Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

קולגן שכבת הפקדת-ידי שכבה במכשירי microfluidic לMicrotissue ייצוב

doi: 10.3791/53078 Published: September 29, 2015

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. הכנת הפתרון המקומי מסיס קולגן

  1. הכן או לרכוש 200 מ"ג של acidified, מסיס, סוג אני קולגן מזנבות עכברים ב1-3 מ"ג / מיליליטר באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים בידוד, כגון שדווח על ידי et al Piez. 15
  2. קנה מידה של כמות חומר מוצא מבוסס על רצוי סוף הנפח של פתרונות קולגן שונה. כ לעשות 25-30 מיליליטר של מפוגל ו25-30 מיליליטר של פתרונות קולגן succinylated, כל 3 מ"ג / מיליליטר, 200 מ"ג משל קולגן ילידים המסיס.

2. מתילציה קולגן

  1. לדלל של הפתרון המקומי, acidified (pH 2-3) קולגן 100 מ"ג לריכוז של 0.5 מ"ג / מיליליטר עם מים סטריליים קרים כקרח ולשמור על הפתרון על קרח כדי למנוע gelation.
  2. התאם את ה- pH של תמיסת קולגן ל9-10 עם כמה טיפות של 1 N NaOH ומערבבים על RT למשך 30 דקות. שים לב למשקע קולגן, גורם פתרון להפך מעונן. ספין למטה פתרון קולגן זירז ב3,000 × גרם במשך 25 דקות. משקע ברור, כמו ג'ל צריך להיות גלוי בחלק התחתון של הצינורות. לשאוב והשלכה נכונה של נוזל supernatant.
  3. Resuspend קולגן זירז ב200 מיליליטר של מתנול עם 0.1 N HCl ולאפשר תגובת מתילציה להתרחש עם ערבוב על RT במשך 4 ימים. קולגן לא לפזר, אבל צריך להתפרק לחתיכות קטנות מאוד גלויות שיהפוך את פתרון מעונן.
  4. לאחר מתילציה, צנטריפוגה הפתרון ב3,000 × גרם במשך 25 דקות עד גלולה קולגן מפוגל. לשאוב ולהיפטר supernatant מתנול acidified.
  5. ממיסים את קולגן מפוגל ב 25 מיליליטר של PBS סטרילי, נותן ריכוז של כ 3 מ"ג / מיליליטר, עם pipetting החוזר והנשנה, ולסנן את הפתרון דרך מסננת תא 60 מיקרומטר. התאם את ה- pH של הפתרון ל7.3-7.4 באמצעות 20 μl מרווחים של 1 N NaOH.
  6. להעריך את concentration של הפתרון באמצעות ערכת ELISA קולגן העכברוש המסחרי או ערכת assay hydroxyproline. לדלל את הפתרון עד 3 מ"ג / מיליליטר עם PBS סטרילי.
  7. לעקר את פתרון קולגן מפוגל על ​​ידי העברתו לבקבוק זכוכית עם מכסה בורג, שכבות בזהירות 3 מיליליטר של כלורופורם בתחתית הבקבוק, לאפשר את הבקבוק להגדיר O / N ב 4 ° C, ולאחר מכן להסיר את הסביבה נקיה מחיידקים ולאחסן שכבה עליונה, שהוא קולגן מפוגל.
  8. אחסן את הפתרון ב- C ° 4 לשימוש בתוך 1 חודש.

