Summary
För att undersöka komorbida Alzheimers sjukdom (AD) och stroke tillstånd i en ny modell, tre beteende uppgifter beskrivs som bedömer både motorstyrning och kognitiva beteenden. Dessa uppgifter innefattar balk promenad uppgift, cylinder uppgift och Morris vattenlabyrint.
Abstract
Alzheimers sjukdom (AD) är en försvagande neurodegenerativ sjukdom som resulterar i neurodegenerering och minnesförlust. Medan ålder är en viktig riskfaktor för AD har stroke också varit inblandad som en riskfaktor och en förvärrande faktor. Den komorbiditet av stroke och AD resulterar i försämrad slagrelaterade motorstyrning och AD relaterade kognitiva brister i jämförelse med varje tillstånd ensam. För att modellera det kombinerade tillståndet av stroke och AD, en roman transgen råttmodell av AD, med en muterad form av amyloid föregångsprotein (ett nyckelprotein involverat i utvecklingen av AD) inkorporeras i dess DNA, kan beräknas med en liten ensidiga striatala stroke.
För en modell med en kombination av både stroke och AD, måste beteendetester som bedömer stroke relaterade motorstyrning, förflyttning och AD relaterad kognitiv funktion implementeras. Cylinder uppgift innebär en kostnadseffektiv, mångsidig apparat som bedömer spontan forelimb motor användning. I denna uppgift är en råtta placeras i en cylindrisk anordning, där råttan kommer spontant bakre och kontakta cylinderns vägg med sina framben. Dessa kontakter anses frambens motor användning och kvantifieras under videoanalys efter provning. En annan kostnadseffektiv motor uppgift genomförs är balk promenad uppgift, som bedömer forelimb kontroll, bakben kontroll och förflyttning. Denna uppgift innebär en råtta går över en träbalk gör det möjligt att bedöma lem motorstyrning genom analys av forelimb besked, bakdelen halkar och faller. Bedömning av inlärning och minne avslutas med Morris vattenlabyrint för denna beteendeparadigm. Protokollet börjar med spatial inlärning, varvid råttan lokaliserar ett stationärt dold plattform. Efter spatial inlärning, är plattformen avlägsnas och både kortsiktiga och långsiktiga spatiala referensminnet bedöms. Alla tre av dessa uppgifter är känsliga för beteendeskillnader och avslutas inom 28 dagar för denna modell, vilket gör detta paraparadigmet tidseffektiv och kostnadseffektivt.
Introduction
Alzheimers sjukdom (AD) är den vanligaste formen av demens i den äldre befolkningen och en försvagande neurodegenerativ sjukdom. Histopatologiskt, presenterar AD sig som amyloid plack, neurofibrillära trassel och neuronal förlust. Amyloid plack består i huvudsak av beta-amyloidpeptid (Ap) som har framställts genom en förändrad proteolytisk spjälkning av amyloid föregångsprotein (APP) genom β-sekretas och y-sekretas enzymer 1,2,3. Klyvningsprodukten, AP, avlagringar i hjärnan skapar patologiska amyloida plack och har toxiska effekter på hjärnan som kan leda till de karakteristiska lärande nedskrivningar och minnesförlust. Alla dessa steg tillsammans kallas den "amyloid kaskadhypotesen" 3,4. Även om denna hypotes är viktigt när man undersöker AD, har andra cellförändringar befunnits föregå dessa plackformationer som avviker från den ursprungliga amyloidkaskadvägen. dessa andracellförändringar tros bidra till tidig minnesförlust, lärande nedskrivningar och andra kognitiva dysfunktioner som är involverade i AD före plackbildning 3,5,6.
Med AD blir allt vanligare, är riskfaktorer för utveckling av AD blir en mycket viktig fokus för forskningen. Även ålder är den viktigaste riskfaktorn för sporadiska former av AD, har andra riskfaktorer identifierats, inklusive stroke 7,8. Stroke är inte bara en riskfaktor, men det kan också förvärra redan finns demenssjukdomar. Till exempel, kliniskt, utvecklingen av AD har visat sig vara sämre hos patienter som tidigare hade upplevt stroke 9. Dessutom har ökat APP expression och Ap ackumulering funnit i experimentella djurmodeller av Ap toxicitet i kombination med inducerad stroke 10,11. Eftersom det är detta viktigt samspel mellan stroke och AD, är det viktigt att dessa två sjukdomar undersökas närmaretillsammans i komorbida modeller för att bättre förstå patofysiologi och beteenden inblandad i båda villkoren.
För att undersöka komorbida förhållanden, hade en lämplig modell att utvecklas i vilka en stroke kan interagera med Ap för att producera AD liknande patologi. För första gången var en APP21 transgen råtta som har en muterad human APP-gen införlivas dess DNA används för att uppnå en lämplig modell av AD. Mutationerna är den svenska dubbelmissense och Indiana enda missense-mutationer, som har båda varit inblandade i familjära former av AD 4,8,12. I avsaknad av ytterligare förolämpning, denna råttmodell åldrar utan att utveckla de karakteristiska Ap plack eller neurofibrillära nystan 12. Därför, i ett försök att inducera AD-liknande beteende patologi, är en liten slaglängd infördes in i den högra striatum för att efterlikna de små subkortikala stroke ofta närvarande i demenspatienter 9. Slag i APP21 transgen rat förkroppsligar co-morbid tillstånd och möjliggör undersökning av olika typer av beteendeförändringar inblandade i båda sjukdomstillstånd. I synnerhet denna induktion av AD-liknande patologi och kognitiva brister i den vuxna råttan tillåter oss att undersöka de tidigaste molekylära och kognitiva förändringar som föregår AD.
