Influenza della concentrazione di lipidi e solvente organico sulla formazione bistrato lipidico supportato dal metodo SALB. Le modifiche finali in QCM-D (A) e frequenza (B) dissipazione di energia per esperimenti SALB utilizzando vari solventi organici, come funzione di lipidi concentrazione. Le linee verdi tratteggiate corrispondono agli spostamenti di frequenza e dissipazione attesi per un doppio strato completo (-30 Hz <Af <-25 Hz e ΔD <1 x 10 -6). Adattato da riferimento 26 e utilizzato con il permesso della American Chemical Society. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questo fifigura.

Figura 6
Figura 6. fluorescenza dopo photobleaching recupero analisi dei doppi strati lipidici supportati con differenti frazioni di colesterolo preparato secondo il metodo SALB su un substrato di vetro. (AE) fluorescenza micrografie bilayers preparati con varie frazioni del colesterolo nella miscela precursore. Le immagini sono state registrate immediatamente (in alto) e 1 minuto (al centro) dopo photobleaching. La macchia scura al centro dell'immagine corrisponde alla regione fotodecolorate. Le barre di scala sono 20 micron. Istogrammi di domini coloranti esclusa individuali all'interno di ciascun campione Superficie sono anche presentati (in basso). Adattato da riferimento 36 e utilizzato con il permesso della American Chemical Society. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7
Figura 7. Analisi FRAP di bistrati supportati colesterolo contenente preparate con il metodo di fusione delle vescicole. Micrografie (AD) di fluorescenza di doppi strati preparati con varie frazioni del colesterolo (10 a 40 mol%), nelle vescicole precursori. Le immagini sono state registrate immediatamente (in alto) e 1 minuto (in basso) dopo photobleaching. La macchia scura al centro dell'immagine corrisponde alla regione fotodecolorate. Le barre di scala sono 20 micron. Adattato da riferimento 36 e utilizzato con il permesso della American Chemical Society. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 8
Figura 8. Quantification della frazione colesterolo in doppi strati lipidici supportati. (A) Lo spostamento positivo QCM-D frequenza sull'iniezione di 1 mM MβCD sul bistrati lipidici supportati con diverse frazioni molari di colesterolo nella miscela precursore (fra 0 e 50% in moli). (B) Mole cento del colesterolo impoverito dalle bistrati preparati dal SALB e metodi vescicole fusione in funzione della frazione di colesterolo nelle miscele precursori o vescicole. Adattato da riferimento 36 e utilizzato con il permesso della American Chemical Society. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 9
Figura 9. Tempo evoluzione dipendente della fluorescenza microstruttura in un bistrato supportato di DOPC / Chol (4: 6 rapporto molare containing 0,5% Rodamina-PE) preparato secondo il metodo SALB. Una fase uniforme gradualmente fase separa in una regione di coesistenza liquido-liquido sulla sostituzione completa del solvente. Adattato da riferimento 37 e utilizzato con il permesso della American Chemical Society. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

In questo lavoro, un protocollo solvente cambio è presentato in cui lipidi in alcool (isopropanolo, etanolo, o n-propanolo) vengono incubati con un supporto solido e quindi l'alcool viene sostituito gradualmente, con una soluzione tampone acquosa al fine di guidare una serie delle transizioni di fase alla fine la produzione di lamellare trifase doppi strati lipidici 24. E 'dimostrato che il metodo consente la produzione di bistrati lipidici supportati su superfici quali oro, che è intrattabile al metodo fusione delle vescicole.

Un intervallo di concentrazione lipidica ottimale (0,1 - 0,5 mg / ml) è stato determinato per la formazione completa in doppio strato formati sperimentali serie testati finora. A concentrazioni di lipidi di sotto di 0,1 mg / ml, discreti, macchie microscopiche di doppi strati formata. D'altra parte, a concentrazioni superiori a 0,1 mg / ml e inferiore a 0,5 mg / ml, un doppio strato completo ed uniforme è formato. A concentrazioni lipidiche sopra di questo range, un doppio strato liquido era ancora formato come verificato mediante analisi FRAP, tuttavia, microscopia a fluorescenza rivela la presenza di strutture lipidiche aggiuntivi superiore del doppio strato. Sorprendentemente, la morfologia di queste strutture lipidiche supplementari, come determinato mediante analisi QCM-D, dipendeva l'alcool che è stato utilizzato durante la fase di incubazione. Nel caso dell'etanolo, relativamente elevate Δ turni F e D Δ assomigliano alla firma QCM-D ottenuto per uno strato vescicole adsorbito. Quando è stato invece utilizzato isopropanolo o n-propanolo, il Δ f era leggermente superiore al valore previsto per un doppio strato (finale Δ f tra -30 a -40 Hz), mentre il Δ D era sensibilmente superiore. Tali risposte QCM-D sono attese per strutture lipidiche estesi (ad esempio, micelle vermiformi) sporgenti verso l'esterno dalla superficie della membrana (come visibile al microscopio a fluorescenza in alcuni casi).

Il tasso di cambio solvente è un altro parametro importante, che può essere critico, especbuona resa quando si utilizzano concentrazioni di lipidi inferiore (ad esempio, 0,1 mg / ml). Rapido scambio solvente bassa concentrazione di lipidi può portare alla formazione di doppi strati incompleti. Nella camera di misura standard utilizzato per le misure QCM-D in questo documento (Q-Sense E4 camera di misura), portata di circa 100 ml / min, sono adatti per la formazione di doppio strato altamente riproducibile completa. Per celle di flusso con altre geometrie e di volume, la portata ottimale può variare e deve essere determinato empiricamente sulla base dei passi suggeriti qui.

Oltre a formare bistrati lipidici supportati su superfici intrattabile a fusione della vescicola, il SALB può essere impiegato per aggirare la necessità di vescicole lipidiche che possono rompersi, aprendo così la porta alla fabbricazione di membrane supportate con composizioni complesse. Come esempio illustrativo composizione, sono stati esaminati miscele lipidiche con un'elevata frazione di colesterolo. Il colesterolo è una componente importante di mammalian membrane cellulari, e la sua frazione possono avvicinarsi 45-50 moli% della composizione dei lipidi di membrana (ad esempio, negli eritrociti). Così, anche un semplice modello di un doppio strato lipidico che rappresenta una membrana cellulare umana dovrebbe includere colesterolo.

Mentre vescicole fusione potrebbe essere usato per fabbricare bistrati lipidici fluidici contenenti solo il 10-15% di colesterolo, il metodo consente SALB formazione di bistrati lipidici fluidici contenenti elevate frazioni di colesterolo (fino a 57% in moli, come quantificato mediante misure QCM-D) 36. Tuttavia, quando il livello di colesterolo è ulteriormente elevata (fino a 63% in moli), domini striati figura 37 sono stati osservati. I domini coesistenti erano liquido, ricordano quelli osservati nella regione β nel diagramma di fase del colesterolo / fosfolipidi monostrato all'interfaccia aria-acqua.

In generale, il metodo SALB è dimostrato di essere un metodo semplice ed efficace per formare bistrati lipidici supportati, in particolare in casi al di là del campo di applicazione del metodo di fusione delle vescicole convenzionale. Finora, la tecnica e la microscopia a fluorescenza QCM-D sono stati utilizzati principalmente per caratterizzare i doppi strati lipidici supportati formati con il metodo SALB. Guardando al futuro, una vasta gamma di misure analitiche tecniche di superficie sensibile, tra cui risonanza plasmonica di superficie (SPR) 38, microscopia a forza atomica (AFM) 39,40, trasformata di Fourier spettroscopia infrarossa 41, a raggi X 42 e neutroni riflettività 43 può, essere utilizzato per caratterizzare ulteriormente e studiare configurazioni semplici e complesse doppio strato preparano con il metodo SALB. Queste capacità emergenti aprono la porta ad un maggior numero di scienziati che possono esplorare le membrane cellulari artificiali, approfittando di un protocollo sperimentale semplice e robusto.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare il sostegno della Fondazione Nazionale delle Ricerche (NRF -NRFF2011-01 e NRF2015NRF-POC0001-19), il Consiglio Nazionale delle Ricerche Medical (NMRC / CBRG / 0005/2012), e Nanyang Technological University di NJC

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QCM-D silicon dioxide-coated substrates QSense AB,  Sweden
QCM-D gold-coated substrates QSense AB,  Sweden
Q-Sense E4 module QSense AB,  Sweden
Plasma Cleaner, PDC-32G Harrick Plasma, Ithaca, NY PDC-001 (115V) 
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids 850375P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE) Avanti Polar Lipids 810150P
cholesterol Avanti Polar Lipids 700000P
Methyl-β-cyclodextrin Sigma  C4555
Isopropanol Sigma  673773
Ethanol Sigma  459844
n-propanol Sigma  279544
Sticky-Slide I 0.1 Luer IBIDI 81128
Male elbow 1/8” Cole-Parmer 30505-70
Silicon tubing 1.6 mm ID IBIDI 10842
Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm IBIDI 10812
Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump Ismatec
Sodium dodecyl sulfate Sigma  71725

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Biomembrane Fabrication dal solvente assistita doppio strato lipidico (SALB) Metodo
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Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Kim, M., Yorulmaz, S., Vafaei, S., Cho, N. J. Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method. J. Vis. Exp. (106), e53073, doi:10.3791/53073 (2015).More

Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Kim, M., Yorulmaz, S., Vafaei, S., Cho, N. J. Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method. J. Vis. Exp. (106), e53073, doi:10.3791/53073 (2015).

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