3. קולגן Succinylation

  1. לדלל של הפתרון המקומי, acidified (pH 2-3) קולגן 100 מ"ג האחר לריכוז של 0.5 מ"ג / מיליליטר עם מים סטריליים קרים כקרח ולשמור על הפתרון על קרח כדי למנוע gelation.
  2. התאם את ה- pH של תמיסת קולגן ל9-10 עם כמה טיפות של 1 N NaOH ומערבבים על RT למשך 30 דקות. קולגן צריך לזרז, גורם פתרון להפך מעונן.
  3. Dissolve 40 מ"ג של sucאנהידריד cinic (0.4 מ"ג לכל מ"ג של קולגן) ב 10 מיליליטר של אצטון (1/20 ה הנפח של פתרון קולגן). לאט לאט (בכ 0.5 מיליליטר במרווחים) להוסיף את תערובת לפתרון קולגן עם ערבוב תוך מעקב pH ברציפות. לשמור על pH מעל 9.0 על ידי הוספת טיפות 1 או 2 של 1 N NaOH כpH 9.0 גישות.
  4. ממשיך לבחוש בRT עבור 120 דקות לאחר הוספת כל אנהידריד succinic באצטון. שים לב לפתרון ליתברר כקולגן succinylated מתמוסס. מעת לעת לבדוק את ה- pH כדי להבטיח שהיא נשארת מעל 9.0.
  5. התאם את ה- pH של התמיסה עד 4.0 עם 20 מרווחי μl של 1 N HCl. שים לב לפתרון מעונן שוב, כמו קולגן succinylated משקעים.
  6. לאחר succinylation, צנטריפוגה הפתרון ב3,000 × גרם במשך 25 דקות עד גלולה קולגן succinylated. לשאוב ולהיפטר supernatant acidified עם אנהידריד succinic unreacted.
  7. ממס את קולגן succinylatedב 25 מיליליטר של PBS סטרילי, נותן ריכוז של כ 3 מ"ג / מיליליטר, עם pipetting החוזר והנשנה, ולסנן את הפתרון דרך מסננת תא 60 מיקרומטר. התאם את ה- pH של הפתרון ל7.3-7.4 באמצעות 20 μl מרווחים של 1 N NaOH.
  8. להעריך את הריכוז של הפתרון באמצעות ערכת ELISA עכברוש קולגן מסחרי או ערכת assay hydroxyproline. לדלל את הפתרון עד 3 מ"ג / מיליליטר עם PBS סטרילי.
  9. לעקר את פתרון קולגן succinylated על ידי העברתו לבקבוק זכוכית עם מכסה בורג, שכבות בזהירות 3 מיליליטר של כלורופורם בתחתית הבקבוק, לאפשר את הבקבוק להגדיר O / N ב 4 ° C, ולאחר מכן להסיר את הסביבה נקיה מחיידקים ולאחסן שכבה עליונה, שהוא קולגן succinylated.
  10. אחסן את הפתרון ב- C ° 4 לשימוש בתוך 1 חודש.

4. אימות של שינויי קולגן

  1. הכן 1 מיליליטר דגימות מכל אחת מפתרוני קולגן ילידים, מפוגלים, וsuccinylated ולדלל לקונצרט כלשהוentration של 0.1 מ"ג / מיליליטר עם מים טהורים סטרילי לטיטרציה יון מימן. בהמשך לדלל החיץ לפחות 1,000 פי ידי דיאליזה נגד מים באמצעות 10 הפסקת membraneusing 3 שינויי פתרון kDa לפחות 4 שעות כל אחד.
  2. התאם את ה- pH של הפתרונות ל7.3 עם כמויות קטנות של NaOH וHCl. באמצעות pH 7.3 כהתייחסות שרירותית, לבצע טיטרציה יון מימן על כל אחד מהדגימות כפי שתואר על ידי Tanford 16 כדי ליצור עקומות טיטרציה לפתרונות קולגן ילידים, מפוגלים, וsuccinylated.
  3. עלילה השינוי ברמת חומציות לכל נפח של חומצה הוסיף לעומת המספר של H + יונים לכל מולקולה הקשורה. טווח "האמין" pH הגבוה צריך להראות שינוי בקולגן succinylated לעבר הנקודה הניטרלית (הפסד של קבוצות האמינים), והמגוון "carboxyl" pH הנמוך צריך להראות משמרת שמאלה בקולגן מפוגל (הפסד של קבוצות carboxyl ) ותזוזה ימינה בקולגן succinylated (רווח בקבוצת carboxylים), בהשוואה לקולגן הטבעי.
  4. להעריך את היעילות של תגובת succinylation ידי קביעת% מקבוצות אמינו בקולגן הילידים הוחלף על ידי succinylation בשיטת חומצת 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic (TNBA) colorimetric, הבאים פרוטוקולים סטנדרטיים 17,18.

5. ייצור של מכשירי microfluidic וזריעת תאים

  1. לפברק מכשירי microfluidic תוך שימוש בשיטות סטנדרטית 9. השתמש בדפוס העתק של PDMS מSU-8 מאסטרים על סיליקון המוגדר באמצעות photolithography ליצור תאי תרבית תאי microfluidic עם 100 מיקרומטר גבוה, רחב .4-1.5 מ"מ, ו1-10 מ"מ ערוצים ארוכים לצמיחת תאים.
  2. השתמש בשואב פלזמה לחמצן את המשטחים של המכשיר ושקופיות זכוכית, ולאחר מכן לחץ יחד כדי אג"ח. לאחר חיטוי המכשיר על ידי חשיפה לאור UV במשך לפחות 30 דקות, למלא את התא עם 50 מיקרוגרם / מיליליטר פיברונקטין בPBS סטרילי ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות. זרעי המכשיר עם תאים, כגון חולדה ראשונית או hepatocytes אדם, אשר דורשים ג'ל קולגן לייצוב של פנוטיפ או מדינת בידול. אנו משתמשים 20 μl של hepatocytes מבודד טרי עכברוש עיקרי 7,19 או hepatocytes האנושי הראשוני cryopreserved זמין מסחרי זרע בגיל 14 × 10 6 תאים / מיליליטר למכשיר.
  3. אפשר התאים לצרף במשך 4-6 שעות, ולאחר מכן לשטוף את התאים פנויים ולהחליף את התקשורת עם ציפוי תקשורת צמיחה. דגירה O / N כדי להבטיח תא מלא מתפשט וליצור monolayer ומחוברות של תאים.

6. שכבה אחר שכבה קולגן הפקדת

  1. בשכונת תרביות רקמת זרימה למינרית, להכין כמויות מספיקות של פתרונות קולגן מפוגלים וsuccinylated במשך 10 יישומים של כל פתרון לכל מכשיר, כמו גם כמה MLS של תקשורת. שמור את הפתרונות על קרח. אנו משתמשים 20 μl (10-15 פעמים בסך הכל מכשיר נפח) של קולגן לכל שכבה לכל מכשיר.
  2. להיותginning עם הפתרון מפוגל (polycationic), חלופי שטיפת המכשירים עם 20 μl של מפוגל ולאחר מכן succinylated פתרונות קולגן, מחכה דק '1 בין כל יישום. לשטוף את המכשיר בסך הכל 10 פעמים בפתרון, שאמורה לקחת כ -20 דקות. לעבוד במהירות כדי לצמצם את כמות הזמן שהתאים ללא תקשורת.
  3. שים לב קולגן לצבור לאט בכניסה / היציאה בהתאם לגודלה. אם ההתנגדות לזרימת נוזל עליות, לשטוף את המכשיר פעם או פעמיים עם תקשורת, ולאחר מכן להמשיך שכבות.
  4. לאחר החלת כל השכבות, לשטוף את המכשיר פעמיים עם תקשורת טרי ולחזור לחממה. בהתאם לסוג התא, השינויים תאיים הנגרמת המטריצה ​​מורפולוגיים, כמו קיטוב משופר בhepatocytes, צריכים להיות גלויים בתוך כמה שעות.
  5. הכן מכשירי נציג למיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים באמצעות שיטות סטנדרטי 9 כדי לאמת את הנוכחות של מטריצת קולגןהרכבה על גבי התאים בתרבית.

7. ייצוב של הפנוטיפ תא ותפקוד

  1. תמונת מורפולוגיה תא, כדאיות, וקוטביות בשיטות סטנדרטית לסוג התא. לhepatocytes, לאסוף תמונות מעל 14 ימים באמצעות מיקרוסקופ שלב, מכתים חי / מת כדאיות, וצבע CMFDA לקיטוב הפסגה כדי להדגים את ההשפעות של תצהיר קולגן.
  2. למורפולוגיה תא, לשטוף את המכשיר דרך הכניסה על ידי פיפטה עם 20 μl של PBS לשטוף, להזריק 20 μl של PBS, ותמונת המכשיר באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב.
  3. עבור מכתים חי / מת, שטוף את המכשיר דרך הכניסה על ידי פיפטה עם 20 μl של PBS לשטוף, להזריק 20 μl של פתרון בשידור חי / מת מכתים עם DAPI הכין הבאים הוראות היצרן, דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לשטוף מכשיר שוב עם 20 μl של PBS, ותמונת המכשיר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  4. לקנלי מרהצביעת culi, לשטוף את המכשיר דרך הכניסה על ידי פיפטה עם 20 μl של PBS לשטוף, להזריק 20 μl של 2 פתרון מכתים מיקרומטר CMFDA עם DAPI הכין הבאים הוראות היצרן, דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לשטוף את המכשיר שוב עם 20 μl של PBS, ותמונת המכשיר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  5. לאסוף את התקשורת בילתה ולמדוד מוצרי חילוף חומרים תאיים בנקודות זמן מתאימות על משך התרבות כדי לקבוע את תפקוד התא. לhepatocytes, למדוד את הכמות של אלבומין ואוריאה בתקשורת בילתה.
  6. לבצע ניתוחים תפקודיים נקודות קצה בתאים עצמם, כגון רמות הערכת אנזים פעילות, מכתים נוגדן, או ניתוח RNA. לhepatocytes, לעורר ולמדוד את פעילות אנזים ציטוכרום P450 או שלב S-transferase גלוטתיון האנזים השני הצמידה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

קולגן ילידים יכול להיות שונה באמצעות מתילציה וsuccinylation ליצור פתרונות קולגן polycationic וpolyanionic לשימוש בתצהיר שכבה אחר שכבה. Succinylation משנה את קבוצות ε-אמינו של קולגן יליד עם קבוצות succinyl, ומתילציה משנה את קבוצות carboxyl של קולגן יליד עם קבוצה מתיל (איור 1 א). שינויים אלה לרשתות בצד חומצת אמינו חלבון קולגן לשנות את עקומות טיטרציה pH לפתרונות. Succinylation מפחית את מספר קבוצות אמינו ומגדיל את מספר קבוצות carboxyl, בעוד מתילציה אין כל השפעה על קבוצות אמינו ומפחיתה את מספר קבוצות carboxyl, בהשוואה לילידי קולגן (איור 1). שינויים אלה לשנות את המאפיינים אחראים על מולקולות קולגן. Succinylation מסיר קבוצות טעונות חיובי ומחליפה אותם בקבוצות טעונות שלילי, ומתילציה מסירה קבוצות טעונות שלילי (איור 1 ג </ Strong>).

בתצהיר שכבה אחר שכבה של הפתרונות מפוגלים וsuccinylated קולגן (COL LBL) יוצר הרכבה מטריצת קולגן Ultrathin על גבי משטחים טעונים, כגון תאים (איור 2 א). hepatocytes העיקרי זרע על זכוכית מצופה פיברונקטין בתוך מכשיר microfluidic (איור 2) יכול להיות מצופה עם הרכבה מטריצה ​​טהורה קולגן כגון (איור 2 ג). בתצהיר של 10 bilayers על תאים יוצר עובי שכבת הקולגן של כ 140 ננומטר (איור 2 ד).

שכבת ההרכבה קולגן Ultrathin שהופקדה באמצעות טכניקת COL LBL מייצבת hepatocytes העיקרי במשך 14 ימים במכשירי microfluidic. Hepatocytes ללא כיסוי מטריצה ​​עליון לאבד פנוטיפ, החוזה המובחן שלהם, ולהרים את פני השטח של מכשירי microfluidic לאורך זמן (איור. 3 א-ג). לעומת זאת, hepatocytes מכוסה maintai ההרכבה קולגן Ultrathinn המורפולוגיה שלהם מובחנת וקיטוב מעל 14 ימים (איור 3D-F). הכדאיות של התאים נשמרה בגדולה מ -90% (איור 3G-I). בנוסף, הקיטוב של hepatocytes טופל בCOL LBL גדל לאורך זמן, מראה התפתחות של רשת canalicular מרה הפסגה (איור 3J-L).

בנוסף לכדאיויות תא, מורפולוגיה, וקיטוב, טכניקת COL LBL מתאוששת ומייצבת את התפקוד של hepatocytes העיקרי ברמות דומות לטכניקות סטנדרטי לתאים בצלחות. הפרשת אלבומין ידי hepatocytes היא נמוכה באופן מיידי לאחר ציפוי, ונשארה נמוך, אלא אם כן התאים מושרה לקטב דרך כיסוי מטריצה. לאחר טיפול COL LBL, הפרשת אלבומין בעליות hepatocytes על 8-10 ימים לפני הייצוב (איור 4 א). ייצור אוריאה הוא מייד גבוה לאחר זריעת תאים ופוחת עם זמן בתאי nOT מכוסה במטריצה, ייצור אוריאה מייצב לאחר 8-10 ימים בhepatocytes התייצב עם COL LBL (איור 4). ציטוכרום P450 (CYP) ביטוי אנזים בתגובה לגירויים הוא פונקציה מיוחדת אחד hepatocytes. האינדוקציה של CYP1A1 בhepatocytes בתגובה ל3-methylcholanthrene הייתה התאוששה והתייצבה עד 14 ימים על ידי טיפול COL LBL (איור 4C).

איור 1
1. פתרונות קולגן זנב איור עכברוש היו שינוי כימי כדי ליצור נטו חיובי או נטו טעון שלילי פתרונות פולימר. () ייצוגים סכמטי של תגובות succinylation ומתילציה שמשנות קבוצות carboxyl וε-אמינו, בהתאמה. נגזרים (B) טיטרציה מימן עקומה מראים שינויים במספרים היחסי של H + יונים הדרושים כדי לשנות pH פתרון לאחר colשינוי Lagen. (ג) החיובים נטו (ממוצע ± SD) של הפתרונות שונה קולגן מחושבים מH + המשמרות ב( B) מנורמלים לקולגן הטבעי. MC: מפוגל קולגן. SC: קולגן succinylated. א.א.: שאריות חומצת אמינו. Re-ההדפסה באישור 9. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. בתצהיר שכבה אחר שכבה של פתרונות קולגן שונה יצר הרכבה מטריצת קולגן Ultrathin על גבי hepatocytes. ייצוג סכמטי של hepatocytes זורעים על פיברונקטין על microdevice וטופחו לסירוגין עם פתרונות קולגן מפוגלים וsuccinylated (). חתכי TEM של נציג (20 תאים שנבדקו בכל קבוצה) קוןטופל LBL Trol (B) וCOL hepatocytes (ג) לאחר 2 ימים של התרבות. חיצים: שכבת הקולגן LBL. בר סולם:. 2 מיקרומטר עובי (ד) COL LBL שכבה (ממוצע ± SD) לכל תא שנמדד מתמונות TEM (n = 20 תאים מ4 מכשירים). השתנה מ -9. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. טכניקת COL LBL נשמר מורפולוגיה hepatocyte, כדאיות, וקיטוב בmicrodevices מעל 14 ימים בתרבות. Hepatocytes ללא שכבה עליונה בmicrodevices חוזה (שליטה שלילית) ולהרים את פני השטח לאורך זמן (ב- C). בתצהיר של LBL collagens שונה שומר על מורפולוגיה hepatocyte (D-F) וviability (G-I) בmicrodevices מעל 14 ימים. CMFDA הוא סמן תא כללי שנשאר בציטופלסמה של hepatocytes-מקוטב שאינם (J). לאורך זמן, פיתוח canaliculi מרה ניתן לראות את ההפרשה של fluorophore לחללי canalicular (K) המתפתחים סביב התאים לאורך זמן (L). בר תמונה בקנה מידה: 100 מיקרומטר. בר הבלעה קנה מידה: 50 מיקרומטר. השתנה מ -9. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Figure4
איור 4. COL LBL מייצב אלבומין hepatocyte וחתכים אוריאה ופעילות CYP מעל 14 ימים במכשירי microfluidic. () הפרשת אלבומין ידי hepatocytes בCOL LBL התחילה נמוכה וגדלו עם זמן until להגיע לרמה 10. בהפרשת היום (ב ') על ידי האוריאה hepatocytes COL LBL ירד עם זמן עד שמגיע לרמה ביום 10. (ג) הגיוס של פעילות CYP1A היה נמוך ביום 2, אבל גדלו באופן משמעותי ביום 7, רמה שנשמרה באמצעות יום 14. הממוצע ± SEM; COL LBL: hepatocytes תרבית לאחר תצהיר קולגן LBL; NoTop: hepatocytes מתורבת ללא שכבת מטריצה ​​עליונה; n = 6-8 מכשירים. השתנה מ -9. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ניתן להפקיד מכלולי קולגן הטהור Ultrathin על תאים טעונים או surfaces חומר באמצעות תצהיר שכבה אחר שכבה של collagens שונה. תוצאות מחקר זה מראות כי מתילציה וsuccinylation של קולגן ילידים ליצור פתרונות קולגן polycationic וpolyanionic טעון (איור 1) שניתן להשתמש בו עם טכניקת שכבה אחר שכבה להפקיד מכלולי מטריצת קולגן Ultrathin על תאים (איור 2) או אחר surfaces חומר. שכבות מטריצת Ultrathin כזה יכול לייצב את המורפולוגיה, כדאיות, והקיטוב של תאים כגון hepatocytes (איור 3), לאחר זריעה במכשירי microfluidic, כמו גם תפקידם (איור 4).

לתצהיר מוצלח של שכבות קולגן Ultrathin, תגובות שינוי יצירת collagens מפוגל וsuccinylated הן קריטיות. בגלל תגובת מתילציה קבוצת carboxyl אינה חיובית,תגובת מתילציה קולגן חייבת להתבצע במתנול acidified לנהוג התגובה קדימה, המבוססת על העיקרון לה שטלייה. לכן, חשוב להסיר את כל עודפי המים מקולגן לאחר המשקעים pH לפני פירוק קולגן זירז במתנול acidified כדי להגביר את יעילות התגובה. לתגובת succinylation, שמירה על ה- pH של התמיסה מעל 9 תוך הוספת אנהידריד succinic באצטון היא קריטית. ניטור רציף של רמת החומציות ובנוסף איטיים של פתרון אצטון אנהידריד succinic מועיל להבטחת תגובה יעילה. במהלך בתצהיר שכבה אחר שכבה, זה קריטי כדי לצמצם את הזמן שהתאים ללכת בלי תקשורת. ההליך במשך 10 bilayers לוקח כ -20 דקות, שזה בערך כל עוד רוב התאים צריכים להיות בלי תקשורת מחוץ לחממה. אם יש להפקיד יותר מ -10 bilayers, לנוח תאים בתקשורת באינקובטור במשך 3-4 שעות בין collaתצהירי ג'ן להבטיח את בריאותם של התאים. בקצה השני, מעט מדי שכבות לא תהיינה יעילות בשמירה על המורפולוגיה של תאים. בבדיקה שלנו, 3 שכבות לא לשמור על מורפולוגיה של תאים, ואילו 10 שכבות עשו.

כמה שינויים יכולים להתבצע לנהלים לפתרון בעיות. יכולים להיות מגוונת הזמן והטמפרטורה של תגובת מתילציה אם מתעוררות בעיות. לדוגמא, הפחתת טמפרטורת התגובה ל4 מעלות צלזיוס ולהגדיל את הזמן עד 7 ימים עשויים להגביר את היעילות. כמו כן, בהתאם לבמהלך חילוץ pH המידה של פילמור, קולגן לפעמים לפזר באופן מלא במתנול acidified במהלך תגובת מתילציה. במקרה זה, להוסיף 10 M NaOH להביא את ה- pH עד 9-10 לאחר התגובה השלימה כדי לזרז את קולגן כדי שניתן יהיה pelleted במהלך השלב הבא. תוך יישום תצהיר שכבה אחר שכבה במכשירי microfluidic, ערוצים קטנים או יציאות יכולים להיות CLogged עם קולגן, שצוין על ידי עלייה בהתנגדות fluidic המכשיר. שטיפת המכשיר עם תקשורת טרי צריכה להסיר כל חסימות, ומאפשר להמשיך בתצהיר.

בתצהיר הידני של קולגן שכבה אחר שכבה כפי שמתואר כאן הוא מגבלה במונחים של קנה המידה והאוטומציה של מכשירי microfluidic. עם זאת, טכניקה זו היא תואמת עם חומרה סטנדרטית microfluidic, לרבות שסתומים ומשאבות שיכולים לשמש כדי להפוך את הטכניקה ולהכין מערכים של התקנים בבת אחת. מגבלה נוספת של טכניקה זו לשימוש בתרבות צלחת היא שזה דורש כמות גדולה יחסית של קולגן ילידים. ליישום microfluidic, הכרכים של collagens מפוגל וsuccinylated יכולים לשמש ליצירת שכבות קולגן Ultrathin במכשירים רבים. עם תרבות צלחת רקמה סטנדרטית, לעומת זאת, ההיקפים הנדרשים לבארות מעיל הפכו מונע יותר עם עלייה בגודל טוב.

layer- זהטכניקה על ידי שכבה לתצהיר של שכבות מטריצת קולגן Ultrathin ניתן לפתח עוד יותר על ידי שימוש בשינויים חלופיים או פונקציונליים, כמו גם על ידי יצירת מספר שכבות של תאים המופרדים באסיפות המטריצה ​​דקות. למרות תגובות שינוי שרשרת צד פשוטות יחסית של חומצות אמינו של מתילציה וsuccinylation שמשו כאן, תגובות חלופיות או נוספות יכולות לשמש במקום על מנת ליצור collagens פונקציונליות. Sidechains פונקציונליות עדיין צריך להניב חלבונים עם מטענים חיוביים ושליליים הכוללים רשת, אבל functionalization כזה עשוי להיות שימושי עבור מגוון רחב של יישומים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
collagen type I, rat tail Life Technologies A1048301 option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail Sigma-Aldrich C3867-1VL option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail EMD Millipore 08-115 option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail R%D Systems 3440-100-01 option for concentrated rat tail collagen
succinic anhydride Sigma-Aldrich 239690-50G succinylation reagent
anhydrous methanol Sigma-Aldrich 322415-100ML methylation reagent
sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881-500G pH precipitation reagent
hydrochloric acid Sigma-Aldrich 320331-500ML pH precipitation reagent
rat collagen type I ELISA Chondrex 6013 option for detecting collagen content
hydroxyproline assay kit Sigma-Aldrich MAK008-1KT option for detecting collagen content
hydroxyproline assay kit Quickzyme Biosciences QZBtotcol1 option for detecting collagen content

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pedersen, J. A., Swartz, M. A. Mechanobiology in the third dimension. Ann Biomed Eng. 33, (11), 1469-1490 (2005).
  2. Glowacki, J., Mizuno, S. Collagen scaffolds for tissue engineering. Biopolymers. 89, (5), 338-344 (2008).
  3. Vescio, R. A., et al. In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture. PNAS. 84, 5029-5033 (1987).
  4. Chandrasekaran, S., Guo, N. -h, Rodrigues, R. G., Kaiser, J., Roberts, D. D. Pro-adhesive and chemotactic activities of thrombospondin-1 for breast carcinoma cells are mediated by α3β1 integrin and regulated by insulin-like growth factor-1 and CD98. J Biol Chem. 274, (16), 11408-11416 (1999).
  5. Chen, S. S., et al. Multilineage differentiation of rhesus monkey embryonic stem cells in three‐dimensional culture systems. Stem Cells. 21, (3), 281-295 (2003).
  6. Whelan, M. C., Senger, D. R. Collagen I initiates endothelial cell morphogenesis by inducing actin polymerization through suppression of cyclic AMP and protein kinase A. J Biol Chem. 278, (1), 327-334 (2003).
  7. Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Long-term in vitro function of adult hepatocytes in a collagen sandwich configuration. Biotechnol Prog. 7, (3), 237-245 (1991).
  8. Decher, G. Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites. Science. 277, 1232-1237 (1997).
  9. McCarty, W. J., et al. A novel ultrathin collagen nanolayer assembly for 3-D microtissue engineering: Layer-by-layer collagen deposition for long-term stable microfluidic hepatocyte culture. TECHNOLOGY. 2, (01), 67-74 (2014).
  10. Swierczewska, M., et al. Cellular response to nanoscale elastin-like polypeptide polyelectrolyte multilayers. Acta Biomater. 4, (4), 827-837 (2008).
  11. Kim, Y., Larkin, A. L., Davis, R. M., Rajagopalan, P. The design of in vitro liver sinusoid mimics using chitosan-hyaluronic acid polyelectrolyte multilayers. Tissue Eng Pt A. 16, (9), 2731-2741 (2010).
  12. Larkin, A. L., Rodrigues, R. R., Murali, T., Rajagopalan, P. Designing a Multicellular Organotypic 3D Liver Model with a Detachable, Nanoscale Polymeric Space of Disse. Tissue Eng Pt C. 19, (11), 875-884 (2013).
  13. Kidambi, S., et al. Patterned Co‐Culture of Primary Hepatocytes and Fibroblasts Using Polyelectrolyte Multilayer Templates. Macromol Biosci. 7, (3), 344-353 (2007).
  14. Janorkar, A. V., Rajagopalan, P., Yarmush, M. L., Megeed, Z. The use of elastin-like polypeptide-polyelectrolyte complexes to control hepatocyte morphology and function in vitro. Biomaterials. 29, (6), 625-632 (2008).
  15. Piez, K. A., Eigner, E. A., Lewis, M. S. The Chromatographic Separation and Amino Acid Composition of the Subunits of Several Collagens*. Biochemistry. 2, (1), 58-66 (1963).
  16. Tanford, C. The interpretation of hydrogen ion titration curves of proteins. Adv Protein Chem. 17, 69-165 (1962).
  17. Cayot, P., Tainturier, G. The quantification of protein amino groups by the trinitrobenzenesulfonic acid method: a reexamination. Anal Biochem. 249, (2), 184-200 (1997).
  18. Kakade, M. L., Liener, I. E. Determination of available lysine in proteins. Anal Biochem. 27, (2), 273-280 (1969).
  19. Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
קולגן שכבת הפקדת-ידי שכבה במכשירי microfluidic לMicrotissue ייצוב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCarty, W. J., Prodanov, L., Bale, S. S., Bhushan, A., Jindal, R., Yarmush, M. L., Usta, O. B. Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization. J. Vis. Exp. (103), e53078, doi:10.3791/53078 (2015).More

McCarty, W. J., Prodanov, L., Bale, S. S., Bhushan, A., Jindal, R., Yarmush, M. L., Usta, O. B. Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization. J. Vis. Exp. (103), e53078, doi:10.3791/53078 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter