Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Biomembranen Fabrication av Løsemiddel assistert lipidbilag (SalB) Metode

doi: 10.3791/53073 Published: December 1, 2015

Summary

Vi presenterer en forsøksprotokoll for å danne en understøttet lipidbilag på faste underlag uten bruk av lipidvesikler. Vi viser en en-trinns metode for å danne en lipid bilag på silisiumdioksyd og gull samt støttede membraner med kolesterol-anriket domene for forskjellige biologiske anvendelser.

Abstract

For å etterligne cellemembraner, er det ytterste lipid bilaget (SLB) understøttet en attraktiv plattform som muliggjør in vitro undersøkelse av membranrelaterte prosesser samtidig givende biokompatibilitet og biofunctionality til faste substrater. Den spontane adsorpsjon og brudd av fosfolipidvesikler er den mest brukte fremgangsmåten for å danne SLBs. Imidlertid, under fysiologiske betingelser, er vesikkel fusjon (VF) er begrenset til bare et delsett av lipid-blandinger og faste bærere. Her beskriver vi en en-trinns generelle fremgangsmåten som kalles oppløsningsmiddel-assistert lipid bilaget (SalB) dannelse metode for å danne SLBs som ikke krever vesikler. Den SalB Fremgangsmåten omfatter avsetning av lipidmolekyler på en fast overflate i nærvær av med vann blandbare organiske oppløsningsmidler (for eksempel isopropanol), og etterfølgende oppløsningsmiddel-utveksling med vandig bufferoppløsning for å utløse SLB formasjonen. Den kontinuerlige oppløsningsmiddel lingstrinnet muliggjør anvendelse avFremgangsmåten i en gjennomstrømnings-konfigurasjonen er egnet for overvåking av bilagsdannelse og etterfølgende endringer ved hjelp av en lang rekke overflatefølsomme biosensorer. Den SalB Fremgangsmåten kan anvendes til å fremstille SLBs på en lang rekke hydrofile faste overflater, inkludert de som er uløselige i vesikkel-fusjon. I tillegg gjør det fabrikasjon av SLBs sammensatt av lipid-blandinger som ikke kan fremstilles ved hjelp av vesikkel-fusjonsmetoden. Heri vi sammenligner resultatene oppnådd med konvensjonelle SalB og vesikkel-fusjonsmetoder på to illustrerende hydrofile overflater, silisiumdioksid og gull. For å optimalisere de forsøksbetingelser for fremstilling av høykvalitets bilag fremstilt via SalB fremgangsmåte blir effekten av forskjellige parametere, inkludert typen av organisk løsningsmiddel i avsetningstrinnet, frekvensen av løsningsmidlet veksling og lipidkonsentrasjonen diskutert sammen med tips feilsøkings . Dannelse av støttede membraner som inneholder store fraksjoner av kolesterol er også demonertrated med SalB metode, fremhever de tekniske egenskapene til SalB teknikk for et bredt spekter av membran konfigurasjoner.

Introduction

Det faste støttede lipid bilag 1 (SLB) er en allsidig plattform som bevarer de grunnleggende egenskapene til biomembraner slik som to-lags tykkelse, todimensjonal lipid diffusivitet, og evnen til å være vert for membran-assosiert biomolekyler. På grunn av kompleksiteten av naturlige cellemembraner, har denne enkle plattformen vist seg å fungere som en effektiv plattform for in vitro studier av membran-relaterte prosesser som flåten formasjon 2, proteinbindings 3, virus og viruslignende partikkel-binding 4,5 og cellesignale 6. Dannet i umiddelbar nærhet til en fast bærer, er det SLB plattformen forenlig med en rekke overflatefølsomme målinger teknikker som total indre refleksjon mikroskopi (TIRF), kvartskrystall mikrovekt-spredning (QCM-D), og impedans-spektroskopi.

Flere metoder har blitt utviklet for å fremstille forskjellige typer av SLBs, inkludert luftboblekollaps 7 og dip-penn nanolithography 8 for submikrone store lipid flekker, spin-belegg 9 for bilags stabler og Langmuir-Blodgett (LB) 10 og vesikkelfusjon (VF) 11 for full spenner, enkelt lipidbllag belegg. VF Metoden består av adsorpsjon av små unilamellære vesikler til en fast bærer og påfølgende spontan brudd og sammensmelting for å danne et kontinuerlig lipid bilaget. Imidlertid, under fysiologiske betingelser, spontan vesikkel brudd hovedsakelig er begrenset til silisiumbaserte materialer slik som silisiumdioksyd, glass og glimmer. I tillegg vil vesikkel brudd ikke inntreffe spontant for vesikler av komplekse lipide sammensetninger slik som de som inneholder høye fraksjoner av kolesterol eller negativt ladede lipider. Avhengig av systemet, kan det vesikkel-ruptur induseres ved ytterligere å tilpasse de eksperimentelle forhold som temperatur 12, løsnings-pH 13, og saltholdighet 14, osmotisk sjokk 15 16, eller tilsetting av divalente ioner så som Ca 2 + 17. Alternativt kan membranen aktive AH peptidet bli introdusert for å destabilisere et sjikt av adsorberte vesikler, som fører til vesikkel brudd og bilagsdannelse på en rekke overflater 18-22.

Dessuten lykkes bilagsdannelse krever fremstillingen av en godt kontrollert populasjon av små unilamellære vesikler som kan være tidkrevende og vanskelig å oppnå for enkelte membransammensetninger. Derfor, til tross for sin høye effektivitet i optimale tilfeller (for eksempel, etter omfattende fryse-tine-forbehandling av vesikler 23), den generelle anvendelse av vesikkel fusjon er begrenset av omfanget av egnede substrater og membransammensetninger.

