Protocol
1. Framställning av Native lösligt kollagen lösning
- Förbered eller köpa 200 mg syrad, lösligt, typ I-kollagen från skolästfiskar på 1-3 mg / ml med användning av standardisoleringsprotokoll, såsom rapporterats av Piez et al. 15
- Scale mängden utgångsmaterial baserat på den önskade slutvolymen av modifierade kollagenlösningar. Ungefär göra 25-30 ml metylerad och 25-30 ml succinylerade kollagenlösningar, vardera vid 3 mg / ml, från 200 mg lösligt nativt kollagen.
2. Kollagen Metylering
- Späd 100 mg av den nativa, surgjordes (pH 2-3) kollagenlösning till en koncentration av 0,5 mg / ml med iskall sterilt vatten och hålla lösningen på is för att förhindra gelning.
- Justera pH i kollagenlösningen till 9-10 med några droppar 1 N NaOH och rör om vid RT under 30 minuter. Observera kollagen fällningen, vilket orsakar att lösningen blir grumlig. Centrifugera ner den utfällda kollagenlösningen vid 3000 x g under 25 minuter. En klar, gelliknande fällning bör synas i botten av rören. Sug och kassera supernatantvätskan.
- Resuspendera den utfällda kollagenet i 200 ml metanol med 0,1 N HCl och låta metylering reaktionen ska ske med omröring vid rumstemperatur under 4 dagar. Kollagenet löses inte upp, men skulle bryta sönder i mycket små synliga bitar som kommer att göra lösningen grumlig.
- Efter metylering, centrifugera lösningen vid 3000 x g under 25 min för att pelletera den metylerade kollagen. Aspirera och kassera surgjord metanol vätskan.
- Lös den metylerade kollagen i 25 ml steril PBS, vilket ger en koncentration av ca 3 mg / ml, med upprepad pipettering, och filtrera lösningen genom ett 60 ^ m cellfilter. Justera pH i lösningen till 7,3 till 7,4 med användning av 20 ^ steg om 1 N NaOH.
- Bedöm concentration av lösningen med en kommersiell råttkollagen ELISA-kit eller hydroxiprolin analysutrustning. Späd lösningen 3 mg / ml med steril PBS.
- Sterilisera den metylerade kollagenlösningen genom att överföra den till en glasflaska med skruvkork, noggrant skiktning 3 ml kloroform vid botten av flaskan, tillåter flaskan att ställa O / N vid 4 ° C, och sedan aseptiskt ta bort och lagra toppskikt, som är den metylerade kollagen.
- Förvara lösning vid 4 ° C för användning inom en månad.
3. Kollagen succinylering
- Späd den andra 100 mg av den nativa, surgjordes (pH 2-3) kollagenlösning till en koncentration av 0,5 mg / ml med iskall sterilt vatten och hålla lösningen på is för att förhindra gelning.
- Justera pH i kollagenlösningen till 9-10 med några droppar 1 N NaOH och rör om vid RT under 30 minuter. Kollagenet bör utfällas, vilket orsakar att lösningen blir grumlig.
- Lös 40 mg succinic anhydrid (0,4 mg per mg kollagen) i 10 ml aceton (1/20: e volymen av kollagenlösning). Långsamt (på cirka 0,5 ml steg) tillsätt denna blandning till kollagenlösningen under omrörning under kontinuerlig övervakning av pH. Bibehåll pH-värdet över 9,0 genom tillsats av 1 eller 2 droppar av en NaOH när pH närmar sig 9,0.
- Fortsätt omröringen vid rumstemperatur under 120 min efter tillsats av all bärnstensyraanhydrid i aceton. Observera att lösningen blir klar som succinylerade kollagenet löses. Regelbundet kontrollera pH så att den förblir över 9,0.
- Justera lösningens pH till 4,0 med 20 | il steg om 1 N HCl. Observera lösningen grumlig igen, eftersom succinylerade kollagen utfaller.
- Efter succinylering, centrifugera lösningen vid 3000 x g under 25 minuter för att pelletera succinylerad kollagen. Aspirera och kassera det surgjorda supernatanten med oreagerad bärnstenssyraanhydrid.
- Lös den succinylerad kollageni 25 ml steril PBS, vilket ger en koncentration av ca 3 mg / ml, med upprepad pipettering, och filtrera lösningen genom ett 60 ^ m cellfilter. Justera pH i lösningen till 7,3 till 7,4 med användning av 20 ^ steg om 1 N NaOH.