Eftersom målet är att fastställa de första tecknen på beteendeförändringar och eftersom både stroke och AD har mycket tydliga beteende patologier, när man studerar co-morbid modell, beteende uppgifter måste bedöma en mängd olika beteende fenotyper. Det finns ett batteri av relativt känsliga tester som kan göras för att analysera motoriska och kognitiva beteenden i gnagarmodeller som innebär en mängd olika paradigmer och utrustning. Att specifikt analysera forelimb och bakbenen motorik, har cylinder uppgiften och balk promenad uppgift genomförts för att upptäcka motoriken och övervaka förflyttning i den här modellen. Andra känsliga uppgifter för att särskilt bedöma böter forelimb motorisk (dvs. trappan uppgift och enda pellet nå uppgift) kräver brist på mat 11,13,14. För att undvika någon av de kända effekterna av brist på mat på sjukdoms patologier 15,16,17, har dessa tester ansetts olämpliga för denna studie. Cylinder uppgift bedömer spontana användning av råttans framben under uppfödning i en ny miljö och kan detektera asymmetri mellan framben hos råttor med unilaterala stroke 10,18. En stor fördel med denna uppgift är att apparaten kan användas för andra beteende uppgifter, såsom Porsolt tvingas simma uppgift 19. I motsats till cylinder uppgiften, den balk promenad uppgift möjliggör även analys av bakbenen och forelimb motorisk kontroll, förutom locmotion 10,14. Beam gång innefattar en rörelsekomponent, en balans komponent och skicklig fot placering. Båda dessa tester är kostnadseffektiva, enkelt och tidseffektivt och belysa effekterna av stroke och AD på d ifferences i lem funktion.
Bortsett från förändringar i motorik, AD innebär minnes underskott som kan presentera i tidiga skeden av sjukdomsförloppet. När man behandlar AD liknande patologier i en gnagare modell, är det viktigt att hippocampus beroende inlärning och minne bedöms eftersom hippocampus är en viktig hjärnans struktur påverkas till stor del i AD 2. Hippocampus är en viktig hjärnregion för rumslig inlärning och minne och dess funktion kan testas med användning av olika maze paradigm hos gnagare. En av de mest utbredda labyrint uppgifter för gnagare modeller av olika sjukdomar är Morris vattenlabyrinten 20. Morris water maze utnyttjar spatiala ljud för att hjälpa till råttan i att lokalisera en stationär gömda plattformen och testar rumsliga referensminnet när plattformen avlägsnas. En värdefull fördel med vattenlabyrinten inställning är att det är mycket anpassningsbar beroende på den föreslagna forskningsfrågan 20.
tält "> För första gången har den teknik som beskrivs använts för att bedöma motor och kognitiv funktion i en ny co-morbid modell av stroke och AD råtta. involverar små streck i en APP21 transgen råttmodell. komorbiditet uppnåddes genom att inducera vasokonstriktion av blodkärlen i striatum för att producera en liten stroke i APP21 transgena råttor. detta stroke modell har väl etablerat som en co-morbid tillstånd i en alternativ råttmodell av AD 11. Advancement i denna roman APP21 transgen råttmodell var avsedd att skapa en mer translationellt värdefull modell. Medan beteende uppgifter beskrivs med en co-morbid stroke och AD råttmodell, dessa uppgifter kan användas vidare till andra modeller av stroke eller modeller av andra neurologiska sjukdomar (dvs Parkinsons sjukdom). Den allmänna metod som beskrivs kommer att vara allmänt tillämplig på dessa andra sjukdomstillstånd, men beteendetidslinjer och paradigm kan kräva ändringar grundar sig på föreslagna research fråga och modell. Förutom att vara anpassningsbara, de uppgifter som anges är effektiva i att visa mindre underskott, samtidigt som kostnaden och tidseffektivt.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den lämpliga institutionella djuretik kommitté ska godkänna alla beteende förfaranden före start experiment. Alla djur arbete som beskrivs här godkändes av Western University Animal Använd underutskottet och följer den kanadensiska rådet om Animal Care riktlinjer. Dessa djurexperiment utfördes under den ljusa fasen.
1. Cylinder Task för Assessment Gross Forelimb Motor
- utrustning Setup
- Förvärva en plexiglascylinder med en perforerad lock som kommer att rymma storleken på råtta användes för experimentet. Storleken hos cylindern bör inte tillåta råttan att nå toppen när uppfödning och den bör göra det möjligt för 2 cm mellan väggen och råttans nos och basen av råttans svans. Standardstorleken på en cylinder är 23 cm i diameter och 40 cm i höjd för en sex månader gammal (400-600 g) råtta.
- Placera en spegel i 45 ° vinkel under cylinderapparaten med cylindern sitter på en Plexiglas stå eller någon annan form av stöd ca 30 cm ovanför bordsskivan.
- Ställa in en videokamera på ett stativ på ett lämpligt avstånd för att visualisera hela diametern av cylindern i spegeln på videokameran.
- Vrid belysningen till en dimmer inställning och spela vitt brus i rummet (dvs låg volym, subtila musik) för att minska effekten av plötsliga höga ljud. Detta bör bidra till att främja rörligheten och förhindra frysning på grund av höga ljud.
- Experimentell procedur
- Flytta råttorna i testrummet 30 min före starten av första försöket att acklimatisera råttor till rummet med musik spelar och dimmer belysning.
- Skriv motsvarande djur och prov information (dvs. djur nummer, dag i tidslinjen och provnummer) på en liten whiteboard. Placera denna styrelse framför spegeln.
- Tryck spela in på videokameran med den vita linjen framför spegeln, plocka upp råttan nära basen of svansen, placera råttan i cylindern och säkra locket. Står ut på sidan av cylindern för att undvika att störa videoinspelning.
- Ta bort den vita linjen från framför spegeln och låt videokameran spela in råttan i cylindern under 5 minuter (använda en timer för att spela in 5 min från när den vita linjen avlägsnas). Detta är ett försök.
- Rengör cylinder med pappersduk och vatten efter en rättegång.
- Upprepa steg 1.2.2-1.2.5 två ytterligare gånger för att uppnå totalt tre försök. Det bör finnas en 20-30 min inter-försökstiden för att minska risken för tillvänjning till cylindern. Under denna tid, köra cylinder prövningar för de andra råttorna.
- video Analysis
- Importera videokamera filer till videoredigeringsprogram (dvs. iMovie)
- Sammanställa videor i clips för varje försök. Stänga av volymen av videon och minska hastigheten av videon att 25% av den ursprungliga.
- Räkna antalet forelimb kontaktermed cylinderväggen för vänster och höger framben. Samtidiga vänster och höger kontakter, räkna dessa forelimb kontakter som "båda". Tänk på att videon spelas in genom en spegel, vad som verkar vara vänster framben i videon motsvarar djurets högra framben i verkligheten.
- Beräkna procent användning av den drabbade forelimb (kontralaterala till stroke) med hjälp av följande ekvation: [{(påverkas kontakter + ½ bilaterala kontakter) / totalt antal kontakter} x 100]. Utförandet av både vildtyp grupper och den transgena gruppen utan stroke anses jämförelsegrupper för att utvärdera presentation av sjukdoms inducerad problem.
2. Beam-promenad uppgift för bedömning Gross Motor
- utrustning Setup
- Skaffa en slät förseglad balk som är 2 cm bred och ca 120 cm lång (optimal bredd för en 200-600 g råtta).
- Placera två tabeller eller hyllor unsina 100 cm mellanrum. Ytorna på varje enhet bör vara ungefär 40 cm över marken.
- Säkra båda ändarna av balken till bordet eller hyllor yta med användning av tejp. Cirka 1 m stöds baffellängd bör nu lyftas 40 cm över marken.
- Ställa in en videokamera på ett stativ, fånga hela längden av balken. För att öka kontrasten i videon, överväga att införa en svart bakgrund bakom balken vid användning av vita råttor.
- Experimentell procedur
- Flytta råttorna i testrummet 30 min före starten av första försöket att acklimatisera råttor till rummet med musik spelar och dimmer belysning.
- Placera råttan hem bur- eller miljöanriknings rör vid en ände av balken och placera råttan i den andra änden av balken.
- Genomför några icke-inspelad körningar två dagar före experimentella försök. Låt råttan utforska området guide råttan mot balken genom att hålla basen på råttaSvans.
- När råttan har passerat strålen, flytta buren eller röret till den andra änden av balken och upprepa. När råttan korsar strålen fritt i endera riktningen, är träningspasset över. Håll antalet träningsåk konsekvent bland alla djur.
- Skriv motsvarande djur och prov information (dvs. djur nummer, dag i tidslinjen och provnummer) på en liten whiteboard. Tejpa denna whiteboard på väggen bakom balken.
- Placera råttans buren eller miljön anrikning slang vid ena änden av balken.
- Tryck på RECORD på videokamera och plocka råttan upp av basen av svansen och plats vid änden av balken motsatt hemmaburen eller slangen.
- Spela hela den rättegång, som avslutas när råttan har framgångsrikt avslutat korsa hela längden av den förhöjda strålen. Om rått pauser halvvägs över strålen, försiktigt nackskinnet råtta vid svansroten eller röra råttans svans försiktigtför att främja rörelsen över strålen. Tryck inte råtta framåt på något sätt.
- Åter göra prövningar där råttan vänder i sidled medan på balken stannar upprepade gånger promenader eller promenader inkonsekvent. Om en råtta faller och fortsätter att hänga på strålen, försiktigt skopa upp råtta och placera den tillbaka på balken vid läget för hösten och fortsätta försöket.
- Flytta buren eller slangen till den andra änden av balken, ändra försöket # på den vita linjen och registrera den efterföljande försök.
- Upprepa denna procedur tills totalt 6 försök har genomförts, med 3 försök registreras för varje riktning. Alla 6 prövningar för en råtta kan spelas in innan försöken för nästa råtta.
- video Analysis
- Importera videokamera filer till videoredigeringsprogram (dvs. iMovie).
- Samman videor till klipp för varje försök och stänga av ljudet i videon. Analysera varje videoklipp bildruta för bildruta.
- Räkna antaletav den totala steg råttan tar att gå hela längden av balken och det totala antalet vänster och höger bakben och forelimb halk-och totala antalet fall. Utförandet av både vilda typgrupper och transgena gruppen utan stroke betraktas i jämförelse med co-morbid grupp för att utvärdera utvecklingen av underskott som är unika för co-morbid tillstånd.
3. Morris Water Maze för hippocampus-beroende Spatial lärande och referens minne
- utrustning Setup
- Fäst en videokamera placerad ovanför mitten av en rund pool (148 cm diameter och 58 cm djup). Passa in de fyra utsedda kvadranter ordentligt med konturerna av poolen i spårningsprogrammet.
- Fyll rund pool med vatten ca 36 cm djup. Vattnet bör värmas till rumstemperatur genom att fylla poolen några dagar innan du påbörjar försöksprotokoll.
- Lägg svart giftfri akrylfärg until vattnet är ogenomskinlig vid användning av vita råttor. Använd en ljus färg, som vitt, för mörkare färgade råttor.
- Omge poolen med tomma väggytor, inklusive rumsavdelare om det behövs. När i poolen, bör råttan inte kunna se praktiker.
- Klipp 4 stora olikformade ledljud från olika färger av affischen styrelse och bifoga en form på väggen per utsedda norr, öster, söder och sydväst pool platser. Dessa signaler bör vara något högre än kanten av poolen.
- Slå på en radio på låg volym i den nordvästra kvadranten för att förhindra råttan från att distraheras av oväntade höga ljud under testning.
- Placera en cirkulär plattform (11,5 cm i diameter, yta 2-3 cm under vattenytan) i mitten av målet kvadranten.
- Stäng av huvudrummet belysningen och vrid på en golvlampa på motsatt sida av rumsavdelare till poolen för att belysa området.
- dator~~POS=TRUNC
- Set 4 dagar i följd med 4 försök med 90 sekunder vardera för spatial inlärning experimentet.
- Set 2 separata sondexperiment av 30 sekunder vardera vid 24 h efter den sista spatial trial inlärning och en vecka efter den första sonden experimentet.
- Uppsättning cued inlärningsförsök vid 4 försök per dag under 2 dagar i följd med start 24 timmar efter den andra sonden experimentet. Varje försök bör vara 60 sek totalt.
- För varje steg, ställ in testning ordning så att det finns en 20 min inter-försöksintervallet mellan varje försök för varje given djur. Andra djur kan köras under denna inter-försöksintervallet, så länge som varje djur upprätthåller en 20 min inter-försöksintervallet.
- Se till att plattformen position skall fastställas av försöksledaren och att alla andra zoner är frånböter av den utsedda plattformens läge.
- Ställ in programmet för att manuellt starta och avsluta varje försök.
- Placera den cirkulära plattformen i sydvästra kvadranten. Det bör ligga i linje med den cirkulära betecknas "plattform" område i kvadranten på datorprogrammet.
- Start positioner runt poolen bör randomiseras för varje råtta. Representera alla startpositioner i varje behandlingsgrupp. Ingen råtta startar från nordöstra läget för eventuella rumsliga lärande prövningar i paradigm presenteras för att möjliggöra en ny startposition under sondtestning.
- Håll råtta vid basen av svansen och försiktigt placera den i vattnet längs väggen av poolen på den utsedda startposition och snabbt flytta ut ur råttans syn.
- Har den andra försöks starta mjukvara så snart råttan är i vattnet. En timer ska börja räkna upp från 0 på spårningsprogram. Om råttan lokaliserar plattformen, har den andra försöksledaren stoppar försöket på datorn och lämna rat på plattformen under minst 30 sek innan hämta den. Om råttan hoppar av plattformen innan försöket stoppas på datorn fortsätter rättegången.
- Om råttan inte hittar plattformen i den tilldelade försökstiden, styra råttan på plattformen med hjälp av din hand (antingen göra råtta följa din hand eller styra råtta genom basen av svansen). Håll råttan på plattformen under 30 sek.
- Ta bort råttan från poolen av basen av svansen på försöksledaren arm som är täckt med en handduk eller låta råttan klättra upp på en bärbar yta.
- Upprepa steg 3.3.3-3.3.7 för totalt 4 försök per råtta. Det bör finnas en inter-trial intervall på 20 min för varje råtta.
- Återgå råttorna till sina hem bur under en värmelampa under minst 10 minuter efter råttans slutliga prövning spatial inlärning.
- Fortsätt exact samma spatial inlärning protokoll för dag 2 till dag 4 av spatial inlärning.
- Dag 2-4, inte hålla råttan på plattformen längre. Låt råttan att sitta på plattformen utan stöd till 30 sekunder med experimentatorerna utom synhåll. Detta kan göras under senare försök på dag ett på tillfälle.
- Ta plattformen från poolen. Se till att tidigare plattformsläget förblir definieras på datorn (cirkel i sydvästra kvadranten).
- Placera råttan i vattnet längs väggen av poolen på den nordöstra position och snabbt flytta ut ur råttans syn. Användning av nya nordost startposition säkerställer att råttan påminner plattformsläget oberoende av tidigare utbildade startpositioner.
- Har den andra försöks starta mjukvara så snart råttan är i vattnet. En timer ska börja räkna upp från 0 på mjukvara.
- Hämta råtta frånsydväst kvadranten av poolen vid basen av svansen och håll på en handduk täckt arm eller låta råttan klättra upp på en bärbar yta.
- Återgå råttorna till sina hem bur under en värmelampa under minst 10 minuter efter varje råttas sond rättegång.
- Upprepa detta experiment (steg 3.4.1-3.4.5) en vecka senare.
- Använd tejp för att fästa en 4 cm diameter vit sfärisk kö på ett stativ som är 8,5 cm på plattformen (totalhöjd på cue är 12,5 cm). Den övre delen av den sfäriska cue kommer att vara minst 8,5 cm över vattennivån.
- Ta bort ledljud från väggar som omger poolen.
- Slumpmässigt plattformspositioner och börja positioner för varje råtta i varje grupp. Alla plattform och startpositioner bör vara representerade för varje behandlingsgrupp.
- Placera plattformen i utsedda plattformsområdet och definiera i mjukvara.
- Placera råttan i vattnet längs väggen av poolen vid than betecknade startposition och snabbt flytta ut ur råttans syn.
- Har den andra försöks starta mjukvara så snart råttan är i vattnet. En timer ska börja räkna upp från 0 på mjukvara.
- När råttan når plattformen, har den andra försöksledaren stoppar försöket på datorn. Om råttan hoppar av plattformen, fortsätter försöket. Innan hämtning av råtta, tillåter råttan att sitta på plattformen under 15 sek.
- Hämta råtta från poolen vid basen av svansen och håll på en handduk täckt arm eller låta råttan klättra upp på en bärbar yta.
- Kontrollera korgens läge för nästa råtta och flytta plattformen till motsvarande område som definieras i mjukvara.
- Upprepa steg 3.5.4-3.5.9 för följande 3 prövningar. Det bör finnas en inter rättegång intervall av 15 min.
- Återgå råttorna till sina hem bur under en värmelampa under minst 10 minuter efter varje råtta final cued lära rättegång.
- Fortsätta med samma protokoll för dag 2 av cued inlärning.
Obs: Tid i zoner, reste avstånd i zoner, medelhastighet, antal poster i zoner och tid till första inträde i zoner används ofta.
- Analysera tid och avstånd för att nå plattformen zonen och medelhastigheten per dag av rumslig och cued lära sig. För prob experiment, analysera latensen till första inträde i målzonen som en rå tid eller en procentuell förändring från sonden 1 till sond 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beteende uppgifter som beskrivs användes för att demonstrera effekterna av stroke i ett APP21 transgen råttmodell av Alzheimers sjukdom. Kombinationen av stroke och APP21 transgen förväntas leda till större motor underskott i de drabbade extremiteterna, liksom ökade minnesbrister.
Cylinder uppgift bedömde brutto forelimb motorik och representeras som användningen av drabbade forelimb. Dessutom var den balk promenad uppgift användas för att specifikt bedöma bakbens motorisk funktion och förflyttning. Eftersom slaget framkallades i den högra striatum, den vänstra frambens väntas visa en motor underskott om man är närvarande. De data som presenteras i både figur 2 och 3a och 3b inte statistiskt visa att komorbida råttor har en forelimb eller bakbenen underskott respektive. Även om dessa djur inte appäron att ha forelimb eller bakbenen motoriken, de verkar ha mindre skillnader i motorisk funktion som hänför sig till förflyttning. I balk promenad uppgift totalt steg ökade signifikant i komorbida transgena råttor med stroke (p <0,05, figur 3c), vilket tyder på att strålen-walk uppgift är tillräckligt känslig för att plocka upp små förändringar i gång och förflyttning. Den lilla striatala stroke modell som används producerar små streck som sannolikt för små för att producera några större motoriken, men underskott har visats tidigare i andra strokemodeller med dessa två uppgifter 10,14. Här kan dessa uppgifter helt enkelt övervaka motorik och förflyttning när man undersöker de parametrar som presenteras.
Hippocampus beroende spatial inlärning och referensminnet effektivt kan bedömas med hjälp av Morris vattenlabyrint. Det fanns inga uppenbara skillnader i lärande mellan grupper (Figur 5a > Figur 5b), därför skillnader i lärande kan inte redogöra för eventuella skillnader i minnesprestanda. APP21 transgena råttor med stroke visade en stark långsiktig referensminnet underskott jämfört med transgena råttor utan stroke och vild typ råttor med stroke (p <0,05, figur 5C).
Cued inlärning är klar för att säkerställa att råttor har lika möjlighet att använda visuella ledljud att lokalisera plattformen i Morris vattenlabyrint. Som visas i figur 6a och figur 6b, fanns inga skillnader observerades i latens eller banlängden för att nå plattformen under cued lärande mellan grupperna. Dessutom den genomsnittliga simma hastigheten var konsekvent mellan grupperna (figur 6c) och visar att motivationen att fly och simma förmågor var lika mellan grupperna.
gur 1 "src =" / filer / ftp_upload / 53089 / 53089fig1.jpg "/>
Figur 1:. Tidslinje för motor och bedömningar kognitiv beteende Stroke framkallande operation dag tilldelas dag 0 och alla test dagar är i hänvisning till denna dag. (A) Pre-operation och efter operation testning för cylinder uppgift (C) och balk promenad uppgift (BM). (B) Morris vattenlabyrint spatial inlärning, sond testning och cued lärande. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Cylinder Task Procent användning av drabbade forelimb beräknades med ekvationen i steg 1.3.4 och standardiseras till dag -3 baslinjevärden. Den röda streckade linjen annotates 1,0 värde som representerar lika användning av varjeframben i cylindern uppgiften. Vildtyp förkortas som WT och transgena förkortas som TG. Antalet djur är som följer: WT + saltlösning (n = 7), WT + stroke (n = 8), TG + saltlösning (n = 8), TG + stroke (n = 6). Alla värden presenteras som medelvärde ± SEM. (Två-vägs ANOVA, Tukeys post hoc). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Beam-walk uppgift Summan av alla besked görs med (A) påverkas och (B) opåverkad bakdelen över 5 försök presenteras som ett förhållande av det totala antalet steg att korsa strålen. Värden standardiserades till baslinjevärden enligt följande: efter operationen förhållande - innan operation förhållande. (C) De totala steg att korsa balken o n dag -7 och dag 21. Vildtyp förkortas WT och transgena förkortas TG. Antalet djur är som följer: WT + saltlösning (n = 6), WT + stroke (n = 6), TG + saltlösning (n = 6), TG + stroke (n = 5). Alla värden presenteras som medelvärde ± SEM och asterisker indikerar statistisk signifikans. (One-way ANOVA, Tukeys post hoc, p <0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Program view visar sektioner som krävs för installation och köra ett experiment Några markerade funktioner i spårningsprogram som används för Morris vattenlabyrint.. Apparaten vy med video av poolen presenterade ovan visas endast som presenteras när fliken test.3089fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Fysisk inlärning och referensminnet i Morris vattenlabyrint Spatial learning mättes genom (A) latens och (B) banlängd för att nå plattformen.. (C) Referens minne mättes som procentuell förändring av latens till första inträde i målzonen dagen 19 probtest jämfört med dag 12 sondtest. Vildtyp förkortas som WT och transgena förkortas som TG. Antalet djur är som följer: WT + saltlösning (n = 8), WT + stroke (n = 7), TG + saltlösning (n = 7), TG + stroke (n = 8). Alla värden presenteras som medelvärde ± SEM och asterisker indikerar statistisk signifikans. (Tvåvägs ANOVA för spatial inlärning och envägs ANOVA för sondprovning, Tukeys post hoc, p &# 60;. 0,05) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6:. Cued lärande i Morris water maze (A) Latency och (B) banlängd att nå plattform anges som ett genomsnitt av alla åtta försök av lärande. (C) Swim hastighet presenteras som ett genomsnitt av alla åtta försök av lärande. Vildtyp förkortas som WT och transgena förkortas som TG. Antalet djur är som följer: WT + saltlösning (n = 8), WT + stroke (n = 7), TG + saltlösning (n = 7), TG + stroke (n = 8). Värdena presenteras som medelvärde ± SEM. (One-way ANOVA, Tukeys post hoc). Klicka här för att se en större version av dennafigur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kombinationen av stroke och Alzheimers resultat sjukdom i mycket tydliga beteende sjukdomar som kan påverka både motor och kognitiv funktion beroende på hur allvarligt varje tillstånd. Således är det nödvändigt att använda sig av en mångfald beteende uppgifter för att bestämma de individuella bidragen av dessa tillstånd, samt ge en inblick i de kombinerade och potentiellt interaktiva effekter i co-morbid tillstånd. De data som presenteras visar tre kostnadseffektiv, tidseffektivt och känsliga beteende uppgifter för att utvärdera motorik och hippocampus beroende spatial inlärning och referensminnet i en ny co-morbid APP21 transgen råttmodell med stroke. Förutom de data som presenteras har dessa uppgifter kontrollerats i allvarligare stroke modeller 10,14,18, liksom i modeller av AD 8,16 och bör vara allmänt gäller för olika modeller av båda sjukdomarna.
Med detta sagt, är ingen uppgift utan limitations. För motor uppgifter specifikt, kan vissa felsökning krävas om råttor vänja till cylindern och balken. I cylinder uppgift, kan en motivation att krävas för att säkerställa råttan uppnår den lämpliga mängden av forelimb kontakter med väggen hos cylindern. För att uppnå detta resultat, kan tillämpningen av en icke-toxisk doft på den perforerade lock eller cylinderns vägg motivera råttan att bakåt och i kontakt med väggen av cylindern med sina framben. Till exempel kan en liten bit av jordnötssmör eller vaniljextrakt smetas på innerväggen nära toppen av cylindern för att ytterligare uppmuntra stillasittande råttor för att undersöka cylinderväggarna. En ring av färgad tejp kan också appliceras på insidan av cylindern ¾ från botten av cylindern. Ett annat sätt att främja uppfödning innebär att ta bort en stillasittande råtta och återinföra den till cylindern efter en viss tid har gått, som har åstadkommits med en inter-rättegången intervall i protokollet. Pälsthermore, beroende på höjden av cylindern jämfört med längden hos råttan, avlägsnande av perforerade locket halvvägs genom en trial kan uppmana uppfödning och forelimb kontakt med cylinderväggen. Detta bör inte göras om det finns en möjlighet råtta kommer att kunna fly från cylindern under testning. Dessa motiv kan bidra till att öka antalet föder, men bör inte påverka användningen av vänster och höger framtassar under väggkontakt. Om det fortfarande finns ett stort problem om ett otillräckligt antal forelimb kontakter efter genomförandet av dessa förslag, kan en rättegång avslutas efter det att rått har gjort totalt 10 föder oavsett hur lång tid. Detta skulle vara annorlunda än de 5 minuters försök genomförda i protokollet ovan, eftersom varje råtta skulle nå totalt 10 föder vid olika tidpunkter. Med en modell för stroke och AD komorbiditet, är det viktigt att vara medveten om att förändringar i kognitiv förmåga, ångest och aktivitetsnivåer kan utvecklas i dessa råttor. While sådana förändringar inte direkt påverkar den primära resultatet av cylinder uppgiften (spontan frambens användning under uppfödning), inspelning andra observationer kan utgöra värdefulla bevis för icke-motorrelaterade beteendeförändringar som kan utvecklas. I cylinder uppgiften, kan sådana beteenden eventuellt följas genom att analysera ökas eller minskas uppfödning beteende, som uppfödning är en form av motiverade undersökande beteende. Vidare kan andra åtgärder såsom tid grooming, svarvning och landning kan ge insikt om ångest och andra fysiska underskott respektive.
När det gäller den balk promenad uppgift, genom att använda buren anrikning slangen är vanligtvis tillräckligt med motivation för råttan att gå över strålen. Om en råtta fortsätter att stoppa halvvägs längs balken, en doftande matbelöning eller behandla, såsom jordnötssmör eller precisionssockerpellets, kan införas i tillägg till de anriknings rören vid den motsatta änden. Om godsaker ges, se till att alla råttor får abut samma mängd godsaker på att testa dag, oberoende av deras resultat. Dessutom, snarare än att köra alla sex prövningar för en råtta innan du flyttar till nästa råtta, studierna kunde fördelas. Till exempel kan de två första försöken fyllas i för alla råttor innan nästa två. Detta kan förhindra det ökade antalet stopp halvvägs över balken som kan uppstå på senare prövningar när vissa råttor blivit alltför bekväm med balken miljön. En annan möjlig lösning om täta stopp inträffar är att minska antalet försök. Detta skulle kunna genomföras genom att placera en spegel bakom strålen att analysera både vänster och höger ben i varje försök, vilket gör antalet försök sänkas. Dessutom kan tillvänjning till balken ske efter flera testsessioner och kan resultera i råttor vägrar att korsa balken och förbli sittande på balken, trots alla ansträngningar att motivera djuret. På grund av detta problem, bedömningar balk är inte idealiskt för upprepade tester i long variga experiment. I protokoll som utnyttjar upprepade tester, kan ersättningen också blivit ett bekymmer utöver motivation. För att övervinna frågor om ersättning när de korsar strålen, kan en avsmalnande balk användas i stället för en vanlig träbalk 21.
Återigen, kan kognitiva förändringar, bland annat ökad ångest och förändringar i den totala aktivitetsnivå och motivation, förekommer i denna djurmodell. Därför är det viktigt att ta del av eventuella oegentligheter bland experimentgrupperna när det gäller djurens motivation att korsa strålen liksom deras hastighet och icke-rörelsebeteende (stopp, sittande, darrningar, orientering) medan korsar strålen.
Behavioral Alzheimers sjukdom forskning kräver kortsiktiga och långtidsminnet testning, som har uppnåtts här med Morris vattenlabyrinten. Många protokoll anser 24 timmar efter spatial inlärning att vara långtidsminnet 21, men med detta protokoll påImeline av 24 h efter spatial inlärning anses korttidsminne och en vecka anses långtidsminnet. Under denna veckas period i-mellan sond prövningar bör råttorna inte utsättas för andra beteende uppgifter eller onödiga påfrestningar för att undvika störningar med Morris vattenlabyrint rumsliga referensminnet.
När det gäller spatial inlärning, bör praktiker vara ihållande att kräva råttan att sitta på plattformen utan att hoppa för en viss tid. Om råttan framgångsrikt sitter på plattformen, men hoppar av som praktiker kommer i sikte, bör råttan placeras eller styras tillbaka till plattformen och som krävs för att sitta på plattformen tills försöks hämtar djuret. För att verkställa inlärningen av plattformen som det enda sättet att undkomma vattnet, bör råttor inte plockas upp medan du simmar, om inte i en miljö sond rättegång. Om råttor lyckas hoppa från plattformen på kanten av poolen, överväga att flytta platform längre mot mitten av poolen för att avskräcka inlärning av en alternativ utrymningsväg.
För att se till att det inte finns några rumsliga fördomar under rumslig och cued lärande bör startpositioner och cued plattforms positioner för varje råtta i en behandlingsgrupp randomiseras. Varje behandlingsgrupp bör ha ett representativt antal råttor med början från varje utgångsläge för rumslig inlärning eller efter samma start och plattformsläget paradigm för cued lärande. För att tilldela startpositioner, Vorhees och Williams presentera en mycket detaljerad uppsättning randomiserade positioner start för spatial inlärning och randomiserade start- och plattforms positioner för cued lärande 20. Detta kan användas direkt eller som en riktlinje för att tilldela positioner på varje råtta före början Morris vattenlabyrint testning.
För analysen av Morris vattenlabyrintuppgifter, förslagen i protokollet ovan visar hur de data som presenteras här förvärvades. daten samlad i steg 3,6 av ovanstående Morris vattenlabyrinten protokoll kan användas för att beräkna olika resultatmått som kan vara användbara för att beskriva en kognitiv underskott. Till exempel, utöver den numeriska datamängden, mjukvara erbjuder också försöks möjlighet att analysera spår tomter, som kan ge ytterligare insikter i djurens sökstrategier. Dessutom har andelen tid eller tillryggalagd sträcka i målet kvadranten i förhållande till alla kvadranter kan användas som ett mått på referensminne i sondförsök. Det är viktigt att hålla i minnet att dessa komorbid djurmodeller kan uppvisa vissa motoriken. Jämföra simma hastighet bland experimentgrupperna kan ge en indikation om en potentiell motor underskott påverkar djurens förmåga att utföra i Morris vattenlabyrint. Vidare att utesluta motorprestanda blir en confounding faktor i vatten labyrint resultatet, är det rekommenderas att titta på väg längd för att nå plattformförutom att latens och simma hastighet såsom visas i fig 5 och 6. Om simkunnighet äventyras på något sätt, är väglängd den mest exakta mått för att bedöma hippocampus funktion.
Även om det finns olika tidslinjer som kan tillämpas på alla dessa beteende uppgifter som beskrivs, bör metoden för att köra varje försök att förbli densamma. De data som presenteras här uppnåddes med en 21 dagars post-stroke återvinning tidpunkt som fångar den tidiga händelser efter stroke och deras potentiella samspel med Ap ämnesomsättningen i hjärnan. Medan de data som presenteras här var i en co-morbid modell av stroke och Alzheimers sjukdom, kan dessa uppgifter tillämpas på eller anpassas för att passa olika forskningsfrågor och modeller. Medan cylindertestet är en mindre modifierbar standardförfarande, kan strålen promenad uppgiften vara något anpassas till svårighetsgraden av den förväntade motor underskottet genom att välja lämplig balk widths. Vattnet labyrint är den mest mångsidiga test av alla paradigm som nämns häri. Till exempel att välja olika intervall mellan slutet av förvärvsfasen och den rumsliga referensminnet sond rättegång kan enkelt testa kortsiktiga och långtidsminnet. Arbetsminne och strategi växling, två komponenter i exekutiva funktioner, kan också testas med hjälp av vattenlabyrinten installationen. För bedömning av arbetsminnet, kan inter-rättegången intervall reduceras till mindre än 1 minut under förvärvs inlärning av en ny plattform plats. Dessutom kan ha djur lära sig ett andra, nya placeringen av plattformen efter framgångsrika förvärvet av en initial plattform plats testa mental flexibilitet eller strategi skift. Med tanke på alla dessa potentiella ändringar, det finns en stor flexibilitet med dessa beteende uppgifter, vilket är en annan stor fördel utöver alla de ovan nämnda fördelarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cylinder | Western University | Plexiglas Cylinder Cylinder Diameter: 23 cm Cylinder Height: 40 cm Platform Height: 30 cm Mirror Length: 35 cm Mirror Width: 26.5 cm |
This was made specifically by Western University Machine Services for our lab. Please contact your own chosen manufacturer to design this product. |
| Handheld Video Camera | JVC | GZ-E200 | |
| Video Camera Tripod | Slik | F163 | |
| AM/FM Clock Radio | Sylvania | SCR1388 | |
| White Board | Walmart | Width: 71.12 cm Height: 55.88 cm |
These can be purchased at any store (i.e. Walmart, University bookstores) |
| Dry-erase Marker | Expo | Expo Dry-erase Original Marker | These can be purchased at any store (i.e. Walmart, University bookstores) |
| Wooden Beam | Rona | Plywood Width: 2 cm Length: 100 cm |
|
| VWR General Purpose Laboratory Tape | VWR Intl. | 89097-920 | |
| iMovie '11 | Apple Inc. | Version 9.0.9 (1795) | This is the version used in this manuscript, but any other iMovie version or video editing software could be used. |
| Morris Water Maze Pool with Platform | Stoelting Co. | 60136/60035 | These are not the exact products used in the video, but these are essentially identical. |
| Platform Cue | - | - | The platform cue used was created using a small metal stand and white spherical foam ball. These can likely be purchased at any store with home improvement materials (i.e. Walmart, Rona etc.) |
| Mainstays 71" Floor Lamp | Walmart | HW-F0377SLV | |
| ANY-Maze Behavioural Tracking Software | Stoelting Co. | 60000 | There are ANY-maze® bundles that include the camera with or without a computer and accessories. |
| Compact Video Camera | Logitech | V-U0023 | |
| Laptop | Hewlett-Packard | HP Pavilion dv6 Notebook PC | Laptop Specifics: AMD A6-3420M APU with Radeon HD Graphics 1.50 GHz, 6.00 GB RAM, 64-bit operating system. |
| Americana Non-toxic Acrylic Paint | DecoArt | DAO67-9 | This can be ordered on the DecoArt site or purchased in store at DecoArt retailers. |
| Poster Board | Walmart | PA-1961 |
References
- Auld, D., Kornecook, T., Bastianetto, S., Quirion, R. Alzheimer's disease and the basal forebrain cholinergic system: relations to β-amyloid peptides, cognition, and treatment strategies. Prog Neurobiol. 68 (3), 209245 (2002).
- Huang, Y., Mucke, L. Alzheimer Mechanisms and Therapeutic Strategies. Cell. 148 (6), (2012).
- Querfurth, H., LaFerla, F. Alzheimer's disease. New Engl J Med. 362 (4), 329-344 (2010).
- Karran, E., Mercken, M., Strooper, B. The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).
- Akiyama, H., et al. Inflammation and Alzheimer's disease. Neurobiol Aging. 21 (3), (2000).
- Butterfield, D., Drake, J., Pocernich, C., Castegna, A. Evidence of oxidative damage in Alzheimer's disease brain: central role for amyloid β-peptide. Trends Mol Med. 7 (12), 548554 (2001).
- Kalaria, R. The role of cerebral ischemia in Alzheimer's disease. Neurobiol Aging. 21 (2), 321-330 (2000).
- Selkoe, D. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev. 81 (2), 741-766 (2001).
- Snowdon, D. A., et al. Brain infarction and the clinical expression of alzheimer disease: The nun study. JAMA. 277 (10), 813 (1997).
- Clarke, J., et al. Overexpression of APP provides neuroprotection in the absence of functional benefit following middle cerebral artery occlusion in rats. Eur J Neurosci. 26 (7), 1845-1852 (2007).
- Whitehead, S., Hachinski, V., Cechetto, D. Interaction Between a Rat Model of Cerebral Ischemia and β-Amyloid Toxicity Inflammatory Responses. Stroke. 36 (1), 107-112 (2005).
- Agca, C., et al. Development of transgenic rats producing human β-amyloid precursor protein as a model for Alzheimer's disease: Transgene and endogenous APP genes are regulated tissue-specifically. BMC Neuroscience. 9 (1), 28 (2008).
- Bayona, N. A., Gelb, A. W., Jiang, Z., Wilson, J. X., Urquhart, B. L., Cechetto, D. F. Propofol neuroprotection in cerebral ischemia and its effects on low-molecular-weight antioxidants and skilled motor tasks. Anesthesiology. 100 (5), 1151-1159 (2004).
- Langdon, K., Clarke, J., Corbett, D. Long-term exposure to high fat diet is bad for your brain: exacerbation of focal ischemic brain injury. Neuroscience. 182, 82-87 (2011).
- Brownlow, M., et al. Partial rescue of memory deficits induced by calorie restriction in a mouse model of tau deposition. Behav Brain Res. 271, 7988 (2014).
- Halagappa, V., et al. Intermittent fasting and caloric restriction ameliorate age-related behavioral deficits in the triple-transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiol Dis. 26 (1), (2007).
- Maalouf, M., Rho, J., Mattson, M. The neuroprotective properties of calorie restriction, the ketogenic diet, and ketone bodies. Behav Brain Res. 59 (2), (2008).
- Tillerson, J. L., et al. Forced limb-use effects on the behavioral and neurochemical effects of 6-hydroxydopamine. Neuroscience. 21 (12), 4427-4435 (2001).
- Sierksma, A., et al. Improvement of spatial memory function in APPswe/PS1dE9 mice after chronic inhibition of phosphodiesterase type 4D. Neuropharmacology. 77, (2013).
- D'Hooge, R., De Deyn, P. P. Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Behav Brain Res. 36 (1), 60-90 (2001).
- Vorhees, C., Williams, M. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nat Protoc. 1 (2), 848-858 (2006).