Løsningsmidlet-assistert lipid bilaget (SalB) -metoden 24-28 er en alternativ fremstillingsteknikk som ikke krever lipidvesikler. Metoden er basert på avsetning of lipidmolekyler på en fast overflate i nærvær av et vannblandbart organisk løsningsmiddel etterfulgt av gradvis utveksling av dette oppløsningsmiddel med en vandig bufferoppløsning for å utløse SLB dannelse. I løpet av oppløsningsmiddel-lingstrinnet, den ternære blanding av lipider, organisk løsningsmiddel, vann og gjennomgår en rekke faseoverganger med økende vannfraksjon, noe som fører til dannelse av lamellære fase strukturer i bulkløsning og en SLB på det faste substrat. Viktigere, omgår denne selv-sammenstillingen rute behovet for vesikkel brudd, som vanligvis er den begrensende trinnet for omdanning av adsorberte vesikler i en SLB. Protokollen er anvendbar for en rekke overflater, inkludert silisiumdioksyd, aluminiumoksyd, krom, indium tinnoksyd, og gull. I dette papir, og i den tilhørende video, er en sammenligning av lipidavsetning ved SalB og vesikkel-fusjonsfremgangsmåter presentert. Spesielt påvirkning av eksperimentelle parametre, herunder lipidkonsentrasjonen, Strømningshastighet, og valget av vannblandbart organisk oppløsningsmiddel, på kvaliteten av bilaget dannet ved SalB metode er omtalt. Analytisk karakterisering av de fabrikkerte SLBs utføres av QCM-D, fluorescens mikroskopi, og fluorescens restitusjon etter fotobleking (FRAP) teknikker. QCM-D overvåking er en overflatesensitiv massemåling teknikk som siden den banebrytende arbeid utført av Keller og Kasemo 29, har vært mye brukt til å kvantitativt undersøke bilagsdannelse. Fluorescens mikroskopi tillater inspeksjon av membranen homogenitet så vel som den visualiseringen av membrandomener. FRAP teknikken er en standard verktøy for å bestemme den sideveis bevegelighet av lipidmolekyler i en SLB, som er en viktig egenskap ved fluidic membraner.

Den første del av denne studien innebærer QCM-D analyse av SalB og vesikkel-fusjonsmetoder anvendt for å forsøke bilagsdannelse på silisiumdioksid og gull. I den andre delen,fremstillingen og karakteriseringen av støttede membraner inneholdende en rekke kolesterolkonsentrasjoner med SalB fremgangsmåten er vist, og resultatene er sammenlignet med dem oppnådd ved hjelp av vesikkel-fusjonsmetoden.

Protocol

1. Dannelse av Støttede lipidbilag på en hydrofil Solid Support

  1. Forbered lipid stamløsninger på 10 mg / ml 1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-fosfokolin (DOPC) og 1 mg / ml 1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine- N - (lissamin rhodamin B sulfonyl) (Rh-PE) ved å oppløse de respektive lipid pulver (hensiktsmessig veid på forhånd med en analytisk massebalanse) i isopropanol oppløsning.
  2. Fortynn og blande stamløsninger i isopropanol for å fremstille den ønskede lipid-blandingen ved sluttkonsentrasjonen. For fluorescens mikroskopi og FRAP eksperimenter bør 0,5 vekt% Rh-PE inkluderes i lipidblandingen.
  3. Injiser lipidblandingen i isopropanol inn i mikrofluidkanalen helt til den er fylt.
  4. Inkuber lipidblandingen på glassoverflaten i omtrent 10 min.
  5. Gradvis erstatte lipidoppløsningen med vann eller bufferoppløsning ved hjelp av en peristaltisk pumpe ved en meget lav strømningshastighet(10-50 mL / min). Alternativt erstatte lipidblandingen ved gjentatt pipettering.
  6. Skyll grundig med kanalen overskudd av buffer for å fjerne den resterende isopropanol.

2. Dannelse av Kolesterol-beriket Støttede Membraner

Merk: fast underlag (SiO 2) støtter vesikkelfusjon, men membranen sammensetning (høyt kolesterol) hemmer vesikkelfusjon fordi kolesterol-beriket vesikler har høy bøyestivhet 30.

  1. Fremstille en stamløsning inneholdende 10 mg / ml lipid DOPC, 10 mg / ml kolesterol og 1 mg / ml Rh-PE ved først å oppløse de respektive pulvere i isopropanol.
  2. Gjenta trinn 1,2-1,6 ved hjelp av stamløsninger utarbeidet i trinn 2.1.

3. membranfluiditet Assay

  1. Dyppe objektglasset i natriumdodecylsulfat (SDS) -løsning (1%) i 10 minutter.
  2. Vask lysbildene grundig med avionisert vann og skyll viddh etanol.
  3. Føn lysbilder ved hjelp av en svak strøm av nitrogen.
  4. Utsette lysbilder til oksygen plasma for 30 sek ved maksimal radiofrekvens makt i oksygen plasma kammeret.
  5. Fjern beskyttelsesfilmen belegg av den bunnløse kommersielle mikrofluidkammer (figur 1A) ved hjelp av en pinsett og fest glass-slide på den klebrige siden av kammeret (figur 1B).
  6. Montere kontakter og rør inn i innløps- og utløps stillinger i kammeret og plasser microfluidic kanal på mikroskopet scenen (figur 1C).
  7. Danne et fluorescens-merket understøttet lipid bilaget i mikrofluidkanalen [gjenta trinn 1 ved å anvende den ønskede lipid sammensetning (for eksempel 0,5 mg / ml DOPC), inkludert 0,5 vekt% Rh-PE i organisk løsningsmiddel].
  8. Finn bilaget flyet med en 60X oljeneddyppingsobjektivet (NA 1.49) for å ta bilder.
  9. Ta to pre-blekemiddel bilder, så foto bleke en 301; m bred sirkelformet flekk med en 532 nm, 100 mW laserstråle. Før fotobleking, varme opp laseren til sin intensitet har blitt stabil. Umiddelbart etter fotobleking, ta en serie bilder hver 1 sek for 2 min for å følge oppgangen i fluorescens intensitet på bleket flekk.

