Summary
De co-morbide ziekte van Alzheimer (AD) en beroerte aandoening in een nieuw model te onderzoeken, zijn drie gedrag taken beschreven die zowel motorische controle en cognitieve gedrag te evalueren. Deze taken zijn onder andere de bundel-walk taak, cilinder taak en Morris water doolhof.
Abstract
ziekte van Alzheimer (AD) is een slopende neurodegeneratieve ziekte die leidt tot neurodegeneratie en geheugenverlies. Terwijl leeftijd is een belangrijke risicofactor voor AD is beroerte ook geïmpliceerd als risicofactor en een verergering factor. De co-morbiditeit van een beroerte en AD resulteert in een slechtere-takt-gerelateerde motorische controle en AD-gerelateerde cognitieve tekorten in vergelijking met alleen elke conditie. De gecombineerde toestand van beroerte en AD, een nieuw transgeen ratmodel van AD, met een gemuteerde vorm van amyloïde precursor eiwit (een belangrijk eiwit betrokken bij de ontwikkeling van AD) opgenomen in het DNA modelleren, krijgt een kleine eenzijdige striatale beroerte.
Voor een model met de combinatie van beroerte of AD moet gedragstesten dat beroertes motorbesturing, motoriek en AD-gerelateerde cognitieve functie getest worden geïmplementeerd. De cilinder taak betreft een kosten-efficiënte, multifunctionele apparaten die spontaan voorpoot motor gebruik beoordeelt. In deze opdracht wordt een rat geplaatst in een cilindrische inrichting, waarbij de rat spontaan achter en contact van de cilinder met zijn voorpoten. Deze contacten zijn voorpoot motor gebruik beschouwd en gekwantificeerd tijdens video-analyse na het testen. Een andere kostenefficiënte motorische taak uitgevoerd is de stralingshoek-walk taak, die voorpoot controle, achterbeen controle en motoriek beoordeelt. Deze taak omvat een rat lopen over een houten balk waardoor de beoordeling van de ledematen motorische controle door middel van analyse van de voorpoot slips, achterbeen uitglijden en vallen. Beoordeling van leren en geheugen wordt aangevuld met Morris water maze voor deze gedrags-paradigma. Het protocol begint met de ruimtelijke leren, waarbij de rat lokaliseert een stationair verborgen platform. Na ruimtelijke leren, wordt het platform verwijderd en zowel de korte termijn en lange termijn ruimtelijke referentie-geheugen wordt beoordeeld. Alle drie van deze taken zijn gevoelig voor gedrags verschillen en voltooid binnen 28 dagen voor dit model, waardoor dit liddigm tijd-efficiënt en kostenefficiënt.
Introduction
Ziekte van Alzheimer (AD) is de meest voorkomende vorm van dementie bij ouderen en een slopende neurodegeneratieve ziekte. Histopathologisch, AD presenteert zich als amyloïde plaques, tangles en neuronaal verlies. Amyloid plaques bestaan voornamelijk uit beta-amyloïde peptide (Aß) dat is geproduceerd door een veranderde proteolytische splitsing van amyloïde voorlopereiwit (APP) van β-secretase en γ-secretase enzymen 1,2,3. Het splitsingsproduct, Ap, afzettingen in de hersenen creëren pathologische amyloïde plaques en heeft toxische effecten op de hersenen die kan leiden tot de karakteristieke leerbeperkingen en geheugenverlies. Al deze stappen samen worden aangeduid als de "amyloïde cascade hypothese van" 3,4. Hoewel deze hypothese is van belang bij het onderzoeken van AD, zijn andere cellulaire veranderingen gevonden om deze plaque formaties die afwijkt van de oorspronkelijke amyloïde cascade route voorafgaan. deze anderecellulaire veranderingen worden verondersteld bij te dragen aan het begin van geheugenverlies, het leren van waardeverminderingen en andere cognitieve stoornissen die betrokken zijn bij AD voorafgaand aan de vorming van tandplak 3,5,6.
Met AD steeds voorkomende, zijn risicofactoren voor het ontwikkelen van AD steeds een zeer belangrijke focus van het onderzoek. Hoewel leeftijd is de belangrijkste risicofactor voor sporadische vormen van AD, hebben andere risicofactoren geïdentificeerd, waaronder beroerte 7,8. Beroerte is niet alleen een risicofactor, maar het kan ook verergeren reeds dementie. Bijvoorbeeld, klinisch, de progressie van AD is aangetoond slechter bij patiënten die eerder een beroerte hadden 9 zijn. Bovendien is toegenomen APP expressie en Aß accumulatie gevonden in experimentele diermodellen van Ap-toxiciteit in combinatie met geïnduceerde beroerte 10,11. Aangezien er deze belangrijke interactie tussen beroerte en AD, is het noodzakelijk dat deze twee pathologieën verder worden onderzochtsamen comorbide modellen beter te begrijpen en gedragingen pathofysiologie betrokken bij beide condities.
Om co-morbide omstandigheden te onderzoeken, een geschikt model moest worden ontwikkeld, waarbij een beroerte zou kunnen interageren met Ap AD-achtige pathologie te produceren. Voor het eerst een APP21 transgene rat die een gemuteerd menselijk APP-gen geïncorporeerd in het DNA werd gebruikt om een geschikt model van AD bereiken. De mutaties zijn de Zweedse dubbele missense en Indiana enkele missense mutaties, die beide zijn betrokken in familiale vormen van AD 4,8,12. Aangezien een extra belediging dit rattenmodel leeftijden zonder het ontwikkelen van de eigenschap Ap-plaques en neurofibrillaire klitten 12. Daarom is in een poging om AD-achtige behavioral pathologie induceren, een kleine slag wordt ingebracht in de rechter striatum de kleine subcorticale beroertes vaak aanwezig in dementie 9 nabootsen. De slag in de APP21 transgene rat belichaamt de comorbide aandoening en maakt onderzoek van verschillende soorten gedragsveranderingen betrokken bij beide ziektetoestanden. In het bijzonder, dit inductie van AD-achtige pathologie en cognitieve tekorten in de volwassen rat laat ons onderzoek naar de vroegste moleculaire en cognitieve veranderingen voorgaande AD.
Omdat het doel is om de eerste tekenen van gedragsveranderingen bepalen en aangezien beroerte of AD hebben zeer verschillende behavioral aandoeningen, bij het bestuderen van de co-morbide model, gedrag taken moeten verschillende gedrags- fenotype te kennen. Er zijn accu's met gevoelige tests die kunnen worden gedaan tot motorisch gedrag analyseren diermodellen die verschillende paradigma's en apparatuur worden gebruikt. Om specifiek te analyseren voorpoot en achterbeen motorische functie, hebben de cilinder taak en beam-walk taak geïmplementeerd om motorische beperkingen op te sporen en te controleren motoriek in dit model. Andere gevoelige taken ontworpen om specifiek te beoordelen fijne forelimb motorische vaardigheid (dwz de trap taak en enkele pellet bereiken taak) vereist het onthouden van voedsel 11,13,14. Één van de bekende effecten van het onthouden van voedsel op ziekte pathologieën 15,16,17 voorkomen, zijn deze testen zijn niet geschikt geacht voor deze studie. De cilinder taak beoordeelt de spontane gebruik van voorpoten van de rat tijdens de opfok in een nieuwe omgeving en kan asymmetrie tussen voorpoten bij ratten op te sporen met een enkelzijdige attaque 10,18. Een groot voordeel van deze taak is dat de inrichting kan worden gebruikt voor andere taken gedrag, zoals de Porsolt gedwongen zwemmen taak 19. Anders dan de cilinder taak het balkvormige lopen taak maakt analyse van het achterbeen en voorpoot motorbesturing, naast locmotion 10,14. Beam wandelen is voorzien van een bewegingsapparaat component, een evenwicht component en geschoolde voet plaatsing. Beide tests zijn kostenefficiënt, eenvoudig, en tijd-efficiënt en verhelderen van de gevolgen van een beroerte en AD op d ifferences in de ledematen functioneren.
Afgezien van veranderingen in de motorische functie, AD houdt tekorten geheugen dat in de vroege stadia van de progressie van de ziekte kunnen presenteren. Bij de aanpak van AD-achtige pathologieën in een knaagdier model, is het cruciaal dat de hippocampus afhankelijk leren en geheugen wordt beoordeeld omdat de hippocampus is een belangrijke hersenstructuur grotendeels beïnvloed in AD 2. De hippocampus is een essentieel hersengebied voor ruimtelijke leren en geheugen en zijn functie kan worden getest met behulp van verschillende doolhof paradigma in knaagdieren. Eén van de meest gebruikte doolhof taken voor knaagdieren modellen van verschillende ziekten is de Morris water maze 20. De Morris water maze maakt gebruik van spatial cues om de rat te helpen bij het lokaliseren van een stationair verborgen platform en test ruimtelijke referentie-geheugen wanneer het platform wordt verwijderd. Een groot voordeel van de water maze opstelling is dat het zeer flexibel afhankelijk van de voorgestelde vraagstelling 20.
tent "> Voor het eerst zijn de beschreven technieken gebruikt om motorische en cognitieve functie in een nieuwe comorbide ratmodel voor beroerte en AD beoordelen. van kleine slagen per APP21 transgeen ratmodel. Comorbiditeit werd bereikt door het induceren vasoconstrictie van bloedvaten in het striatum een kleine slag in APP21 transgene ratten te produceren. dit slagmodel is goed gevestigd als een comorbide aandoening in een alternatieve diermodel van AD 11 Advancement. in deze nieuwe APP21 transgeen ratmodel was bedoeld om een translationeel waardevol model te produceren. Terwijl de gedragstaken worden omschreven met een comorbide beroerte en AD ratmodel, deze taken kunnen verder worden toegepast op andere modellen van beroerte of modellen van andere neurologische aandoeningen (bijvoorbeeld ziekte van Parkinson). de algemene methodologie beschreven zullen op grote schaal toepassing op deze andere ziekten zijn, maar het gedrag van tijdlijnen en paradigma kan verandering nodig op basis van de voorgestelde research vraag en model. Naast het feit aanpasbare beschreven taken effectief in het aantonen van kleine tekorten, terwijl ook de kosten en tijdbesparend.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De passende institutionele dier ethische commissie moeten alle van de gedrags-procedures goed te keuren voor het starten van experimenten. Alle dieren hier beschreven werk werd goedgekeurd door Western University Animal Gebruik Subcommissie en volgt de Canadese Raad over Animal Care richtlijnen. Deze dierproeven werden uitgevoerd tijdens de lichte fase.
1. Cilinder Taak voor Gross voorpoot Motor Assessment
- Equipment Setup
- Het verwerven van een Plexiglas cilinder met een geperforeerd deksel die geschikt voor de grootte van de rat voor het experiment gebruikt. De grootte van de cilinder niet mogelijk de rat naar de top wanneer gehouden en dit moet voor 2 cm tussen de wand en de neus van de rat en de basis van de staart van de rat. De standaardhoeveelheid van een cilinder 23 cm in diameter en 40 cm in hoogte voor een 6 maanden oude (400-600 g) ratten.
- Plaats een spiegel in een 45 ° hoek onder het cilinder-inrichting met de cilinder op een Plexiglas staan of een andere vorm van ondersteuning van ongeveer 30 cm boven het tafelblad.
- Stel een videocamera op een statief op een geschikte afstand tot de gehele diameter van de cilinder te visualiseren in de spiegel op de videocamera.
- Draai verlichting om een dimmer setting en spelen witte ruis in de kamer (dwz een laag volume, subtiele muziek) om het effect van plotselinge harde geluiden te verminderen. Dit zou moeten helpen de beweging stimuleren en bevriezing te voorkomen als gevolg van harde geluiden.
- Experimentele procedure
- Beweeg de ratten in de experimentele kamer 30 min voor de start van de eerste proef aan ratten wennen aan de kamer met muziek en dimmer verlichting.
- Schrijven en de bijhorende dier en berechting informatie (dwz dier nummer, dag in de tijdlijn en berechting nummer) op een klein wit bord. Plaats dit bord in de voorkant van de spiegel.
- Druk op record op de videocamera met de witte boord in de voorkant van de spiegel, pak de rat in de buurt van de basis of de staart, plaats de rat in de cilinder en zet het deksel. Staan aan de zijkant van de cilinder te voorkomen dat interfereert met video-opname.
- Verwijder de witte boord vanaf de voorzijde van de spiegel en laat de videocamera opnemen van de rat in de cilinder gedurende 5 minuten (gebruik een timer tot 5 minuten op te nemen vanaf het moment dat de witte boord wordt verwijderd). Dit is een proces.
- Reinig de cilinder met een papieren handdoek en water na een proefperiode.
- Herhaal stappen 1.2.2-1.2.5 twee keer tot een totaal van drie trials bereiken. Er moet een 20-30 min inter-testtijd om de kans op gewenning verlagen om de cilinder. Gedurende deze tijd, voert cilinder proeven voor de andere ratten.
- video Analysis
- Importeer videocamera-bestanden in video-editing programma (dat wil zeggen iMovie)
- Compileren de video's in clips voor elk onderzoek. Dempen het volume van de video en de snelheid van de video verminderen tot 25% van het origineel.
- Tel het aantal voorpoot contactenmet de wand van de cilinder voor de linker en rechter voorpoot. Voor het gelijktijdig links en rechts contacten, tellen deze voorpoot contacten als "beide". Houd in gedachten dat de video wordt opgenomen door middel van een spiegel, wat lijkt op de linker voorpoot in de video overeenkomt met recht voorpoot van het dier in de werkelijkheid.
- Bereken het percentage van het beïnvloede voorpoot (contralateraal van de lijn) met de volgende vergelijking: [{(beïnvloed contacten + ½ bilaterale contacten) / totaal aantal contacten} x 100]. De prestaties van zowel wild-type groepen en de transgene groep zonder slag worden beschouwd vergelijking groepen om de presentatie van de ziekte veroorzaakte problemen te evalueren.
2. Beam-walk Task voor Gross Motor Assessment
- Equipment Setup
- Het verwerven van een gladde verzegelde houten balk, die 2 cm breed en ongeveer 120 cm lang (optimale breedte voor een 200-600 g rat).
- Plaats twee tafels of kasten unhaar 100 cm uit elkaar. Het oppervlak van elke eenheid moet ongeveer 40 cm boven de grond.
- Beveiligde beide uiteinden van de balk op de tafel rekken oppervlak met tape. Ongeveer 1 m van de niet-ondersteunde ligger lengte moet nu worden verhoogd 40 cm boven de grond.
- Stel een videocamera op een stand, die de gehele lengte van de balk. Om het contrast in de video te verbeteren, overwegen een zwarte achtergrond achter de balk bij het gebruik van witte ratten.
- Experimentele procedure
- Beweeg de ratten in de experimentele kamer 30 min voor de start van de eerste proef aan ratten wennen aan de kamer met muziek en dimmer verlichting.
- Plaats de rat kooi of kooiverrijking buizen aan een uiteinde van de balk en plaats de rat aan de andere kant van de balk.
- Voer een enkele niet-opgenomen runs twee dagen voor experimentele studies. Laat de rat de omgeving verkennen en begeleiden de rat in de richting van de bundel door het houden van de basis van de rat'S staart.
- Zodra de rat de balk heeft overschreden, beweegt de kooi of buis naar de andere kant van de balk en herhaal. Wanneer de rat kruist de balk vrij in beide richtingen, de trainingssessie voorbij. Houd het aantal opleidingsplaatsen loopt overeenstemming tussen alle dieren.
- Schrijven en de bijhorende dier en berechting informatie (dwz dier nummer, dag in de tijdlijn en berechting nummer) op een klein wit bord. Tape deze witte bord aan de muur achter de balk.
- Plaats de rat kooi of omgeving verrijking slang aan één einde van de balk.
- Druk record op de videocamera en pak de rat door de basis van de staart en aan het einde van de balk tegenover de kooi of buis.
- Noteer het geheel van het proces, die eindigt bij de rat is voltooid doorkruisen van de volledige lengte van de verhoogde bundel. Als de rat pauzeert halverwege over de balk, voorzichtig scruff de rat door de basis van de staart en raak de staart van de rat voorzichtigom beweging over de balk te promoten. Druk niet op de rat naar voren op welke manier.
- Re-do onderzoeken waarbij de rat gaat zijwaarts, terwijl op de balk, herhaaldelijk stopt wandelen of wandelingen inconsistent. Indien een rat valt en blijft hangen aan de balk voorzichtig scoop rat en plaats het terug op de bundel ter plaatse van de herfst en het proces verder.
- Verplaats de kooi of buis naar de andere kant van de balk, verandert het proces # op het witte bord en de daaropvolgende proef te nemen.
- Herhaal deze procedure tot een totaal van 6 studies zijn afgerond, met 3 proeven worden geregistreerd voor elke richting. Alle 6 proeven voor een rat kan worden opgenomen voordat de proeven voor de volgende rat.
- video Analysis
- Importeer videocamera-bestanden in video-editing programma (dat wil zeggen iMovie).
- Compileren de video's in clips voor elk onderzoek en dempen het volume van de video. Analyseer elke videoclip frame voor frame.
- Tel het aantalvan de totale stappen de rat neemt om de volledige lengte van de balk en het totale aantal van de linker en rechter achterbeen en voorpoot uitglijden en totaal aantal valincidenten lopen. De prestaties van beide groepen wildtype en transgene groep zonder beroerte worden beschouwd in relatie tot de comorbide groep ontstaan van tekorten uniek voor de comorbide aandoening evalueren.
3. Morris Water Maze voor de hippocampus-afhankelijke Ruimtelijke Learning and Reference geheugen
- Equipment Setup
- Bevestig een videocamera boven het midden van een cirkelvormig zwembad (148 cm diameter en 58 cm diep) geplaatst. Lijn de vier aangewezen kwadranten behoorlijk met de omtrek van het zwembad in de tracking software programma.
- Vul het rond zwembad met water ongeveer 36 cm diep. Het water moet worden opgewarmd tot kamertemperatuur door het vullen van het zwembad een paar dagen voor het begin van het experimentele protocol.
- Voeg zwarte niet-giftige acrylverf until het water is ondoorzichtig bij het gebruik van witte ratten. Gebruik een lichte kleur, zoals wit, voor donkere gekleurde ratten.
- Rondom het zwembad met lege wanden, met inbegrip van scheidingswanden indien nodig. Wanneer in het zwembad moet de rat niet in staat zijn de onderzoekers zien.
- Snij 4 grote verschillend gevormde ruimtelijke signalen van verschillende kleuren van de poster bord en maak een vorm op de muur per aangewezen noorden, het oosten, zuidoosten en zuidwesten zwembad locaties. Deze signalen moet iets boven de rand van de pool zijn.
- Zet een radio bij een laag volume in het noordwesten kwadrant te voorkomen dat de rat uit worden afgeleid door onverwachte harde geluiden tijdens het testen.
- Plaats een cirkelvormig platform (11,5 cm diameter, oppervlakte 2-3 cm onder het waterniveau) in het midden van het doel kwadrant.
- Schakel de belangrijkste kamer lichten uit en draai op een staande lamp aan de andere kant van de scheidingswand naar het zwembad om het gebied te verlichten.
- computer Configuration
- Set 4 opeenvolgende dagen met 4 trials van 90 seconden elk voor de ruimtelijke leren experiment.
- Set 2 aparte probe experimenten van 30 sec elke 24 uur na de laatste ruimtelijke leren vallen en 1 week na de eerste probe experiment.
- Set cued leren proeven bij 4 proeven per dag gedurende 2 opeenvolgende dagen vanaf 24 uur na de tweede probe experiment. Elke proef moet 60 sec totaal.
- Voor elke fase ingesteld proeven volgorde, zodat er een 20 min inter-proces interval tussen elke proef voor elk dier. Andere dieren kunnen worden uitgevoerd tijdens de inter-proces interval, zolang elk dier zorgt voor een 20 min inter-proces interval.
- Zorg ervoor dat de stand van het platform moet worden gedefinieerd door de experimentator en dat alle andere zones zijn debeboet door de aangewezen platform positie.
- Stel het programma om handmatig te beginnen en eindigen elke proef.
- Plaats de ronde platform in het zuidwesten kwadrant. Het moet worden afgestemd op het cirkelvormige aangewezen "platform" gebied in het kwadrant van het computerprogramma.
- Begin posities rond het zwembad moet worden gerandomiseerd voor elke rat. Vertegenwoordigen alle start posities in elke behandelingsgroep. Geen rat begint vanaf het noordoosten positie voor elke ruimtelijke leren proeven in het paradigma aangeboden om voor een nieuwe startpositie tijdens de sonde het testen.
- Houd de rat aan de basis van zijn staart en voorzichtig plaats deze in het water langs de wand van het zwembad op de aangewezen startpositie en snel te verplaatsen uit het zicht van de rat.
- Hebben de andere onderzoeker start de tracking software zodra de rat is in het water. Een timer moet beginnen te tellen vanaf 0 op de tracking programma. Als de rat lokaliseert het platform, de andere experimentator stopt de poging de computer en laat de rat het platform ten minste 30 seconden voordat het terug te halen. Als de rat springt van het platform voor het proces wordt gestopt op de computer, het proces verder.
- Als de rat het platform in de toegewezen proef tijd niet vindt, begeleiden de rat naar het platform met behulp van je hand (of het maken van de rat volgen uw hand of begeleiden van de rat door de basis van zijn staart). Houd de rat op het platform 30 sec.
- Haal de rat van het zwembad door de basis van zijn staart op de arm van de experimentator, dat is bedekt met een handdoek of laat de rat klimmen op een draagbare oppervlak.
- Herhaal stappen 3.3.3-3.3.7 voor een totaal van 4 tests per rat. Er moet een inter-proces interval van 20 minuten voor elke rat.
- Zet de ratten naar hun huis kooi onder een warmtelamp gedurende minstens 10 minuten na de definitieve ruimtelijke leren het proces van de rat.
- Voortzetting van de EXAct dezelfde ruimtelijke leren protocol voor dag 2 tot en met dag 4 van ruimtelijke leren.
- Op dag 2-4, niet de rat op het platform nog langer vast te houden. Laat de rat om op het platform zitten zonder hulp gedurende 30 seconden met de onderzoekers uit het zicht. Dit kan in latere proeven op dag 1 bij gelegenheid.
- Verwijder het platform van het zwembad. Zorg ervoor dat het vorige platform positie blijft gedefinieerd op de computer (cirkel in het zuidwesten kwadrant).
- Plaats de rat in het water langs de wand van het zwembad in het noordoosten positie en snel te verplaatsen uit het zicht van de rat. Het gebruik van de roman noordoosten startpositie zorgt ervoor dat de rat herinnert aan het platform positie onafhankelijk van eerder opgeleid start posities.
- Hebben de andere onderzoeker start de tracking software zodra de rat is in het water. Een timer moet beginnen tellen vanaf 0 op de tracking software.
- Haal de rat uit dezuidwesten kwadrant van het zwembad door de basis van zijn staart en houd op een handdoek bedekt arm of laat de rat klimmen op een draagbare oppervlak.
- Zet de ratten naar hun kooi onder een warmtelamp gedurende ten minste 10 min volgende probe proces elke rat.
- Herhaal dit experiment (stappen 3.4.1-3.4.5) 1 week later.
- Gebruik tape om een 4 cm diameter witte bolvormige cue te komen over een standaard die is 8,5 cm hoog op het platform (totale hoogte van cue is 12,5 cm). De top van de sferische cue zal ten minste 8,5 cm boven het waterniveau.
- Verwijder de spatial cues van muren rondom het zwembad.
- Willekeurig platform posities en start posities voor elke rat in elke groep. Alle platform en start posities worden vertegenwoordigd voor elke behandeling groep.
- Plaats platform in de daarvoor bestemde platform gebied en bepaalt in de tracking software.
- Plaats de rat in het water langs de wand van het zwembad bij thij aangewezen startpositie en snel te verplaatsen uit het zicht van de rat.
- Hebben de andere onderzoeker start de tracking software zodra de rat is in het water. Een timer moet beginnen tellen vanaf 0 op de tracking software.
- Zodra de rat het platform bereikt, hebben de andere experimentator stoppen met de proef op de computer. Als de rat het platform springt, het proces verder. Voordat het ophalen van de rat, laat de rat om op het platform te zitten voor 15 sec.
- Haal de rat van het zwembad door de basis van zijn staart en houd op een handdoek bedekt arm of laat de rat klimmen op een draagbare oppervlak.
- Controleer het platform positie voor de volgende rat en verplaats het platform in het overeenkomstige gebied gedefinieerd in de tracking software.
- Herhaal stappen 3.5.4-3.5.9 voor de volgende 3 proeven. Er moet een inter-proces interval van 15 min.
- Zet de ratten naar hun kooi onder een warmtelamp gedurende ten minste 10 min na Fina elke ratl cued leren trial.
- Doorgaan hetzelfde protocol voor dag 2 van gecued leren.
Opmerking: De tijd doorgebracht in zones, de afgelegde afstand in de zones, de gemiddelde snelheid, het aantal inschrijvingen in zones en de tijd tot de eerste binnenkomst in zones worden vaak gebruikt.
- Analyseer de tijd en de afstand tot het platform zone en de gemiddelde snelheid per dag van de ruimtelijke bereiken en cued afzonderlijk te leren. Probe experimenten, het analyseren van de latency naar eerste binnenkomst in de doelzone als een ruwe tijd of een procentuele verandering van sonde 1 tot 2 sonde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De gedragstaken beschreven werden gebruikt om de effecten van een beroerte bij een APP21 transgeen ratmodel van de ziekte van Alzheimer tonen. De combinatie van een beroerte en de APP21 transgen naar verwachting leiden tot meer tekort motor in de aangedane ledematen, alsook stoornissen meer geheugen.
De cilinder taak geëvalueerd voorpoot grove motoriek en wordt weergegeven als het gebruik van de aangedane voorpoot. Bovendien werd de bundel-walk taak gebruikt om specifiek te evalueren achterbeen motorische functie en motoriek. Omdat de beroerte werd geïnduceerd in het rechter striatum, de linker voorpoot wordt naar een motor tekort vertonen indien aanwezig. De in zowel Figuur 2 en Figuur 3a en 3b niet statistisch aangetoond dat co-morbide ratten data een voorpoot of hindlimb tekort, respectievelijk. Hoewel deze dieren niet appeer tekorten voorpoot en achterbeen motor hebben, lijken ze om kleine verschillen in motorische functie met betrekking tot de motoriek hebben. In de bundel-walk taak werden in totaal stappen aanzienlijk toegenomen in de co-morbide transgene ratten met een beroerte (p <0,05, figuur 3c), wat suggereert dat de bundel-wandeling taak is gevoelig genoeg te halen kleine veranderingen in de manier van lopen en motoriek. De kleine striatale slagmodel gebruikt produceert kleine bewegingen die waarschijnlijk te klein om grote motorische produceren, maar tekorten eerder aangetoond in andere tweetaktmodellen deze twee taken 10,14. Hier, kunnen deze taken eenvoudig controleren motorische functie en motoriek bij het onderzoeken van de parameters gepresenteerd.
Hippocampus afhankelijke ruimtelijke leren en referentie-geheugen kan effectief worden beoordeeld met behulp van Morris water doolhof. Er waren geen duidelijke verschillen in leren tussen groepen (Figuur 5a >, Figuur 5b), dus verschillen in leren kan geen rekening met eventuele verschillen in het geheugen prestaties. APP21 transgene ratten met beroerte toonde een robuuste langetermijnreferentiewaarde geheugenstoornis opzichte transgene ratten zonder beroerte en wildtype ratten Beroerte (p <0,05, figuur 5c).
Cued leren is voltooid om ervoor te zorgen dat ratten gelijke mogelijkheid om visueel-ruimtelijke aanwijzingen te gebruiken om het platform te vinden in de Morris water doolhof. Zoals getoond in figuur 6a en figuur 6b, werden geen verschillen waargenomen in de latentie of weglengte om het platform te bereiken gedurende geactiveerde leren tussen groepen. Bovendien is de gemiddelde zwemmen snelheid was consistent tussen groepen (figuur 6c) en toont aan dat de motivatie om te ontsnappen en te zwemmen vaardigheden gelijk tussen de groepen was.
guur 1 "src =" / files / ftp_upload / 53089 / 53089fig1.jpg "/>
Figuur 1:. Timeline voor motorische en cognitieve gedragstherapie evaluaties-Stroke inducerende operatie dag is toegewezen dag 0 en alle testen dagen zijn in verwijzing naar deze dag. (A) Pre-chirurgie en na de operatie het testen voor cilinder taak (C) en balk-wandeling taak (BM). (B) Morris water maze ruimtelijke leren, testen sonde en cued leren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Cilinder Task Percentage gebruik van getroffen voorpoot werd berekend met de vergelijking in stap 1.3.4 en herleid tot dag -3 uitgangswaarden. De rode stippellijn annoteren de 1.0 waarde die gelijk gebruik van elk vertegenwoordigtvoorpoot in de cilinder taak. Wildtype wordt afgekort als WT en transgene wordt afgekort als TG. Dierenaantallen zijn: WT + zoutoplossing (n = 7), WT + beroerte (n = 8), TG + zoutoplossing (n = 8), TG + beroerte (n = 6). Alle waarden worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. (Two-way ANOVA, Tukey's post hoc). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Beam-walk De taak van de som van alle slips gemaakt met de (A) aangetast en (B) onaangetast achterbeen over 5 studies wordt gepresenteerd als een verhouding van het totale aantal stappen genomen om de balk te steken. Waarden werden gestandaardiseerd tot uitgangswaarden als volgt: na de operatie verhouding - pre-operatie ratio. (C) De totale stappen om de balk o steken n dag -7 en dag 21. Wildtype wordt afgekort als WT en transgene wordt afgekort als TG. Dierenaantallen zijn: WT + zoutoplossing (n = 6), WT + beroerte (n = 6), TG + zoutoplossing (n = 6), TG + beroerte (n = 5). Alle waarden worden weergegeven als gemiddelde ± SEM en sterretjes geven de statistische significantie. (One-way ANOVA, Tukey's post hoc, p <0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Program view aantonen secties nodig voor opstellen en uitvoeren van een experiment een paar uitgelichte kenmerken van de tracking-programma gebruikt voor het Morris water doolhof.. Het apparaat bekijken met de video van het zwembad hierboven voorgekomen verschijnt alleen als wanneer voorgesteld in het tabblad Tests.3089fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Ruimtelijke leren en referentie-geheugen in de Morris water maze Ruimtelijke leren werd gemeten door (A) latency en (B) weglengte om het platform te bereiken.. (C) Referentie geheugen werd gemeten als percentage verandering van de latency naar de eerste binnenkomst in de doelzone op de dag 19 probe-test in vergelijking met de dag 12 probe-test. Wildtype wordt afgekort als WT en transgene wordt afgekort als TG. Dierenaantallen zijn: WT + zoutoplossing (n = 8), WT + beroerte (n = 7), TG + zoutoplossing (n = 7), TG + beroerte (n = 8). Alle waarden worden weergegeven als gemiddelde ± SEM en sterretjes geven de statistische significantie. (Two-way ANOVA voor ruimtelijke leren en one-way ANOVA voor sonde testen, Tukey's post hoc, p &# 60;. 0,05) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6:. Gecued leren in Morris water maze (A) Latency en (B) weglengte naar platform te bereiken worden als een gemiddelde van alle acht proeven van het leren. (C) Swim snelheid wordt gepresenteerd als een gemiddelde van alle acht proeven van het leren. Wildtype wordt afgekort als WT en transgene wordt afgekort als TG. Dierenaantallen zijn: WT + zoutoplossing (n = 8), WT + beroerte (n = 7), TG + zoutoplossing (n = 7), TG + beroerte (n = 8). Waarden worden voorgesteld als gemiddelde ± SEM. (One-way ANOVA, Tukey's post hoc). Klik hier om een grotere versie van deze fotofiguur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De combinatie van een beroerte en de ziekte van Alzheimer resultaten in zeer verschillende behavioral pathologieën die zowel motorische en cognitieve functies, afhankelijk van de ernst van elke aandoening kunnen beïnvloeden. Derhalve is het noodzakelijk gebruik van een verscheidenheid van gedragstaken leveren aan de bijdrage van deze voorwaarden te bepalen, evenals geven een inzicht in de gecombineerde en mogelijk interactieve effecten in de comorbide aandoening. De gepresenteerde gegevens tonen drie kostenefficiënt, tijd-efficiënte en gevoelige gedrag taken aan motorische functie en hippocampus afhankelijke ruimtelijke leren en referentie-geheugen te evalueren in een roman comorbide APP21 transgeen rat model met een beroerte. Naast de gepresenteerde gegevens zijn deze taken geverifieerd bij een zwaardere takt modellen 10,14,18, en bij modellen voor AD 8,16 en moeten breed toepasbaar op verschillende modellen van beide ziekten.
Dat gezegd zijnde, geen taak is zonder limitations. Voor de motor aangegeven werkzaamheden, kunnen sommige probleemoplossing nodig zijn als ratten gewend aan de cilinder en de balk worden. In de cilinder taak kan een motivatie worden verplicht de rat het adequate hoeveelheid voorpoot contact met de wand van de cilinder. Om dit resultaat te bereiken, kan de toepassing van een niet-giftige geur op het geperforeerde deksel of wand van de cilinder de rat aan de achterzijde te motiveren en contact opnemen met de wand van de cilinder met zijn voorpoten. Bijvoorbeeld kan een beetje pindakaas of vanille-extract wordt gesmeerd op de binnenwand nabij de bovenkant van de cilinder sedentaire ratten bevorderen als de cilinderwanden verkennen. Een ring van gekleurde tape kan worden aangebracht op de binnenzijde van de cilinder ¾ van de bodem van de cilinder. Een andere manier van het bevorderen kweken omvat het verwijderen van een zittend rat en herintroductie van het aan de cilinder nadat enige tijd is verstreken, die is bereikt met een inter-proces interval in het protocol. Vachtvendien, afhankelijk van de hoogte van de cilinder vergeleken met de lengte van de rat, het verwijderen van het geperforeerde deksel halverwege proef kan ertoe gehouden en voorpoot contact met de cilinderwand. Dit moet niet worden gedaan als er een mogelijkheid de rat kunnen ontsnappen uit de cilinder tijdens de test zal zijn. Deze motivaties kunnen helpen bij het verhogen van het aantal steigert, maar moet het gebruik van de linker en rechter voorpoten geen invloed tijdens muur contact. Als er nog steeds een grote zorg over een ontoereikend aantal voorpoot contacten na de implementatie van deze suggesties, kan een proef worden beëindigd nadat de rat een totaal van 10 opsteekt, ongeacht de lengte van de tijd heeft gemaakt. Dit zou anders het 5 minuten proeven in het bovenstaande protocol, ingevuld, omdat elke rat in totaal 10 rears zou bereiken op verschillende tijdstippen. Met een model van beroerte en AD comorbiditeit, is het belangrijk te weten dat veranderingen in cognitieve prestaties, angst en activiteit kunnen ontwikkelen in deze ratten. while dergelijke veranderingen hebben geen directe invloed op de primaire eindpunt van de cilinder taak (spontane voorpoot gebruik tijdens opfok), het opnemen van andere waarnemingen kunnen waardevolle aanwijzingen voor niet-motor gerelateerde gedragsveranderingen die zich kunnen ontwikkelen vormen. In de cilinder taak kan dergelijk gedrag eventueel worden gevolgd door het analyseren verhoogd of verlaagd fokken gedrag als kweek is een vorm van gemotiveerde exploratiegedrag. Bovendien zijn er andere maatregelen, zoals de tijd doorgebracht verzorgen, draaien en de landing kan inzicht over angst en andere fysieke tekorten respectievelijk bieden,.
Met betrekking tot de bundel-wandeling taak met de kooi verrijking buis is meestal genoeg motivatie voor de rat te lopen over de balk. Indien een rat blijft halverwege stoppen langs de balk, een geurige voedselbeloning of behandelt, zoals pindakaas of precisie suiker pellets, kunnen naast de verrijking buizen aan de andere kant worden ingebracht. Als traktaties worden gegeven, ervoor zorgen dat alle ratten ontvangen abuit evenveel behandelt op testdag, onafhankelijk van hun prestaties. Bovendien, in plaats van het uitvoeren van alle zes proeven voor een rat voordat u naar de volgende rat, onderzoeken konden worden gespreid. Bijvoorbeeld zou de eerste twee keer moeten worden ingevuld voor alle ratten vóór het begin van beide. Dit kan de toename van het aantal stops halverwege over de balk die zich kunnen voordoen op de latere proeven wanneer sommige ratten worden ook comfortabel met de bundel milieu te voorkomen. Een andere mogelijke oplossing als frequent stoppen optreedt is het aantal pogingen te verlagen. Dit kan worden uitgevoerd door een spiegel achter de bundel zowel links als rechts ledematen analyseren elke test, waardoor het aantal pogingen worden verlaagd. Bovendien kan gewenning aan de balk later meerdere testsessies en kan resulteren in ratten weigeren de balk steken en blijven zitten op de balk, ondanks alle inspanningen om de dieren te motiveren. Door dit probleem beam evaluaties zijn niet ideaal voor herhaalde testen in long termijn experimenten. In protocollen die gebruik maken van herhaalde testen, kan de vergoeding ook een punt van zorg in aanvulling op de motivatie te worden. Om kwesties van compensatie te overwinnen tijdens het oversteken van de bundel kan een taps toelopende bundel eerder worden gebruikt dan een gewone houten balk 21.
Opnieuw kan cognitieve veranderingen, zoals verhoogde angst en veranderingen in de totale activiteit en motivatie, komen in dit diermodel. Daarom is het belangrijk om de eventuele onregelmatigheden tussen de experimentele groepen betreffende de motieven van de dieren aan de balk en hun snelheid en niet-motorische gedrag (ophouden, zitting, trillen, richting) steekt terwijl het doorkruisen van de bundel nemen.
onderzoek naar ziekten Behavioral Alzheimer vergt op korte termijn en lange termijn geheugen testen, die hier is bereikt met behulp van de Morris water doolhof. Veel protocollen beschouwen 24 uur na de ruimtelijke leren lange-termijn geheugen 21 zijn, maar met dit protocol opimeline van 24 uur na ruimtelijk leren wordt beschouwd kortetermijngeheugen en één week wordt beschouwd lange termijngeheugen. Tijdens deze week tijdsperiode tussenin probe proeven dient de ratten niet worden blootgesteld aan andere gedragstaken of onnodige stressoren om interferentie met Morris water maze ruimtelijke referentie geheugen te voorkomen.
Met betrekking tot ruimtelijke leren, moeten onderzoekers persistent in de rat die op het platform zitten zonder springen van een bepaalde tijd. Als de rat met succes zit op het platform, maar springt af als de onderzoekers in zicht komen, moet de rat worden geplaatst of terug naar het platform geleid en die nodig is om te zitten op het platform tot de experimentator het dier opgehaald. Om het leren van het platform als de enige manier om het water te ontsnappen af te dwingen, moeten ratten niet worden opgehaald tijdens het zwemmen, tenzij in een sonde proef setting. Als ratten beheren te springen van het platform op de rand van het zwembad, kunt u overwegen het verplaatsen van de platform verder naar het midden van het zwembad aan het leren van een alternatieve vluchtweg te ontmoedigen.
Om ervoor te zorgen dat er geen ruimtelijke vooroordelen tijdens ruimtelijke en geactiveerde leren, moet de start posities en cued platform posities voor elke rat in een behandelgroep worden gerandomiseerd. Elke behandeling groep moet een representatief aantal ratten vanaf elke uitgangspositie voor ruimtelijke leren of het volgen van dezelfde start- en platform positie paradigma voor cued leren hebben. Voor het toewijzen van startposities, Vorhees en Williams presenteert een zeer gedetailleerde set van gerandomiseerde start posities voor ruimtelijke leren en gerandomiseerde start en platform posities voor cued leren 20. Dit kan direct of als leidraad worden gebruikt om posities toe te wijzen aan elke rat voorafgaand aan het begin Morris water maze testen.
Voor de analyse van Morris water maze data, de voorstellen in het protocol hierboven weergeven hoe de hier gepresenteerde gegevens zijn verkregen. de DATeen collectie in stap 3.6 van de bovengenoemde Morris water maze protocol kan worden gebruikt om verschillende meetinstrumenten die voor een cognitief gebrek beschrijven kunnen berekenen. Bijvoorbeeld, buiten de numerieke data set, tracking software biedt ook de experimentator de gelegenheid om bij te houden percelen, die extra inzicht kunnen geven in de dieren 'zoekstrategieën analyseren. Bovendien, het percentage tijd of afstand in het doel kwadrant ten opzichte van alle kwadranten kan worden gebruikt als een maat referentiegeheugen sonde studies. Het is belangrijk om in gedachten te houden dat deze co-morbide diermodellen een aantal motorische beperkingen kunnen vertonen. Het vergelijken van het zwemmen snelheid tussen de experimentele groepen kan een aanwijzing of een potentiële tekort motor heeft ook impact op het vermogen van de dieren om te presteren in de Morris water maze geven. Bovendien, om de motor prestaties te sluiten van steeds een storende factor in het water doolhof resultaat, is het raadzaam om te kijken naar weglengte naar platform te bereikennaast latency en zwemmen snelheid getoond in figuur 5 en 6. Als zwemmen vermogen wordt aangetast op enigerlei wijze padlengte is de meest nauwkeurige meting te hippocampus functie bepalen.
Hoewel er verschillende tijdlijnen die kunnen worden toegepast op al deze gedragstaken beschreven, dient de methode van het uitvoeren van elk experiment gelijk blijven. De hier gepresenteerde gegevens werd bereikt met een 21 dagen na beroerte herstel tijdstip, waarop de vroege gebeurtenissen na beroerte en hun mogelijke interactie met Ap metabolisme in de hersenen vangt. Terwijl de hier gepresenteerde gegevens waren in een comorbide model van een beroerte en de ziekte van Alzheimer, kunnen deze taken worden toegepast of aangepast aan verschillende vraagstellingen en modellen passen. Terwijl de cilindertest een minder aanpasbaar standaardprocedure, is de stralingshoek lopen taak enigszins aangepast aan de ernst van het tekort verwachte motor door het kiezen van geschikte bundel Widths. Het water doolhof is de meest veelzijdige test van alle hierin genoemde paradigma's. Zo kiest verschillende intervallen tussen het einde van de acquisitiefase en ruimtelijke referentiegeheugen probe proces eenvoudig korte en lange termijn geheugen te testen. Werkgeheugen en strategie verschuiven, twee componenten van uitvoerende functie, kan ook worden getest met behulp van het water doolhof setup. Voor de beoordeling van het werkgeheugen kan de inter-proces interval tijdens overname leren van een nieuw platform locatie worden teruggebracht tot minder dan 1 min. Overigens vormt dieren een tweede, nieuwe locatie van het platform kom na succesvolle overname van een eerste platform locatie kan testen mentale flexibiliteit of strategie shift. Gezien al deze mogelijke wijzigingen er veel flexibiliteit met deze gedragspatronen taken, hetgeen een groot voordeel naast de bovengenoemde voordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cylinder | Western University | Plexiglas Cylinder Cylinder Diameter: 23 cm Cylinder Height: 40 cm Platform Height: 30 cm Mirror Length: 35 cm Mirror Width: 26.5 cm |
This was made specifically by Western University Machine Services for our lab. Please contact your own chosen manufacturer to design this product. |
| Handheld Video Camera | JVC | GZ-E200 | |
| Video Camera Tripod | Slik | F163 | |
| AM/FM Clock Radio | Sylvania | SCR1388 | |
| White Board | Walmart | Width: 71.12 cm Height: 55.88 cm |
These can be purchased at any store (i.e. Walmart, University bookstores) |
| Dry-erase Marker | Expo | Expo Dry-erase Original Marker | These can be purchased at any store (i.e. Walmart, University bookstores) |
| Wooden Beam | Rona | Plywood Width: 2 cm Length: 100 cm |
|
| VWR General Purpose Laboratory Tape | VWR Intl. | 89097-920 | |
| iMovie '11 | Apple Inc. | Version 9.0.9 (1795) | This is the version used in this manuscript, but any other iMovie version or video editing software could be used. |
| Morris Water Maze Pool with Platform | Stoelting Co. | 60136/60035 | These are not the exact products used in the video, but these are essentially identical. |
| Platform Cue | - | - | The platform cue used was created using a small metal stand and white spherical foam ball. These can likely be purchased at any store with home improvement materials (i.e. Walmart, Rona etc.) |
| Mainstays 71" Floor Lamp | Walmart | HW-F0377SLV | |
| ANY-Maze Behavioural Tracking Software | Stoelting Co. | 60000 | There are ANY-maze® bundles that include the camera with or without a computer and accessories. |
| Compact Video Camera | Logitech | V-U0023 | |
| Laptop | Hewlett-Packard | HP Pavilion dv6 Notebook PC | Laptop Specifics: AMD A6-3420M APU with Radeon HD Graphics 1.50 GHz, 6.00 GB RAM, 64-bit operating system. |
| Americana Non-toxic Acrylic Paint | DecoArt | DAO67-9 | This can be ordered on the DecoArt site or purchased in store at DecoArt retailers. |
| Poster Board | Walmart | PA-1961 |
References
- Auld, D., Kornecook, T., Bastianetto, S., Quirion, R. Alzheimer's disease and the basal forebrain cholinergic system: relations to β-amyloid peptides, cognition, and treatment strategies. Prog Neurobiol. 68 (3), 209245 (2002).
- Huang, Y., Mucke, L. Alzheimer Mechanisms and Therapeutic Strategies. Cell. 148 (6), (2012).
- Querfurth, H., LaFerla, F. Alzheimer's disease. New Engl J Med. 362 (4), 329-344 (2010).
- Karran, E., Mercken, M., Strooper, B. The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).
- Akiyama, H., et al. Inflammation and Alzheimer's disease. Neurobiol Aging. 21 (3), (2000).
- Butterfield, D., Drake, J., Pocernich, C., Castegna, A. Evidence of oxidative damage in Alzheimer's disease brain: central role for amyloid β-peptide. Trends Mol Med. 7 (12), 548554 (2001).
- Kalaria, R. The role of cerebral ischemia in Alzheimer's disease. Neurobiol Aging. 21 (2), 321-330 (2000).
- Selkoe, D. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev. 81 (2), 741-766 (2001).
- Snowdon, D. A., et al. Brain infarction and the clinical expression of alzheimer disease: The nun study. JAMA. 277 (10), 813 (1997).
- Clarke, J., et al. Overexpression of APP provides neuroprotection in the absence of functional benefit following middle cerebral artery occlusion in rats. Eur J Neurosci. 26 (7), 1845-1852 (2007).
- Whitehead, S., Hachinski, V., Cechetto, D. Interaction Between a Rat Model of Cerebral Ischemia and β-Amyloid Toxicity Inflammatory Responses. Stroke. 36 (1), 107-112 (2005).
- Agca, C., et al. Development of transgenic rats producing human β-amyloid precursor protein as a model for Alzheimer's disease: Transgene and endogenous APP genes are regulated tissue-specifically. BMC Neuroscience. 9 (1), 28 (2008).
- Bayona, N. A., Gelb, A. W., Jiang, Z., Wilson, J. X., Urquhart, B. L., Cechetto, D. F. Propofol neuroprotection in cerebral ischemia and its effects on low-molecular-weight antioxidants and skilled motor tasks. Anesthesiology. 100 (5), 1151-1159 (2004).
- Langdon, K., Clarke, J., Corbett, D. Long-term exposure to high fat diet is bad for your brain: exacerbation of focal ischemic brain injury. Neuroscience. 182, 82-87 (2011).
- Brownlow, M., et al. Partial rescue of memory deficits induced by calorie restriction in a mouse model of tau deposition. Behav Brain Res. 271, 7988 (2014).
- Halagappa, V., et al. Intermittent fasting and caloric restriction ameliorate age-related behavioral deficits in the triple-transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiol Dis. 26 (1), (2007).
- Maalouf, M., Rho, J., Mattson, M. The neuroprotective properties of calorie restriction, the ketogenic diet, and ketone bodies. Behav Brain Res. 59 (2), (2008).
- Tillerson, J. L., et al. Forced limb-use effects on the behavioral and neurochemical effects of 6-hydroxydopamine. Neuroscience. 21 (12), 4427-4435 (2001).
- Sierksma, A., et al. Improvement of spatial memory function in APPswe/PS1dE9 mice after chronic inhibition of phosphodiesterase type 4D. Neuropharmacology. 77, (2013).
- D'Hooge, R., De Deyn, P. P. Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Behav Brain Res. 36 (1), 60-90 (2001).
- Vorhees, C., Williams, M. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nat Protoc. 1 (2), 848-858 (2006).