- Bedöm koncentrationen av lösningen med användning av en kommersiell kollagen råtta ELISA-kit eller hydroxiprolin analyssats. Späd lösningen 3 mg / ml med steril PBS.
- Sterilisera succinylerade kollagenlösningen genom att överföra den till en glasflaska med skruvkork, noggrant skiktning 3 ml kloroform vid botten av flaskan, tillåter flaskan att ställa O / N vid 4 ° C, och sedan aseptiskt ta bort och lagra toppskikt, som är succinylerad kollagen.
- Förvara lösning vid 4 ° C för användning inom en månad.
4. Kontroll av kollagen Ändringar
- Förbered 1 ml prover från varje av de infödda, metylerade och succinylerade kollagenlösningar och späd till en koncentration av 0,1 mg / ml med sterilt rent vatten för vätejon titrering. Ytterligare Späd bufferten minst 1000-faldigt genom dialys mot vatten genom en 10 kDa cutoff membraneusing 3 byten lösning under minst 4 h vardera.
- Justera pH-värdet hos lösningarna till 7,3 med små mängder av NaOH och HCl. Användning av pH 7,3 som en godtycklig referens, utför vätejon titrering på varje prov som beskrivs av Tanford 16 för att skapa titreringskurvor för de infödda, metylerade och succinylerad kollagenlösningar.
- Plotta ändringen i pH per volym tillsatt syra kontra antalet av bunden H + joner per molekyl. Det höga pH-värdet "amino" intervall bör visa en förskjutning i succinylerad kollagen mot neutralpunkten (en förlust av amingrupper), och det låga pH "karboxyl" intervall bör visa en vänstervridning i den metylerade kollagen (en förlust av karboxylgrupper ) och en högerförskjutning i succinylerad kollagen (en vinst i karboxylgrupps), jämfört med den nativa kollagen.
- Bedöma effekten av den succinylering reaktionen genom bestämning av% av aminogrupperna i det nativa kollagenet ersatts med succinylering med användning av 2,4,6-trinitrobensensulfonsyra (TNBA) kolorimetrisk metod, genom att följa standardprotokoll 17,18.
5. Tillverkning av mikroflödessystem enheter och Cell sådd
- Tillverka mikrofluidikanordningar med användning av standardmetoder 9. Använd replika gjutning av PDMS från SU-8 mästare på kisel definieras med hjälp av fotolitografi för att skapa mikroflödescellodlingskammare med 100 ^ m lång, 0,4-1,5 mm bred, och 1-10 mm långa kanaler för celltillväxt.
- Använd en plasma renare att oxidera ytorna på enheten och en glasskiva, och sedan trycka ihop för att binda. Efter sterilisering av anordningen genom exponering för UV-ljus under åtminstone 30 minuter, fylla kammaren med 50 | ig / ml fibronektin i steril PBS och inkubera vid 37 ° C under 45 minuter. Seed enheten med celler, såsom primära råtta eller humana hepatocyter, som kräver en kollagengel för stabilisering av fenotyp eller differentiering tillstånd. Vi använder 20 pl nyisolerade primära råtthepatocyter 7,19 eller kommersiellt tillgängliga kryokonserverade primära humana hepatocyter sådda på 14 x 10 6 celler / ml per enhet.
- Låta cellerna fästa under 4-6 h, och sedan tvätta ut obundna celler och ersätta plating media med tillväxtmedia. Inkubera O / N för att säkerställa full cellspridning och att skapa ett sammanflytande monolager av celler.
6. Skikt-vid-skikt kollagendeponering
- I ett laminärt flöde vävnadsodling huva, förbereda tillräckliga volymer av metylerade och succinylerade kollagenlösningar för 10 tillämpningar av varje lösning per enhet, liksom några ml media. Håll lösningarna på is. Vi använder 20 ^ (10-15 gånger den totala volymen enheten) av kollagen per skikt per enhet.
- Vararensnings med denaturerad (polykatjoniska) lösning, suppleant spolning enheterna med 20 il denaturerad och sedan succinylerade kollagenlösningar, väntar en minut mellan varje ansökan. Spola anordningen totalt 10 gånger per lösning, som bör ha ungefär 20 minuter. Arbeta snabbt för att minimera den tid cellerna är utan medier.
- Beakta kollagen långsamt ansamlas vid inloppet / utloppet beroende på dess storlek. Om motståndet mot vätskeflödesökningar, spola enheten en eller två gånger med media, och sedan fortsätta skiktning.
- Efter applicering alla skikten, skölj anordningen två gånger med färskt medium och återgå till inkubatorn. Beroende på celltypen, de extracellulära matris-inducerade morfologiska förändringar, såsom förstärkt polarisation i hepatocyter, bör vara synliga inom några timmar.
- Förbered representativa anordningar för transmissionselektronmikroskopi med användning av standardmetoder 9 för att verifiera närvaron av en kollagenmatrismontering ovanpå de odlade cellerna.
7. Stabilisering av cellfenotyp och funktion
- Bild cell morfologi, livskraft, och polaritet med hjälp av standardmetoder för celltypen. För hepatocyter, samla bilder över 14 dagar med användning av fasmikroskopi, LIVE / DEAD färgning för viabilitet och CMFDA färgämne för apikal polarisation för att demonstrera effekterna av kollagendeponering.
- För cellmorfologi, spola anordningen genom inloppet med pipett med 20 | il PBS för att skölja, injicera 20 | il PBS, och bild enheten med faskontrastmikroskopi.
- För LIVE / DEAD färgning, spola anordningen genom inloppet med pipett med 20 | il PBS för att skölja, injicera 20 | il av LIVE / DEAD färgningslösning med DAPI ställdes genom att följa tillverkarens instruktioner, inkubera i 30 min vid 37 ° C, skölj enhet igen med 20 pl PBS, och bild enheten med fluorescensmikroskopi.
- För galla canaliCuli färgning, spola apparaten genom inloppet med pipett med 20 pl PBS för att skölja, injicera 20 pl 2 iM CMFDA färglösningen med DAPI tillredda enligt tillverkarens instruktioner, inkubera i 30 minuter vid 37 ° C, skölj enheten igen med 20 pl PBS, och bild enheten med fluorescensmikroskopi.
- Samla de förbrukade media och mäta cellulära metaboliska produkter vid lämpliga tidpunkter under odlingstiden för att bestämma cellfunktion. För hepatocyter mäta mängden av albumin och urea i de förbrukade medierna.
- Utför endpoint funktionella analyser på cellerna själva, såsom bedömning av enzymaktivitetsnivåer, antikroppsfärgning, eller RNA-analys. För hepatocyter inducera och mäta cytokrom P450 enzymaktiviteter eller fas II konjugering enzym glutation-S-transferas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nativt kollagen kan ändras med hjälp av metylering och succinylering att skapa polykatjoniska och polyanjoniska kollagenlösningar för användning i lager-på-lager avsättning. Succinylering modifierar s-aminogrupperna av nativt kollagen med succinylgrupperna, och metylering modifierar karboxylgrupperna hos nativt kollagen med en metylgrupp (figur 1 A). Dessa ändringar av aminosyrasidokedjor kollagenprotein förändrar pH-titreringskurvorna för lösningarna. Succinylering reducerar antalet aminogrupper och ökar antalet karboxylgrupper, medan metylering har ingen effekt på aminogrupperna och reducerar antalet karboxylgrupper, jämfört med nativt kollagen (Figur 1B). Dessa modifieringar ändra laddningsegenskaperna hos kollagenmolekylerna. Succinylering avlägsnar positivt laddade grupper och ersätter dem med negativt laddade grupper, och metylering avlägsnar negativt laddade grupper (Figur 1C </ strong>).
Skikt för skikt avsättning av metylerade och succinylerade kollagenlösningar (COL LBL) skapar en ultratunn kollagenmatrissammansättning på toppen av laddade ytor, såsom celler (Figur 2A). Primära hepatocyter sådda på fibronektin-belagt glas inom en mikrofluidikanordning (Figur 2B) kan beläggas med ett sådant rent kollagenmatrissammansättning (fig 2C). Deponering av 10 dubbelskikt på celler skapar en kollagenskikttjocklek på cirka 140 nm (Figur 2D).
Den ultratunna kollagenenheten skikt avsatt med hjälp av COL LBL tekniken stabiliserar primära hepatocyter i mer än 14 dagar i mikrofluidikanordningar. Hepatocytes utan övre matris cover förlorar sin differentierade fenotyp, kontrakt, och lyft bort ytan av mikroflödessystem enheter över tiden (Fig. 3A-C). I motsats, hepatocyter täckt med ett ultratunt kollagenaggregat upprätthåln deras differentierade morfologi och polarisering under 14 dagar (Figur 3D-F). Viabiliteten hos cellerna hölls vid mer än 90% (Figur 3G-I). Dessutom ökade polariseringen av hepatocyterna behandlats med COL LBL över tid, visar utvecklingen av en apikal gallan canaliculära nätverk (Figur 3J-L).
Förutom cellviabilitet, morfologi, och polarisation, återvinner COL LBL Teknik och stabiliserar funktionen av primära hepatocyter på nivåer liknande de standardtekniker för celler i plattor. Utsöndringen av albumin av hepatocyter låg omedelbart efter plätering, och är fortsatt låg inte cellerna induceras att polarisera genom en matrisbeläggning. Efter COL LBL behandling, albuminutsöndring av Hepatocyterna ökar med 8-10 dagar innan stabiliserande (Figur 4A). Urea produktion omedelbart hög efter cellsådd och minskar över tiden i celler not täckt med en matris, stabiliserar ureaproduktion efter 8-10 dagar i hepatocyter stabiliserade med COL LBL (Figur 4B). Cytokrom P450 (CYP) enzymuttryck som svar på stimuli är en specialiserad funktion av hepatocyter. Induktion av CYP1A1 i hepatocyter som svar på tre-metylkolantren utvanns och stabiliserades upp till 14 dagar vid COL LBL behandling (Figur 4C).
Figur 1. råttsvanskollagen lösningar kemiskt modifierad för att skapa netto positivt eller netto negativt laddade polymerlösningar. (A) Schematisk representationer av succinylering och metyleringsreaktioner som modifierar karboxyl- och s-aminogrupperna, respektive. (B) Väte titreringskurva derivat som visar förändringar i det relativa antalet H + joner som behövs för att ändra lösningens pH efter collagen modifiering. (C) De nettoladdningar (medelvärde ± SD) av de modifierade kollagenlösningar beräknade från H + förskjutningar i (B) normaliserade till nativt kollagen. MC: metylerad kollagen. SC: succinylerat kollagen. AA: aminosyrarester. Re-print med tillstånd från 9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Layer-by-lager avsättning av modifierade kollagenlösningar skapat ett ultratunt koUagenmatris montering ovanpå hepatocyter. (A) Schematisk bild av hepatocyter sådda på fibronektin på en mikroanordning och inkuberats med omväxlande metylerade och succinylerade kollagenlösningar. TEM tvärsnitt av ombud (20 celler undersöktes per grupp) conkontroll (B) och COL LBL-behandlade (C) hepatocytes efter 2 dagars odling. Pilar: LBL kollagenskiktet. Skala bar:. 2 pm (D) COL LBL skikttjocklek (medelvärde ± SD) per cell mätt från TEM-bilder (n = 20 celler från 4 enheter). Modifierad från 9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. COL LBL tekniken underhålls hepatocyte morfologi, livskraft, och polariseringen i mikrokomponenter under 14 dagar i odling. Hepatocytes utan toppskikt i mikrokomponenter (negativ kontroll) kontrakt och lyft bort ytan med tiden (A-C). LBL avsättning av modifierade kollagener upprätthåller hepatocyte morfologi (D-F) och VIABbilitet (G-I) i mikrokomponenter över 14 dagar. CMFDA är ett generiskt cellmarkör som finns kvar i cytoplasman hos icke-polariserade hepatocyter (J). Med tiden kan utvecklingen av gallcanaliculi ses av utsöndringen av fluoroforen till canaliculära utrymmen (K) som utvecklas runt cellerna över tid (L). Bildskalan bar: 100 pm. Infälld skala bar: 50 pm. Modifierad från 9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. COL LBL stabiliserar hepatocyte albumin och urea avsnitt och CYP aktivitet under 14 dagar i mikrofluidikanordningar. (A) Albumin utsöndring av hepatocyter i COL LBL startade låg och ökade med tiden until nå en platå vid dag 10 (B) Urea utsöndring av COL LBL hepatocytes minskade med tiden tills den når en platå vid dag 10. (C) Induktion av CYP1A aktiviteten var låg på dag 2, men signifikant ökad vid dag 7, en nivå som upprätthölls genom dag 14. Medelvärde ± SEM; COL LBL: hepatocytes odlade efter LBL koUagendeposition; NoTop: hepatocytes odlade med ingen topp matrisskikt; n = 6-8 enheter. Modifierad från 9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ultratunna ren kollagenaggregat kan deponeras på laddade celler eller materialytor med hjälp av lager-på-lager avsättning av modifierade kollagener. Resultaten av denna studie visar att metylering och succinylering av nativt kollagen skapar polykatjoniska och polyanjoniska kollagenlösningar (fig 1) som kan användas med det lager-på-lager-tekniken att deponera ultratunna kollagenmatrisaggregaten på celler (figur 2) eller andra laddade materialytor. Sådana ultratunna matrisskikt kan stabilisera morfologin, livskraft, och polarisering av celler såsom hepatocyter (Figur 3), efter sådd i mikrofluidikanordningar, liksom deras funktion (Figur 4).
För framgångsrik avsättning av ultratunna kollagenskikt, modifieringsreaktioner skapar de metylerade och succinylerade kollagener är kritiska. Eftersom karboxylgruppen metyleringsreaktionen inte är gynnsamt, denkollagen metyleringsreaktionen måste utföras i surgjord metanol för att driva reaktionen framåt, baserat på Le Chatelier princip. Därför är det viktigt att avlägsna allt överskottsvatten från kollagenet efter pH-utskiljning före upplösning av den utfällda kollagenet i surgjord metanol i syfte att öka reaktionseffektiviteten. För succinylering reaktionen är kritisk bibehålla lösningens pH över 9 under tillsats av bärnstenssyraanhydrid i aceton. Kontinuerlig övervakning av pH och långsam tillsats av den bärnstenssyraanhydrid acetonlösning är till hjälp för att säkerställa en effektiv reaktion. Under lager-för-lager avsättning, är det viktigt att minimera den tid som cellerna gå utan medier. Tillvägagångssättet för 10 dubbelskikt tar ungefär 20 minuter, vilket är ungefär lika länge som de flesta celler bör inte media utanför inkubatorn. Om mer än 10 dubbelskikt måste deponeras, vila cellerna i media i en inkubator för 3-4 timmar mellan collaGen nedfall att säkerställa hälsan hos cellerna. Vid den andra ytterligheten, kommer alltför få skikt inte vara effektiva för att upprätthålla cellmorfologi. I våra tester, gjorde 3 lager inte behålla cellmorfologin, medan 10 lagren gjorde.
Flera ändringar kan göras till de förfaranden för att felsöka problem. Tiden och temperaturen för metyleringsreaktionen kan varieras om problem uppstår. Exempelvis minskning av reaktionstemperaturen till 4 ° C och ökar tiden till 7 dagar kan öka effektiviteten. Också, beroende på omfattningen av polymerisation under pH-utvinning, kollagen kommer ibland fullständigt lösas upp i surgjord metanol under metyleringsreaktionen. Om detta inträffar, tillsätt 10 M NaOH för att bringa pH upp till 9-10 efter att reaktionen har slutförts för att fälla ut kollagen, så att den kan pelleteras under nästa steg. Vid tillämpning av det skikt-för-skikt avsättning i mikrofluidikanordningar kan små kanaler eller portar bli clogged med kollagen, som indikeras av en ökning i anordningen fluidmotståndet. Spolning enheten med färskt medium bör ta bort eventuella blockeringar, vilket gör avsättning för att fortsätta.
Den manuella avsättningen av skikt-för-skikt kollagen såsom beskrivits här är en begränsning i termer av skalning och automatisering av mikrofluidikanordningar. Emellertid är denna teknik kompatibel med standardmikroflödes maskinvara, inklusive ventiler och pumpar som kan användas för att automatisera den teknik och förbereda uppsättningar av enheter samtidigt. En annan begränsning hos denna teknik för användning i plattkultur är att den kräver en relativt stor mängd av nativt kollagen. För mikroflödes ansökan, kan volymerna av metylerade och succinylerad kollagen användas för att skapa ultratunna kollagenskikt i många enheter. Med standardvävnadsplatta kultur, å andra sidan, de volymer som krävs för att belägga brunnarna blir mer oöverkomliga med ökande väl storlek.
Denna Layerav lager teknik för avsättning av ultratunna kollagenmatrisskikt skulle kunna utvecklas ytterligare genom användning av alternativa eller funktionella förändringar, samt genom att skapa flera lager av celler åtskilda av de tunna matrisaggregaten. Även om relativt enkla aminosyrasidokedja modifieringsreaktioner av metylering och succinylering användes här, kan alternativa eller kompletterande reaktioner användas i stället för att skapa funktionaliserade kollagener. De funktionaliserade sidokedjor bör ändå ge proteiner med nettogenomgående positiva och negativa laddningar, men en sådan funktionalisering kan vara användbara för en mängd olika tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen type I, rat tail | Life Technologies | A1048301 | option for concentrated rat tail collagen |
| collagen type I, rat tail | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | option for concentrated rat tail collagen |
| collagen type I, rat tail | EMD Millipore | 08-115 | option for concentrated rat tail collagen |
| collagen type I, rat tail | R%D Systems | 3440-100-01 | option for concentrated rat tail collagen |
| succinic anhydride | Sigma-Aldrich | 239690-50G | succinylation reagent |
| anhydrous methanol | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | methylation reagent |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | pH precipitation reagent |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 320331-500ML | pH precipitation reagent |
| rat collagen type I ELISA | Chondrex | 6013 | option for detecting collagen content |
| hydroxyproline assay kit | Sigma-Aldrich | MAK008-1KT | option for detecting collagen content |
| hydroxyproline assay kit | Quickzyme Biosciences | QZBtotcol1 | option for detecting collagen content |
References
- Pedersen, J. A., Swartz, M. A. Mechanobiology in the third dimension. Ann Biomed Eng. 33 (11), 1469-1490 (2005).
- Glowacki, J., Mizuno, S. Collagen scaffolds for tissue engineering. Biopolymers. 89 (5), 338-344 (2008).
- Vescio, R. A., et al. In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture. PNAS. 84, 5029-5033 (1987).
- Chandrasekaran, S., Guo, N. -h, Rodrigues, R. G., Kaiser, J., Roberts, D. D. Pro-adhesive and chemotactic activities of thrombospondin-1 for breast carcinoma cells are mediated by α3β1 integrin and regulated by insulin-like growth factor-1 and CD98. J Biol Chem. 274 (16), 11408-11416 (1999).
- Chen, S. S., et al. Multilineage differentiation of rhesus monkey embryonic stem cells in three‐dimensional culture systems. Stem Cells. 21 (3), 281-295 (2003).
- Whelan, M. C., Senger, D. R. Collagen I initiates endothelial cell morphogenesis by inducing actin polymerization through suppression of cyclic AMP and protein kinase A. J Biol Chem. 278 (1), 327-334 (2003).
- Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Long-term in vitro function of adult hepatocytes in a collagen sandwich configuration. Biotechnol Prog. 7 (3), 237-245 (1991).
- Decher, G. Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites. Science. 277, 1232-1237 (1997).
- McCarty, W. J., et al. A novel ultrathin collagen nanolayer assembly for 3-D microtissue engineering: Layer-by-layer collagen deposition for long-term stable microfluidic hepatocyte culture. TECHNOLOGY. 2 (01), 67-74 (2014).
- Swierczewska, M., et al. Cellular response to nanoscale elastin-like polypeptide polyelectrolyte multilayers. Acta Biomater. 4 (4), 827-837 (2008).
- Kim, Y., Larkin, A. L., Davis, R. M., Rajagopalan, P. The design of in vitro liver sinusoid mimics using chitosan-hyaluronic acid polyelectrolyte multilayers. Tissue Eng Pt A. 16 (9), 2731-2741 (2010).
- Larkin, A. L., Rodrigues, R. R., Murali, T., Rajagopalan, P. Designing a Multicellular Organotypic 3D Liver Model with a Detachable, Nanoscale Polymeric Space of Disse. Tissue Eng Pt C. 19 (11), 875-884 (2013).
- Kidambi, S., et al. Patterned Co‐Culture of Primary Hepatocytes and Fibroblasts Using Polyelectrolyte Multilayer Templates. Macromol Biosci. 7 (3), 344-353 (2007).
- Janorkar, A. V., Rajagopalan, P., Yarmush, M. L., Megeed, Z. The use of elastin-like polypeptide-polyelectrolyte complexes to control hepatocyte morphology and function in vitro. Biomaterials. 29 (6), 625-632 (2008).
- Piez, K. A., Eigner, E. A., Lewis, M. S. The Chromatographic Separation and Amino Acid Composition of the Subunits of Several Collagens*. Biochemistry. 2 (1), 58-66 (1963).
- Tanford, C. The interpretation of hydrogen ion titration curves of proteins. Adv Protein Chem. 17, 69-165 (1962).
- Cayot, P., Tainturier, G. The quantification of protein amino groups by the trinitrobenzenesulfonic acid method: a reexamination. Anal Biochem. 249 (2), 184-200 (1997).
- Kakade, M. L., Liener, I. E. Determination of available lysine in proteins. Anal Biochem. 27 (2), 273-280 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