4. Kolesterol Kvantifisering analysen

  1. Utsett silisiumdioksid belagt kvartskrystall sensor chip til oksygen plasma for 30 sek ved maksimal radiofrekvens makt i oksygen plasma kammeret. Fjerne brikken fra kammeret og umiddelbart monteres på brikken i målekammeret.
  2. Før eksperimentet første erverve frekvens og spredning av sensorbrikken i luft for å sikre riktig montering.
    1. For den kommersielle Q-Sense E1 eller E4 QCM-D instrument, kjører Q-Soft program og klikk "Erverv" og velg "Setup Measurement".
    2. I det nye vinduet som vises, kontroller 3, 5, 7, 9, 11 og 13 overtoner, og klikk deretter Søk og løpe for å sjekke resonansspektre. Angi temperaturen ved 24 ° C. Dersom en eller flere resonansfrekvenser ikke er enig med de forventede verdier, sjekk chip montering og re-utføre dette trinnet inntil en avtale er nådd.
  3. Starte den peristaltiske pumpe og strømningsbufferoppløsning (10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5) inn i målekammeret ved en strømningshastighet på 100 mL / min.
  4. I programmet klikker "Kjøp" og velg "Restart Measurement" for å registrere resonans frekvens og energi utskeielser signaler. Gjenta dette trinnet til en stabil baseline oppnås for frekvens og ødsling skift. Merk: For trinn heretter, vil det være ekstra frekvens og ødsling skift som kan tas opp som en funksjon av tiden.
  5. Injisere isopropanol (uten lipid) i 10 minutter.
  6. Injiser blanding av DOPC lipid / kolesterol påønsket molforhold med en total lipid-konsentrasjon på 0,5 mg / ml i isopropanol i 10 min.
  7. Injiser buffer i 20 minutter ved en strømningshastighet på 100 mL / min.
  8. Injisere en løsning av 1 mM metyl-β-cyklodekstrin (MβCD) fremstilt i buffer (strømningshastighet 100 ul / min) inntil frekvenssignalet har nådd en stabil verdi.
  9. Måle de relative positive frekvensforskyvninger som er forårsaket av den MβCD behandlingstrinn og beregne massen av kolesterol og DOPC lipider ved å konvertere Af cho, og Af DOPC verdier til masseverdier ved hjelp av Sauerbrey ligning [Δm = - (C / N) x Af, hvor C = 17,7 ng / cm 2, n: tone].
  10. Beregn molfraksjonen av kolesterol i SLB, tar hensyn til molekylvektene til DOPC lipid (786,1 g / mol) og kolesterol (386,6 g / mol).

Representative Results

Fabrikasjon av støttede lipidbilag på hydrofile underlag.

VF og SalB formasjonsfremgangsmåter ble forsøkt på silisiumdioksyd og gull og formasjonsprosessene ble overvåket i sann tid ved QCM-D måleteknikken. De QCM-D-instrument måler endring i resonansfrekvensen (Δ f) av en oscillerende piezoelektrisk kvartskrystall ved masse adsorpsjon på overflaten av krystallen. I tillegg måler QCM-D instrument avledning av vibrasjoner for å karakterisere de viskoelastiske egenskaper (stivhet og mykhet) av adlayer. Vesikkel fusjonseksperimenter ble utført som tidligere beskrevet 31. I korthet, en grunnlinje ble etablert for de frekvensspredning og signaler i vandig bufferløsning [10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5; (Figur 2A og B)]. Deretter små unilamellære DOPC lipidvesikler i den samme buffer ble igjenkastes ved t = 10 min (pilen 1) på silisiumdioksyd (figur 2A) og gull (figur 2B). For vesikkelfusjon på silisiumdioksid, ble to-trinns adsorpsjonskinetikk observert med de siste endringene i frekvens og energi ødsling av -26 (± 1) Hz og 0,3 (± 0,2) × 10-6, henholdsvis. Disse verdiene er i overensstemmelse med dannelsen av et båret lipidbilag 29.

Som vist i figur 2B, tilsetning av vesikkel-løsningen på gull overflate førte til en samtidig reduksjon og økning i S f og Δ D-signaler, henholdsvis til deres verdier oppnådd -150 (± 10) og Hz (7,5 ± 2) x 10 - 6, respektivt. Disse verdier tilsvarer dannelsen av en adsorbert vesikkel lag. Således, som forventet, en SLB ble ikke dannet på gull med en vesikkel-fusjonsmetoden.

QCMD-analyse for bilagsdannelse på silisiumdioksid og gull ved SalB fremgangsmåten er presentert i figur 2C og D. På silisiumdioksid, endelige Æ f og Δ D skift på -25,6 (± 0,55) Hz og 0,4 (± 0,27) × 10-6 henholdsvis ble oppnådd, og disse verdiene indikerer dannelsen av en SLB. Lignende utvalgene av Δ f og Δ D (Δ f Au: -27,3 ± 2,7 Hz, Δ D Au: 0,48 (± 0,26) × 10 - 6) ble observert på gull. Disse resultatene støtter at SalB metoden muliggjør dannelsen av støttede lipidbilag på overflater som hindrer vesikkel ruptur.

Effekt av løsningsmiddel-exchange strømningshastighet på kvaliteten av støttede lipidbilag.

Å bestemme optimale forhold for fabrikasjon av høy kvalitet som støttes lipidbilag vien den SalB metoden, ble påvirket av lipidkonsentrasjonen, løsemiddel valutakurs og valg av organisk løsemiddel undersøkt.

Figur 3 viser endringen i QCM-D frekvens i løpet av det siste trinnet av den SalB protokollen, som utføres på silisiumdioksyd ved to forskjellige strømningsrater (100 og 600 mL / min) og to forskjellige lipidkonsentrasjoner (0,125 og 0,5 mg / ml) .

Ved 0,5 mg / ml DOPC lipid ble anvendt (figur 3A), ble bilagsdannelse ikke er påvirket av strømningshastigheten, og en avsluttende Af forskyvning på omtrent -26 Hz ble oppnådd i begge strømningshastigheter.

Derimot, når en nedre lipidkonsentrasjon ble anvendt, er mengden av adsorbert lipid etter fullstendig løsningsmiddelutveksling ble signifikant påvirket av strømningshastigheten (figur 3B). Til en gjennomsnittlig strømningshastighet på 100 mL / min, bilagsdannelse var fullstendig (Af rundt -26 Hz). Imidlertid, ved en 6-ganger høyere strømningshastighet (600 mL / min), ble en fullstendig to-lags ikke dannet (Af rundt -17 Hz). Disse resultatene gir en rettesnor for valg av riktige eksperimentelle betingelser for vellykket bilagsdannelse ved hjelp av SalB metode med isopropanol som det organiske løsningsmiddel.

Karakterisering av støttede lipidbilag dannet fra forskjellige lipidkonsentrasjoner i ulike alkoholløsninger.

Lipid-konsentrasjonen er en annen parameter som påvirker kvaliteten på SLBs oppnådd ved hjelp av SalB metoden. Fluorescens mikroskopi viste at, ved 0,05 mg / ml lipid-konsentrasjon, ble bare isolerte, sub-mikroskopiske lipid strukturer dannet (figur 4A). Med økende lipidkonsentrasjon anvendt i SalB prosedyren, fluorescensintensiteten av lipidstrukturer ble mer homogen. Ved 0,1 mg / ml lipid-konsentrasjon, var det mikroskopiske lipid flekker, selv om strukturen ikke spenner over hele field of view (4B). Når 0,25 mg / ml lipid-konsentrasjon ble anvendt, ble en homogen lipidbilag dannet (figur 4C). Derfor er det et minimum lipid-konsentrasjon som kreves for å danne et komplett, full-dekkende SLB.

Påvirkningen av lipid-konsentrasjon på det endelige utfallet av SalB forsøkene ble også undersøkt over et større konsentrasjonsområde lipid (0,01 til 5 mg / ml) og i forskjellige organiske løsningsmidler (isopropanol, etanol og n-propanol). Den Δ f og Δ D-verdier som tilsvarer det siste trinn i SalB prosedyren er vist i figur 5.

Vi definerte bilagsdannelse basert på endelig endringer i frekvens og energispredning mellom -25 og -30 Hz og mindre enn 0,5 x 10 -6, respektivt. Basert på disse kriterier, til den optimale lipid konsentrasjonsområdet dannes en lipidbilag som ble bestemt til å være mellom 0,1 og 0,5 mg/ ml i stor grad uavhengig av typen av organisk løsningsmiddel. Avvikene i ervervet Δ f og Δ D forskyver utenfor det nevnte området er på grunn av tilstedeværelsen av ytterligere masse (f.eks dobbeltlag-stabler), forekomst av ikke-bilags morfologi (f.eks vesikler, markliknende miceller), og tilstedeværelsen av fragmenterte dobbeltlag øyer med ufullstendig morfologi på tvers av substratet.

Mens SalB fremgangsmåten for å framkommet støttede lipid bilag er relativt robust, kan den optimale lipidkonsentrasjonen for høykvalitets bilagsdannelse krever justering avhengig av den spesifikke eksperimentelle konfigurasjonen. I utgangspunktet er det ikke bare et minimum lipidkonsentrasjon, men også en maksimal lipidkonsentrasjon nødvendig for optimal bilagsdannelse via SalB metoden. Det optimale konsentrasjonsområdet er avhengig av strømningshastigheten og kan også være påvirket av substratet og lipid sammensetning. Empirisk, i mange tilfeller har vi found at en lipid-konsentrasjon på 0,5 mg / ml og en strømningshastighet på 100 mL / min er den optimale sett av betingelser for dannelse av et homogent understøttet lipidbilag. Imidlertid, avhengig av lipid-sammensetningen og flow-celle-geometri sistnevnte som påvirker strømningsprofilen under løsningsmiddel-utveksling ytterligere optimalisering av lipid-konsentrasjonen kan være nødvendig. Derfor anbefaler vi å utføre pilot SalB eksperimenter ved hjelp av en 0,5 mg / ml lipid konsentrasjon og vurdere bilaget kvalitet ved hjelp av QCM-D eller fluorescens mikroskopi teknikker. Dersom bilag vises ufullstendig, da lipidkonsentrasjonen bør økes i trinn på 10% frem til tilfredsstillende resultater er oppnådd. Hvis bilaget ser ut til å sameksistere med andre lipidstrukturene, deretter lipidkonsentrasjonen bør reduseres i trinn på 10% frem til tilfredsstillende resultater er oppnådd.

Fabrikasjon av støttede lipidbilag med forskjellig lipid sammensetning og different kolesterol fraksjoner.

Deretter ble SalB og VF-metoder som anvendes for å danne kolesterolanriket SLBs. Figur 6 viser representative fluorescens bilder (100 x 100 um) av kolesterolholdige støttet membraner fremstilt ved SalB metoden. Membranene består av sirkulære fargestoff ekskludert domener som er omgitt av en kontinuerlig fase, karakterisert ved uniform fluorescerende lysstyrke. De mørke områder økt i området med økende kolesterolfraksjonen i forløperen lipidblandingen. Deretter ble FRAP målinger utført for å undersøke fluiditeten av det ytre lipid bilaget filmene. FRAP Målingene viste nesten fullstendig gjenvinning av fluorescens i den omgivende fase som angir den sideveis bevegelighet av lipider og dermed dannelse av en enkelt lipidbilag. Da Rh-PE skillevegger fortrinnsvis i væskefase, er de mørke områder sannsynligvis består av tette kolesterolanriket strukturer. For sammenligning ble fabrikasjonen av DOPC / Chol bilag ved hjelp av VF-metoden også forsøkt. DOPC blemmer med økende kolesterol fraksjoner (10-40 mol%) ble utarbeidet av vesikkel ekstruderingsmetode. Rh-PE lipid (0,5 vekt%) ble anvendt som fluorescerende markør for avbildning. Figur 7 viser representative fluorescens bilder (100 x 100 um) av konstruksjoner skapt ved inkubering av glass-substrater med kolesterolinneholdende blærer. FRAP-analyse viste dannelsen av en fluid lipidbilag som ved hjelp av vesikler som inneholdt 20 mol% Chol eller mindre. Imidlertid prøvene fremstilt ved hjelp av vesikler med høyere kolesterolfraksjonene viste ikke gjenvinning, noe som indikerer tilstedeværelsen av adsorberte men unruptured vesikler.

Fraksjonen av kolesterol, som til slutt ble inkorporert i de støttede lipiddobbeltlag ble kvantifisert som en funksjon av kolesterol fraksjon som hadde blitt inkludert i forløperen leppenid blandingen i organisk løsningsmiddel i SalB metode eller i vesiklene i vandig oppløsning i VF-metoden. Ved hjelp av QCM-D teknikk, ble bilagsdannelse overvåket og deretter MβCD ble tilsatt for å ekstrahere spesifikt Chol fra de støttede lipidbilag 32. Massetapet på grunn av fjerning av kolesterol førte til en reduksjon i den absolutte verdi av frekvensforskyvning (| Æ f |) forbundet med SLB. De relative positive frekvensforskyvninger forårsaket av MβCD behandlingstrinnet er vist i figur 8A. Molfraksjonen av kolesterol ble beregnet på grunnlag av den frekvensforskyvning, som vist i figur 8B.

Kolesterolet fraksjon innlemmet i støtte lipiddobbeltlag fremstilt ved fremgangsmåten SalB var nesten lineært proporsjonal med kolesterolinnholdet i utgangs lipidblandingen. Interessant, kolesterolfraksjonen i bilag fremstilt ved VF-metoden (vesikler inneholdende opptil20 mol% Chol) var betydelig lavere enn det som ligger i de forløper blemmer. Faktisk er den høyeste del av kolesterol oppnådd ved VF-metoden var bare omtrent 10 mol%.

Observasjon av stripe overbygning i β-to-fase sameksistens region av kolesterol-fosfolipid støttet lipidbilag.

SalB eksperimenter ble videre utført ved anvendelse av en lipidblanding med en enda høyere andel av kolesterol. Når en 4: 6 blanding av DOPC og kolesterol ble brukt, en gradvis skilling av en ensartet væskefase i to sameksisterende faser visualiseres som lyse stripeformede domener på en mørk (fargestoff-ekskluderende) bakgrunnen ble observert (figur 9). Det er fastslått at Rh-PE er ekskludert fra kolesterol-rike domener 33, og dermed de dominerende mørke områder som fremkom som bakgrunn er kolesterolanriket regioner. Dannelsen av mikron-størrelse lyse domener på en mørk bakgrunn på high kolesterolfraksjonen (> 50 mol%) er i overensstemmelse med den β region i monolag fasediagram av kolesterol / fosfolipid-blandinger 34,35. Videre er dannelsen av stripedomener, som oppstår fra en svak linje spenning, tyder på at blanding er nær en blandbarhet kritisk punkt.

Figur 1
Figur 1. mikrofluidkammer for SalB dannelse i en egnet konfigurasjon for epifluorescens mikroskopi. (A) Kommersiell mikrofluidkammer (B) dekkglass festet på den klebende side av kammeret, (C) Fullstendig oppsett på et objektholder med slange koblet til innløps- og utløpsportene i kammeret, og (D) Peristaltisk pumpe som brukes til å styre frekvensen av oppløsningsmiddel utveksling. Lipider oppløst i isopropanol blir injisert inn i måle chamber ved hjelp av peristaltiske pumpen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. QCM-D analyse av vesikkel fusjons og SalB eksperimenter på silisiumdioksid og gull substrater. QCM-D frekvens (Af, blå) og utladning (DD-, røde) respons for tredje overtone (n = 3) ble registrert som en funksjon av tiden i løpet av lipid adsorpsjon på (A og C) silisiumdioksyd, (B og D) gull. Paneler a og b frem vesicle fusjonsmetoden. DOPC Lipidvesiklene ble injisert ved t = 10 min (pilen 1). Paneler c og d tilsvarer den SalB dannelsesmetoden. Piler indikerer injeksjon av buffer (1), isopropanol (2), lipidblanding [0,5 mg / ml lipid DOPC i isopropanol; (3)] ​​og buffer utveksling (4). Den stiplede kurve i felt B svarer til et kontrollforsøk hvori lipid ikke ble injisert. De endelige verdier av A f og AD for hver flate er spesifisert. Tegningene viser de foreslåtte sammensatte lipidstrukturene som utledes fra den endelige frekvens og ødsling skift. Tilpasset fra referanse 24 og brukes med tillatelse av American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Påvirkning av løsemiddel-kursen på SalB dannelsesprosessen. QCM-D frekvensforskyvninger (Af) som svarer til siste trinn (se pilen 4 i figur 2C) i SalB metode ble målt på silisiumdioksyd ved to forskjellige kurser, 100 og 600 pl / min, u sing (A) 0,5 mg / ml og (B) 0,125 mg / ml lipid DOPC i isopropanol. De endelige Af verdier er også angitt, i forhold til målelinjen i vandig bufferoppløsning. Tilpasset fra referanse 24 og brukes med tillatelse av American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Terskel of Lipid Konsentrasjon Complete SalB Dannelse epifluorescens mikroskopi av lipid-lag på silisiumdioksyd fremstilt ved SalB anvendelse av (A) 0,05 mg / ml.; (B) 0,1 mg / ml; og (C) 0,25 mg / ml lipid-konsentrasjonen. Tilpasset fra referanse 26 og brukes med tillatelse av American Chemical Society./files/ftp_upload/53073/53073fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Effekt av lipid-konsentrasjon og organisk oppløsningsmiddel ut på støttet lipid bilagsdannelse ved SalB metode. De siste endringer i QCM-D (A) frekvens og (B) energiavgivelse for SalB forsøk under anvendelse av forskjellige organiske oppløsningsmidler, som en funksjon av lipid konsentrasjon. De stiplede grønne linjer tilsvare forventet frekvens og ødsling skift for en komplett dobbeltlag (-30 Hz <Af <-25 Hz og DD <1 x 10 -6). Tilpasset fra referanse 26 og brukes med tillatelse av American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av denne figure.

Figur 6
Figur 6. fluorescens restitusjon etter photobleaching analyse av støttede lipidbilag med varierende fraksjoner av kolesterol utarbeidet av SalB metoden på et glass substrat. (AE) Fluorescens-mikrografer av dobbeltlag fremstilt ved bruk av forskjellige kolesterolfraksjonene i utgangsblandingen. Bilder ble tatt opp umiddelbart (øverst) og 1 min (i midten) etter fotobleking. Den mørke flekken i midten av bildet tilsvarer photobleached regionen. Skalaen barer er 20 mikrometer. Flateareal histogrammer av individuelle fargestoff-utelukket domener i hver prøve blir også presentert (nederst). Tilpasset fra referanse 36 og brukes med tillatelse av American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Figur 7. FRAP analyse av kolesterolholdig støttes bilag utarbeides av vesikkelfusjon metoden. (AD) Fluorescens-mikrografer av dobbeltlag fremstilt ved bruk av forskjellige kolesterol fraksjoner (10 til 40 mol%), i forløper-vesikler. Bilder ble tatt opp umiddelbart (øverst) og 1 min (nederst) etter fotobleking. Den mørke flekken i midten av bildet tilsvarer photobleached regionen. Skalaen barer er 20 mikrometer. Tilpasset fra referanse 36 og brukes med tillatelse av American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 8
Figur 8. Quantification av kolesterol fraksjon i støttede lipidbilag. (A) Den positive QCM-D frekvensforskyvning ved injeksjon av 1 mM MβCD på støttes lipidbilag med varierende molfraksjonene av kolesterol i utgangsblandingen (mellom 0 og 50 mol%). (B) molprosent av kolesterol utarmet fra bilagene fremstilt ved SalB og vesikkel-fusjonsmetoder som en funksjon av kolesterolfraksjonen i forløper-blandinger eller blærer. Tilpasset fra referanse 36 og brukes med tillatelse av American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 9
Figur 9. Tidsavhengig utviklingen av fluorescens mikrostruktur i en støttet dobbeltlag av DOPC / Chol (4: 6 molforhold containing 0,5% rhodamin-PE) fremstilt ved fremgangsmåten SalB. En enhetlig fase gradvis faseseparerer til en væske-væske sameksistens region ved fullstendig løsningsmiddelutveksling. Tilpasset fra referanse 37 og brukes med tillatelse av American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

I dette arbeidet, er et løsningsmiddel-utvekslingsprotokollen presentert hvori lipider i alkohol (isopropanol, etanol, eller n-propanol) ble inkubert med en fast bærer, og deretter alkoholen erstattes gradvis med en vandig bufferoppløsning for å drive en serie av faseoverganger til slutt produsere lamellar-fase lipidbilag 24. Det er vist at fremgangsmåten muliggjør fremstilling av støttede lipidbilag på overflater så som gull, som er problematiske å vesikkel-fusjonsmetoden.

En optimal lipid-konsentrasjon område (0,1 - 0,5 mg / ml) er blitt bestemt for fullstendig bilagsdannelse i standard eksperimentelle formater testet hittil. Ved lipid-konsentrasjoner under 0,1 mg / ml, diskrete, mikroskopiske flekker av bilag dannet. På den annen side, ved konsentrasjoner over 0,1 mg / ml og lavere enn 0,5 mg / ml, blir en fullstendig og ensartet dobbeltlaget dannet. Ved lipid-konsentrasjoner over dette område, ble en to-lags fluid fremdeles utformet som verified av FRAP-analyse viser imidlertid fluorescens mikroskopi nærværet av ekstra lipid strukturer på toppen av bilaget. Påfallende, morfologi av disse ytterligere lipidstrukturer, bestemt ved QCM-D-analyse, var avhengig av den alkohol som ble brukt under inkuberingstrinnet. I tilfelle av etanol, de relativt høye S f og Δ D skift ligne QCM-D signatur som oppnås for en vesikkel adsorbert lag. Når isopropanol eller n-propanol i stedet ble brukt, Δ f var noe høyere enn verdien forventet for et bilag (endelig Δ f mellom -30 -40 for å Hz), mens Δ D var betydelig høyere. Slike QCM-D-reaksjoner ville være forventet i lengre lipidstrukturer (f.eks markliknende miceller) som stikker frem utover fra membranoverflaten (som er synlig ved fluorescensmikroskopi i noen tilfeller).

Frekvensen av løsemiddel utveksling er en annen viktig parameter som kan være kritisk, especially når lavere lipid-konsentrasjoner (for eksempel, 0,1 mg / ml) anvendes. Hurtig utveksling oppløsningsmiddel ved lav lipid-konsentrasjon kan føre til dannelsen av ufullstendige bilag. I standard målekammer som brukes for QCM-D-målinger i dette papiret (Q-Sense E4 målekammer), strømningshastigheter på rundt 100 mL / min, var egnet for svært reproduserbare komplett dobbeltlag formasjon. For flyt celler med andre geometrier og volum, kan den optimale strømningshastigheten varierer og må bestemmes empirisk basert på trappen foreslåtte her.

I tillegg til å danne lipid bilag som støttes på overflater som er uløselige i vesikkel-fusjon kan SalB bli anvendt for å omgå behovet for lipidvesikler som kan brytes, for derved å åpne døren til fremstilling av støttede membraner med komplekse sammensetninger. Som et illustrerende eksempel sammensetningen ble lipid-blandinger med en høy andel av kolesterol undersøkt. Kolesterol er en viktig komponent i mammAlian cellemembraner, og den fraksjon kan nærme seg 45 til 50 mol% av membranen lipid sammensetning (for eksempel i erytrocytter). Således bør til og med en enkel modell av et lipidbilag som representerer en human cellemembran inkluderer kolesterol.

Mens vesikkelfusjon kunne brukes til å fremstille fluidic lipid bilag som kun inneholder 10-15% kolesterol, det SalB Måten muliggjør dannelse av fluidic lipidbilag som inneholder høye fraksjoner av kolesterol (opp til 57 mol%, som kvantifisert ved QCM-D-målinger) 36. Men når nivået av kolesterol ble ytterligere forhøyet (opptil 63 mol%) ble det stripe-formede områder 37 observert. De sameksisterende domener var flytende, som minner om det som ble observert i β området i fasediagrammet for kolesterol / fosfolipider monolag i grensesnittet luft-vann.

Totalt sett er SalB metoden vist seg å være en enkel og effektiv metode for å danne støttes lipid bilag, spesielt in tilfeller utenfor omfanget av den konvensjonelle vesikkel fusjonsmetoden. Hittil har de QCM-D teknikk og fluorescens mikros hovedsak brukt til å karakterisere de støttede lipidbilag dannet ved SalB metoden. Ser frem, et bredt spekter av overflate sensitive analytiske målinger teknikker, inkludert overflate plasmonresonans (SPR) 38, atomic force mikroskopi (AFM) 39,40, Fourier-transform infrarød spektroskopi 41, X-ray 42 og nøytron reflektivitet 43, kan brukes til ytterligere å karakter og studere enkle og komplekse dobbeltlag-konfigurasjoner fremstille ved SalB metoden. Disse nye mulighetene åpne døren til et større antall forskere som kan utforske kunstige cellemembraner ved å dra nytte av en enkel og robust forsøksprotokoll.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å erkjenne støtte fra National Research Foundation (NRF -NRFF2011-01 og NRF2015NRF-POC0001-19), National Medical Research Council (NMRC / CBRG / 0005/2012), og Nanyang Technological University til NJC

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QCM-D silicon dioxide-coated substrates QSense AB,  Sweden
QCM-D gold-coated substrates QSense AB,  Sweden
Q-Sense E4 module QSense AB,  Sweden
Plasma Cleaner, PDC-32G Harrick Plasma, Ithaca, NY PDC-001 (115V) 
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids 850375P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE) Avanti Polar Lipids 810150P
cholesterol Avanti Polar Lipids 700000P
Methyl-β-cyclodextrin Sigma  C4555
Isopropanol Sigma  673773
Ethanol Sigma  459844
n-propanol Sigma  279544
Sticky-Slide I 0.1 Luer IBIDI 81128
Male elbow 1/8” Cole-Parmer 30505-70
Silicon tubing 1.6 mm ID IBIDI 10842
Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm IBIDI 10812
Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump Ismatec
Sodium dodecyl sulfate Sigma  71725

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sackmann, E. Supported membranes: Scientific and practical applications. Science. 271, 43-48 (1996).
  2. Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. Phase separation of lipid membranes analyzed with high-resolution secondary ion mass spectrometry. Science. 313, 1948-1951 (2006).
  3. Kalb, E., Engel, J., Tamm, L. K. Binding of proteins to specific target sites in membranes measured by total internal reflection fluorescence microscopy. Biochemistry. 29, 1607-1613 (1990).
  4. Bally, M., et al. Norovirus GII. 4 Virus-like Particles Recognize Galactosylceramides in Domains of Planar Supported Lipid Bilayers. Angewandte Chemie International Edition. 51, 12020-12024 (2012).
  5. Bally, M., Graule, M., Parra, F., Larson, G., Höök, F. A virus biosensor with single virus-particle sensitivity based on fluorescent vesicle labels and equilibrium fluctuation analysis. Biointerphases. 8, 10-1186 (2013).
  6. Groves, J. T., Dustin, M. L. Supported planar bilayers in studies on immune cell adhesion and communication. Journal of Immunological Methods. 278, 10-1016 Forthcoming.
  7. Mager, M. D., Melosh, N. A. Lipid Bilayer Deposition and Patterning via Air Bubble Collapse. Langmuir. 23, 9369-9377 (2007).
  8. Lenhert, S., Sun, P., Wang, Y., Fuchs, H., Mirkin, C. A. Massively Parallel Dip-Pen Nanolithography of Heterogeneous Supported Phospholipid Multilayer Patterns. Small. 3, 71-75 (2007).
  9. Mennicke, U., Salditt, T. Preparation of solid-supported lipid bilayers by spin-coating. Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).
  10. Tamm, L. K., McConnell, H. M. Supported phospholipid bilayers. Biophysical Journal. 47, 105-113 (1985).
  11. Kalb, E., Frey, S., Tamm, L. K. Formation of supported planar bilayers by fusion of vesicles to supported phospholipid monolayers. Biochim Biophys Acta. 1103, 307-316 (1992).
  12. Reimhult, E., Höök, F., Kasemo, B. Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure. Langmuir. 19, 1681-1691 (2003).
  13. Cho, N. -J., Jackman, J. A., Liu, M., Frank, C. W. pH-Driven assembly of various supported lipid platforms: A comparative study on silicon oxide and titanium oxide. Langmuir. 27, 3739-3748 (2011).
  14. Boudard, S., Seantier, B., Breffa, C., Decher, G., Felix, O. Controlling the pathway of formation of supported lipid bilayers of DMPC by varying the sodium chloride concentration. Thin Solid Films. 495-4246 (2006).
  15. Stanglmaier, S., et al. Asymmetric distribution of anionic phospholipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 28, 10818-10821 (2012).
  16. Jackman, J. A., Choi, J. -H., Zhdanov, V. P., Cho, N. -J. Influence of osmotic pressure on adhesion of lipid vesicles to solid supports. Langmuir. 29, 11375-11384 (2013).
  17. Rossetti, F. F., Bally, M., Michel, R., Textor, M., Reviakine, I. Interactions between titanium dioxide and phosphatidyl serine-containing liposomes: formation and patterning of supported phospholipid bilayers on the surface of a medically relevant material. Langmuir. 21, 6443-6450 (1021).
  18. Cho, N. -J., Cho, S. -J., Cheong, K. H., Glenn, J. S., Frank, C. W. Employing an amphipathic viral peptide to create a lipid bilayer on Au and TiO2. Journal of the American Chemical Society. 129, 10050-10051 (2007).
  19. Hardy, G. J., et al. Biomimetic supported lipid bilayers with high cholesterol content formed by [small alpha]-helical peptide-induced vesicle fusion. Journal of Materials Chemistry. 22, 19506-19513 (2012).
  20. Wallin, M., Choi, J. -H., Kim, S. O., Cho, N. -J., Andersson, M. Peptide-induced formation of a tethered lipid bilayer membrane on mesoporous silica. European Biophysics Journal. 1-10 (2014).
  21. Coutable, A., et al. Preparation of tethered-lipid bilayers on gold surfaces for the incorporation of integral membrane proteins synthesized by cell-free expression. Langmuir. 30, 3132-3141 (2014).
  22. Zan, G. H., Jackman, J. A., Cho, N. -J. AH peptide-mediated formation of charged planar lipid bilayers. The Journal of Physical Chemistry B. 118, 3616-3621 (2014).
  23. Jackman, J. A., Zhao, Z., Zhdanov, V. P., Frank, C. W., Cho, N. -J. Vesicle adhesion and rupture on silicon oxide: Influence of freeze–thaw pretreatment. Langmuir. 30, 2152-2160 (2014).
  24. Tabaei, S. R., Choi, J. -H., Haw Zan,, Zhdanov, G., P, V., Cho, N. -J. Solvent-Assisted Lipid Bilayer Formation on Silicon Dioxide and Gold. Langmuir. 30, 10363-10373 (2014).
  25. Hohner, A., David, M., Rädlera, J. Controlled solvent-exchange deposition of phospholipid membranes onto solid surfaces. Biointerphases. 5, 1-8 (2010).
  26. Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Kim, S. -O., Zhdanov, V. P., Cho, N. -J. Solvent-Assisted Lipid Self-Assembly at Hydrophilic Surfaces: Factors Influencing the Formation of Supported Membranes. Langmuir. 31, 3125-3134 (2015).
  27. Tabaei, S. R., Vafaei, S., Cho, N. -J. Fabrication of Charged Membranes by the Solvent-Assisted Lipid Bilayer (SALB) Formation. Method on SiO2 and Al2O3. Physical Chemistry Chemical Physics., doi:10.1039/C5CP01428J. (2015).
  28. Jackman, J. A., Tabaei, S. R., Zhao, Z., Yorulmaz, S., Cho, N. -J. Self-Assembly Formation of Lipid Bilayer. Coatings on Bare Aluminum Oxide: Overcoming the Force of Interfacial Water. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 959-968 (2015).
  29. Keller, C., Kasemo, B. Surface specific kinetics of lipid vesicle adsorption measured with a quartz crystal microbalance. Biophysical Journal. 75, 1397-1402 (1998).
  30. Sundh, M., Svedhem, S., Sutherland, D. S. Influence of phase separating lipids on supported lipid bilayer formation at SiO2 surfaces. Physical Chemistry Chemical Physics. 12, 453-460 (2010).
  31. Cho, N. -J., Frank, C. W., Kasemo, B., Höök, F. Quartz crystal microbalance with dissipation monitoring of supported lipid bilayers on various substrates. Nature Protocols. 5, 1096-1106 (2010).
  32. Beseničar, M. P., Bavdek, A., Kladnik, A., Maček, P., Anderluh, G. Kinetics of cholesterol extraction from lipid membranes by methyl-β-cyclodextrin—A surface plasmon resonance approach. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1778, 175-184 (2008).
  33. Pedersen, S., Jørgensen, K., Baekmark, T. R., Mouritsen, O. G. Indirect evidence for lipid-domain formation in the transition region of phospholipid bilayers by two-probe fluorescence energy transfer. Biophysical journal. 71, 554-560 (1996).
  34. Okonogi, T., McConnell, H. Contrast inversion in the epifluorescence of cholesterol-phospholipid monolayers. Biophysical Journal. 86, 880-890 (2004).
  35. McConnell, H. M., Radhakrishnan, A. Condensed complexes of cholesterol and phospholipids. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1610, 159-173 (2003).
  36. Tabaei, S. R., et al. Formation of Cholesterol-Rich Supported Membranes Using Solvent-Assisted Lipid Self-Assembly. Langmuir. 30, 13345-13352 (2014).
  37. Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Liedberg, B., Parikh, A. N., Cho, N. -J. Observation of Stripe Superstructure in the β-Two-Phase Coexistence Region of Cholesterol–Phospholipid Mixtures in Supported Membranes. Journal of the American Chemical Society. 136, 16962-16965 (2014).
  38. Salamon, Z., Wang, Y., Tollin, G., Macleod, H. A. Assembly and molecular organization of self-assembled lipid bilayers on solid substrates monitored by surface plasmon resonance spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1195-11267 (1994).
  39. Yuan, C., Johnston, L. Phase evolution in cholesterol/DPPC monolayers: atomic force microscopy and near field scanning optical microscopy studies. Journal of microscopy. 205, 136-146 (2002).
  40. Schneider, J., Dufrêne, Y. F., Barger, W. R. Jr, Lee, G. U. Atomic force microscope image contrast mechanisms on supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 79, 1107-1118 (2000).
  41. Tamm, L. K., Tatulian, S. A. Infrared spectroscopy of proteins and peptides in lipid bilayers. Quarterly reviews of biophysics. 30, 365-429 (1997).
  42. Miller, C. E., Majewski, J., Gog, T., Kuhl, T. L. Characterization of biological thin films at the solid-liquid interface by X-ray reflectivity. Physical Review Letters. 94, 238104 (2005).
  43. Koenig, B. W., et al. Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal. Langmuir. 12, 1343-1350 (1996).
Biomembranen Fabrication av Løsemiddel assistert lipidbilag (SalB) Metode
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Kim, M., Yorulmaz, S., Vafaei, S., Cho, N. J. Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method. J. Vis. Exp. (106), e53073, doi:10.3791/53073 (2015).More

Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Kim, M., Yorulmaz, S., Vafaei, S., Cho, N. J. Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method. J. Vis. Exp. (106), e53073, doi:10.3791/53073 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter